Aula prática de proteínas

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PROTEÍNAS NA URINA 
Método: Vermelho de Pirogalol
Material Biológico: Urina e líquor
Princípio:
As proteínas presente no material reagem com o Vermelho de Pirogalol e com Molibdato em meio ácido, formando um complexo colorido, que se quantifica por espectrofotometria.
Reativos:
Reativo cromogênico: vermelho de pirogalol 60 μmol/L, Molibdato sódico 40 μmol/L, succinato 50 μmol/L, pH 2,3, detergente. Conservar a 15-30ºC.
Padrão de Albumina (65 mg/dL): Conservar a 2-8ºC
Técnica:
Em tubos de ensaio marcados, Branco, Padrão e Amostra, pipetar:
	
	Branco
	Padrão
	Amostra
	Reativo Cromogênico
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	Água destilada
	50 μL
	---
	---
	Amostra de urina
	---
	---
	50 μL
	Padrão de albumina
	---
	50 μL
	---
Misturar e incubar por 5 minutos a 37ºC. Ler a absorbância em 600 nm, acertando o zero com o branco. A cor é estável por 30 minutos.
Cálculo:
Absorbância Amostra x conc. Padrão = mg/dL
Absorbância Padrão
mg/dL x volume de 24 hs
__________________
 100
Valores de referência: 
Urina: 24-141 mg/24 hs
LCR: 0,2-0,4 mg/dL
Observações:
Este método obedece a Lei de Lambert Beer até 4 g/L. Para valores maiores diluir a urina e repetir a determinação. Multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.
Utilizar a urina após centrifugação ou filtração.
 Patologia Clínica:
As proteinúrias podem ocorrer em estados fisiológicos ou patológicos. As que ocorrem em estados patológicos podem ser classificadas em:
Pré-renal: anemia severa (anóxia renal), insuficiência cardíaca (devido à anóxia e congestão), febre, acidentes vasculares. A proteinúria que ocorre neste tipo não é elevada (≈ 2 g/24 hs).
Renal: glomerulonefrites (≈ 5 g/24 hs), Síndrome nefrótica 10 a 20 g/24 hs) e Nefrose Amilóide (mais que 30 g/24 hs).
Pós-renal: neste tipo as proteinúrias são um pouco aumentadas 
e são devidas as lesões inflamatórias ou degenerativas do trato urinário, cálculo na pelve ou nos ureteres.
 
PROTEÍNAS TOTAIS
Método: Biureto
Material Biológico: Soro e líquidos (pleural, sinovial e ascítico)
Princípio:
As ligações peptídicas das proteínas reagem com íons cúpricos, em meio alcalino, formando um complexo de cor violeta, proporcional à concentração protéica presente na amostra.
Reativos:
Número 1 - Biureto - Conservar entre 2 e 8ºC. Contém: Hidróxido de Sódio 0,2 mol/L, Tartarato de Potássio e Sódio 32 mmol/L, Iodeto de Potássio 6 mmol/L, Sulfato de Cobre 12 mmol/L
Numero 2 - Padrão - Conservar entre 2 e 8ºC. Agitar antes de usar. Contém: Albumina 4g/dL, estabilizador e Azida Sódica 15,38 mmol/L.
Técnica:
Em tubos de ensaios marcados, Branco, Padrão e Amostra pipetar:
	
	Branco
	Padrão
	Amostra
	Amostra
	---
	---
	50 μL
	Padrão
	---
	50 μL
	---
	Água deionizada
	50 μL
	---
	---
	Reativo de Biureto
	2,5 mL
	2,5 mL
	2,5 mL
Misturar e esperar 10 minutos em banho maria a 37ºC. Ler em 545 nm, acertando o zero com o branco. A cor é estável por 30 minutos.
Cálculos:
Absorbância Amostra x conc. Padrão = g/dL
Absorbância Padrão
Valores de referência: 
Crianças e Adolescentes 
Prematuro 3,6 - 6,0 g/dL 
Recém-nascido 4,6 - 7,0 g/dL 
7 dias - 1 ano 4,4 - 7,6 g/dL 
1 - 2 anos 5,6 - 7,5 g/dL
 Acima de 3 anos 6,0 - 8,0 g/dL 
Adultos 6,0 - 8,0 g/ 
Observações:
Este método obedece a Lei de Lambert Beer até 10 g/dL. Para valores maiores diluir a amostra com NaCl 0,85% e repetir a determinação. Multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 4 a 8 g/dL.
Em soro lipêmico, ictérico ou hemolisado, utilizar Branco Amostra (BA).
Branco Amostra: Misturar 2,5 mL de NaCl 0,85% com 50 μL da amostra. Determinar a absorbância em 545 nm, acertando o zero com água destilada ou deionizada. Diminuir a absorbância do BA da absorbância da amostra e calcular a concentração.
Patologia Clínica:
Hiperproteinemia: Mieloma Múltiplo, macroglobulinemia, desidratação, alguns processos infecciosos.
Hipoproteinemia: hiperhidratação, desnutrição grave, insuficiência renal.
 
ALBUMINA 
Método: Verde de Bromocresol
Material Biológico: Soro 
Princípio:
A dosagem utiliza o que se chama “erro protéico dos indicadores”. Em presença da Albumina, o Verde de Bromocresol forma um complexo corado, que exibe um espectro de absorção diferente do corante no seu estado livre, permitindo, assim, a dosagem da Albumina.
Reativos:
Número 1 - Reagente de Cor - Conservar entre 2 e 8ºC. Contém: Verde de Bromocresol 0,1 mmol/L, Solução Tampão Citrato (pH 3,6) 20 mmol/L, preservativo e surfactante.
Número 2 - Padrão - Conservar entre 2 e 8ºC. Agitar antes de usar. Contém: Albumina 3,8 g/dL, Azida Sódica 15,38 mmol/L.
Técnica:
Em tubos de ensaios marcados, Branco, Padrão, Controle e Amostra pipetar:
	
	Branco
	Padrão
	Amostra
	Amostra
	---
	---
	10 μL
	Padrão
	---
	10 μL
	---
	Água deionizada
	10 μL
	---
	---
	Reativo de cor
	2,5 mL
	2,5 mL
	2,5 mL
Misturar e esperar 05 minutos em temperatura ambiente. Ler em 630 nm, acertando o zero com o branco. 
Cálculos:
Absorbância Amostra x conc. Padrão = g/dL
Absorbância Padrão
Valores de referência: 
Crianças e Adolescentes 1 - 30 dias 2,6 - 4,3 g/dL
 31 - 182 dias 2,8 - 4,6 g/dL 
183 - 365 dias 2,8 - 4,8 g/dL 
1 - 18 anos 2,9 - 4,7 g/dL 
Adultos 3,5 - 5,5 g/dL
Observações:
Este método obedece a Lei de Lambert Beer até 6,0 g/dL. Para valores maiores diluir a amostra com NaCl 0,85% e repetir a determinação. Multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 3,0 e 4,5 g/dL.
O produto é estável por 15 minutos.
O reativo é muito sensível a mudança de pH. Evitar a contaminação com ácido ou álcali.
Patologia Clínica:
Hiperalbuminemia: somente na desidratação.
Hipoalbuminemia: doenças hepáticas crônicas (cirrose), síndrome nefrótica, em casos de perda maciça de albumina, artrite reumatóide, baixa ingestão protéica e após hemorragia grave.