PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA 2

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PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 
PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
Microbiologia Geral
Profa. Ana Paula Alves - 2017
Unidades de Medida
 Uma grande vantagem do sistema métrico é que as unidades estão
relacionadas umas as outras por fatores de 10. Desse modo, 1 m
equivale a 10 decímetros (dm) ou 100 centímetros (cm) ou 1.000
milímetros (mm).
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INTRODUÇÃO
 Os micro-organismos e seus componentes estruturais
são medidos em unidades ainda menores, como os
micrômetros e os nanômetros.
 Um micrômetro (μm) é igual a 0,000001 m (10-6 m).
 micro = a unidade seguinte deve ser dividida por 1 milhão, ou
106
 Um nanômetro (nm) é igual a 0,000000001 m (10-9 m).
 Angstrom (A) era usado antigamente para representar
10-10 m, ou 0,1 nm.
Maioria dos organismos estudados
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INTRODUÇÃO
Anton van Leeuwenhoeck (1632 - 1723)
mercador holandês e cientista
Ao segurar seu microscópio próximo a fonte de luz, 
conseguiu observar organismos vivos que eram muito 
pequenos a serem visto a olho nu
A amostra foi colocada na extremidade de um ponto 
ajustável e visualizada do outro lado através de uma 
lente minúscula, quase esférica.
Maior ampliação possível com esse microscópio foi de 
300x
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Instrumentos de microscopia:
 van Leeuwenhoek (séc. XVII) – microscópio
simples que possuía uma lente e era similar a
uma lupa. Suas lentes chegavam num aumento
de 300 vezes – visualização de bactérias
 Robert Hooke – lentes múltiplas
 Jackson Lister – desenvolvimento de um
microscópio melhor (lentes polidas permitindo
uma melhor imagem). As melhorias desse
microscópio chegaram ao microscópio de hoje.
Louis Pasteur (1822 - 1895)
• Inexistência da geração 
espontânea
• Teoria microbiana das doenças
• Fermentação, decomposição de 
alimentos
• Pasteurização
• Descrição de bactérias associadas às doenças 
(Staphylococcus, Streptococcus)
• Vacina anti-rábica
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Robert Koch (1843 - 1910)
•Estudo do antraz - Postulados de Koch
•Técnicas para obtenção de culturas puras
•Placas de Petri
•Técnicas de coloração
•Estudos com Mycobacterium tuberculosis
•Descrição de Vibrio cholerae, Trypanosoma
•1905 - Prêmio Nobel de Medicina 
1. Microscopia óptica:
 Refere-se ao uso de qualquer tipo de
microscópio que use luz para observar
espécimes.
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 Microscópio 
ótico 
composto
 Principais partes 
1.1 Microscópio óptico composto (MO)
 Apresenta uma série de lentes e utiliza a luz visível
como fonte de iluminação.
 Amostras muito pequenas podem ser examinadas com
o MO, bem como parte de seus detalhes finos.
 Uma série de lentes finamente polidas forma uma
imagem claramente focada, que é muitas vezes maior
que a amostra em si.
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 Trajetória da luz
iluminador (fonte de luz)
 condensador (lentes que
dirigem os raios de luz através
da amostra)
lentes objetivas (mais
próximas da amostra).
A imagem da amostra é
novamente ampliada pela
lente ocular.
AMPLIAÇÃO
 Podemos calcular a ampliação total da amostra
multiplicando a potência de ampliação das lentes
objetivas pela da ocular. A maioria dos microscópios
usados em microbiologia possui várias lentes objetivas,
incluindo 10X (baixa potência), 40X (alta potência) e
100X (imersão em óleo). A maioria das oculares amplia
as amostras por um fator de 10. Assim, temos:
 Ampliação total para lentes de baixa potência: 10 x 10 =
100X
 400X para as de alta potência
 1.000X para a imersão em óleo.
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RESOLUÇÃO (potência de resolução) 
 é a capacidade das lentes de diferenciar detalhes finos e
estruturas.
 capacidade das lentes de diferenciar entre dois pontos
com uma distância específica entre os mesmos.
 Ex.: se um microscópio tem uma resolução de 0,4nm, pode
distinguir entre dois pontos se eles estiverem no mínimo a 0,4nm
de distância um do outro.
 Quanto mais curto o comprimento de onda luminosa usada no
microscópio, maior a resolução. A luz branca utilizada num
microscópio óptico composto tem um comprimento de onda
relativamente longo e não pode oferecer resolução a estruturas
menores que 0,2µm. Por este fator, a limitação da resolução
desse microscópio é de até 2.000X.
Para obter imagem clara e detalhada: as amostras devem ter um
alto contraste com seu meio.
Índice de refração
 Medida da capacidade de curvatura da luz do meio.
Esse índice pode ser alterado por meio da coloração.
 Para preservar a direção dos raios de luz na maior
ampliação, óleo de imersão é colocado entre a lâmina
de vidro e a lente objetiva de imersão. O óleo tem o
mesmo índice de refração que o vidro, assim, o óleo
torna-se parte da óptica do vidro do microscópio. Se não
houvesse o óleo, a objetiva teria de ser maior (na
pequena a resolução é melhor) para captar a luz. O óleo
melhora a potência de resolução das lentes, se não for
usado, a imagem torna-se borrada, com baixa
resolução.
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PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 
PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
 Maioria dos microrganismos – parece quase
incolor quando observada através de MO
padrão.
 Preparo para observação: coloração
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1. Preparando esfregaços para a coloração:
 Coloração: corar microrganismos com um
corante que enfatiza certas estruturas. Antes
de serem corados, eles precisam ser fixados
(aderidos) à lâmina do microscópio.
1. Preparando esfregaços para a coloração:
 Fixação: simultaneamente mata os
microrganismos e os fixa na lâmina. Também
preserva várias partes dos micróbios em seu
estado natural com apenas uma distorção
mínima.
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1. Preparando esfregaços para a coloração:
• Esfregaço: filme delgado de material contendo
microrganismos é espalhado na superfície da lâmina e
deixada secar ao ar. Também se pode passar o bico de
Bunsen várias vezes, com o lado do esfregaço para
cima ou recobrindo a lâmina com álcool metílico por
1 minuto. Em seguida, a coloração é aplicada e então
lavada com água; em seguida, seca-se a lâmina com
papel absorvente. Sem a fixação, a coloração poderia
lavar os micróbios da lâmina.
CORANTES
 Corantes: sais compostos de um íon positivo
e outro negativo, um dos quais é colorido
(cromóforo)
 Corantes básicos – íon positivo. Ex.: violeta
genciana, azul de metileno, verde malaquita e
safranina.
 Corantes ácidos – íon negativo. Ex.: eosina,
fucsina ácida e nigrosina.
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CORANTES
 Em pH 7, as bactérias são levemente
carregadas negativamente. Portanto, o corante
básico é atraído à célula bacteriana carregada
negativamente.
 Os corantes negativos se repelem na maioria
das bactérias e coram o fundo (coloração
negativa) – importante na observação da forma
geral da célula, tamanho e cápsula, pois a
célula torna-se bem visível contra um fundo
escuro contrastante.
Coloração Simples
 Solução aquosa ou alcoólica de um único
corante básico
 Objetivo: corar todo o microorganismo para
que as estruturas básicas fiquem visíveis
 A coloração é aplicada ao esfregaço fixado
por um certo período de tempo, e então
lavada; a lâmina é seca e examinada
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Coloração Simples
 Substância química adicionada à solução para
intensificar a coloração – mordente.
 Funções:
➢ aumentar a afinidade de uma coloração na amostra
biológica
➢ revestir uma estrutura (como um flagelo) para torna-la mais
espessa e mais fácil de ver após ser corada
 Corantes simples utilizados em laboratório: azul de
metileno, carbolfucsina, violeta genciana e safranina
Colorações diferenciais
 Reagem de modo distinto com tipos
diferentesde bactérias
 Usados para diferenciação
 Ex.: Coloração de Gram e Coloração álcool-
ácido resistente
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Coloração de Gram
 Desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista
dinamarquês Hans Christian Gram
 É um dos procedimentos de coloração mais úteis
 Classifica as bactérias em 2 grandes grupos:
1. Gram-positivas
2. Gram-negativas
Coloração de Gram
1. Um esfregaço fixado pelo calor é recoberto por um corante básico
púrpura (violeta de genciana). Impregna todas as células →
coloração primária
2. Após curto período, o corante púrpura é lavado e o esfregaço é
recoberto por iodo (mordente). Quando o iodo (lugol) é lavado,
ambas as bactérias gram-positivas e negativas aparecem em cor
violeta escuro ou púrpura
3. A seguir, a lâmina é lavada com álcool ou solução de álcool-
acetona → agente descolorante → remove o púrpura das células de
algumas espécies, mas não de outras
4. O álcool é lavado e a lâmina é então corada com safranina (corante
básico vermelho). O esfregaço é lavado novamente, seco com papel
e examinado microscopicamente.
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Coloração de Gram
 Bactérias que retém o corante púrpura após o
álcool: gram-positivas
 Bactérias que perdem a cor violeta escuro ou
púrpura após descoloração: gram-negativas
✓ Incolores após lavagem com álcool
✓ Corante safranina coram essas bactérias de rosa
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Coloração de Gram
Coloração de Gram
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Coloração álcool-ácido resistente
 Também chamada coloração de Ziehl
Neelsen
 Liga-se fortemente às bactérias que
possuem material céreo em suas paredes
celulares
 Identificação das bactérias do gênero
Mycobacterium (tuberculosis e leprae) E
linhagens patogênicas de Nocardia.
Coloração álcool-ácido resistente
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Coloração álcool-ácido resistente
- Mecanismo de coloração
1. Corante vermelho carbolfucsina é aplicado a um
esfregaço fixado
2. Lâmina aquecida levemente por vários minutos (calor
aumenta a penetração e retenção do corante)
3. Lâmina é resfriada e lavada com água
4. Esfregaço é tratado com álcool-ácido (descolorante)
– remove o corante vermelho das bactérias que não
são álcool-ácido resistente
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Coloração álcool-ácido resistente
- Mecanismo de coloração
5. Os microorganismos álcool-ácido resistentes retém
a cor vermelha (carbolfucsina é mais solúvel nos
lipídeos da parede celular que no álcool-ácido)
6. Bactérias que não são álcool-ácido resistentes (parede
celular não possui lipídeo) – carbolfucsina é removida
rapidamente durante a descoloração, deixando as
células incolores
7. Esfregaço → corado com um contra-corante azul de
metileno
8. Células não álcool-ácido resistentes → azul após a
aplicação do contra-corante
Coloração de Ziehl-Nielsen
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Bacilo Álcool Ácido Resistente 
(BAAR)
Colorações especiais
 Corantes especiais são usados para corar e
isolar partes específicas dos
microorganismos
 Ex.: endosporos e flagelos, revelar a
presença de cápsulas
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Coloração negativa para cápsulas
 Cápsula – revestimento gelatinoso
 Relacionada com a virulência do organismo
 Os materiais capsulares são de difícil
coloração, pois são solúveis em água e
seriam facilmente removidos em lavagem
rigorosa
Coloração negativa para cápsulas
- Técnica
1. Bactérias são misturadas numa suspensão
coloidal fina de partículas coradas (tinta nanquim
ou nigrosina) – fornece fundo escuro
2. Uso de corante simples (safranina) para corar as
bactérias
3. As cápsulas não aceitam a maioria dos corantes
biológicos (devido a sua estrutura química) e
aparecem como halos circundando cada célula
bacteriana corada
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Corante: Nigrosina
Coloração negativa para cápsulas
- Técnica
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Coloração para endosporos (esporos)
 Endosporo – estrutura especial resistente,
dormente, formada dentro de uma célula que
protege uma bactéria das condições
ambientais adversas
 Não podem ser corados pelos métodos
comuns (simples e Gram) – corantes não
penetram na parede do endosporo
Coloração para endosporos (esporos)
 (Técnica de Schaeffer-Fulton): 
 Utiliza-se verde malaquita para a
coloração primária.
A safranina utiliza-se como contracorante
para corar as porções da cápsula que não
os endósporos.
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Coloração para endosporos (esporos)
- Técnica de Schaeffer-Fulton
1. Verde malaquita (coloração primária) é
aplicado num esfregaço fixado com calor e
aquecido em vapor por cerca de 5 minutos
2. Calor – auxilia na penetração do corante na
parede do endosporo
3. Lavagem por 30 segundos com água:
remoção do verde
Coloração para endosporos (esporos)
- Técnica de Schaeffer-Fulton
4. Malaquita de todas as partes da célula
(exceto do endosporo)
5. Aplicação de safranina (contra-corante):
cora porções da célula que não os
endosporos
6. Endósporos aparecem verdes na
visualização ao microscópio
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Coloração dos flagelos
 Flagelos bacterianos: estruturas de
locomoção muito pequenas para serem
vistas com um MO sem coloração
 Procedimento tedioso e delicado de
coloração usa um mordente e o corante
carbolfucsina para aumentar o diâmetro dos
flagelos até que eles se tornem visíveis no
MO
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Corante: Carbolfucsina
Função: Aumentar diâmetro dos flagelos.
Coloração dos flagelos
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RESUMINDO...
REVISÃO
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Revisão 
1. O que são corantes catiônicos?
2. O que são corantes aniônicos?
3. Defina coloração simples e coloração diferencial. Explicar o
propósito da coloração simples.
4. Qual a finalidade da substância denominada mordente em uma
coloração?
5. Diferenciar um corante ácido de um corante básico.
6. Comparar e contrastar a coloração de Gram e a coloração
resistente a alcool-acido.
7. Explicar por que cada uma das seguintes coloraçõees e usada:
coloração da capsula, coloração do endosporo, coloração dos
flagelos.
8. Por que um corante negativo não cora uma célula? 3-7
9. Por que a fixação é necessária na maioria dos procedimentos de
coloração?