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Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural. Reação de síntese de regiões específicas de DNA em ciclos repetitivos. Reação em Cadeia da Polimerase - Obtenção de um grande número de cópias de DNA. - Síntese de regiões específicas do DNA. - Amplificação a partir de uma única cópia de DNA molde. Reação em Cadeia da Polimerase - Desnaturação: separação da dupla fita de DNA t = 95 oC - Anelamento: pareamento dos primers ao DNA molde t = Tm - 5 oC (50 a 70 oC) - Extensão: síntese do DNA pela DNA polimerase t = 72 oC Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase - Amplicon: Fragmento de DNA dupla fita definido pela extremidade 5` de cada um dos primers. 5` 5` 3` 3` Reação em Cadeia da Polimerase PCR Componentes da PCR DNA molde - [DNA molde] => 1 a 2 μg - [DNA molde] > 2 μg (falso anelamento) - [DNA molde] < 1 μg [amplificado] Componentes da PCR DNA polimerase termoestável (Taq polimerase) - adiciona dNTPs na porção 3’ OH do primer - tolerância t ≤ 95 oC (não inativada) - atividade t = 72 oC (temp. extensão) - atividade é proporcional a [Mg 2+] livre Componentes da PCR Taq polimerase - Não possui atividade de exonuclease no sentido 3’ 5’ para realizar a “leitura de revisão”. - Taq polimerase insere um erro a cada 300 pb. Componentes da PCR Íons magnésio - co-fator para atividade enzimática - forma complexo equimolecular com o dNTP - [Mg 2+] = 1,5 mM total (0,5 a 5,0 mM) - [Mg 2+] pouco ou nenhum produto - [Mg 2+] aumento da taxa de erro Componentes da PCR Desoxirribonucleosídeo trifosfato dNTP - [dATP] = [dCTP] = [dGTP] = [dTTP] = 0,05 mM - [dNTP] = (0,05 a 0,2 mM) - [dNTP] => [Mg 2+] pouco produto - [dNTP] => [Mg 2+] aumento da taxa de erro Componentes da PCR Primers ou iniciadores - anelar a uma única seqüência alvo - conteúdo GC de 35 a 65% (50%) [GC] => temp. anelamento - primers de 18 a 30 mer => fragmentos < 4 Kb - primers de 30 a 35 mer => fragmentos > 4 Kb Componentes da PCR Primers ou iniciadores - primers não podem ser complementares entre si - não há necessidade que os primers sejam completamente homólogos a molécula alvo - a seqüência da terminação 3` do primer é a mais importante para a amplificação Componentes da PCR Primers ou iniciadores - evitar a formação de estruturas secundárias hairpins - evitar a formação de dímeros de primers Condições da PCR Dímeros de primers: Condições da PCR Temperatura de fusão Tm Temperatura na qual 50% da sequência do primer encontra-se associada ao DNA - alvo. Condições da PCR Temperatura de fusão Tm - primers menores que 25 mer Tm = 2(A + T) + 4(G + C) - Tanelamento= Tm - 5 oC (50 a 70 oC) - Tm PA <=> Tm PB (≠ 6 oC) Condições da PCR Temperatura de fusão Tm - primers acima de 25 até 100 mer - [Na+] = 0,01 a 1,0M Tm = 81,5 + 16,6 [log10(Na+)] + 0,41(G + C) - 600 - Tanelamento= Tm - 5 oC - Tm PA <=> Tm PB (≠ 6 oC) Condições da PCR Ciclos Térmicos da PCR - Padrão de 25 a 35 ciclos para a Taq comum. - Maior número de ciclos maior a [primers] - O tempo de incubação de cada ciclo depende do termociclador utilizado e da espessura do microtubo. Condições da PCR Ciclos Térmicos da PCR Considerações com o aumento de ciclos: - [amplicon] => [primers] - Taq polimerase não é totalmente termoestável. - Tempo de incubação de cada ciclo. Condições da PCR Inibidores da PCR (inibidores da Taq polimerase) - grupamentos heme, bilirrubina e bile. - sais provenientes de fluidos biológicos. - proteinase, SDS, fenol, EDTA, tiocianato de guanidina. PCR Multiplex Várias regiões do DNA são amplificadas simultaneamente por pares de primers diferentes. - Tanelamento dos pares de primers semelhante - Tamanho de amplicons diferentes - Maior rapidez e economia Nested PCR O DNA molde utilizado é o produto proveniente de uma amplificação anterior. - região de amplificação de um par de primers é interna ao produto do outro - o amplicon do nested PCR é menor que o da primeira amplificação - aumento da especificidade e sensibilidade Nested PCR 1 2 3 4 1 5 RT - PCR A informação genética a ser amplificada é uma molécula de RNA. RNA cDNA Primers: - Primers aleatórios - Oligo – dT - Primers específicos transcriptase reversa primer amplificação RT - PCR Primers para transcriptase reversa: - Primers aleatórios: mistura de hexámeros de nucleotídeos (inespecíficos) - Oligo – dT: primer de timina anela com a cauda poli A de mRNA eucariótico. - Primers específicos: sequência complementar RNA alvo. RT - PCR Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Reação em Cadeia da Polimerase Slide Number 9 Reação em Cadeia da Polimerase Componentes da PCR Componentes da PCR Componentes da PCR Componentes da PCR Componentes da PCR Componentes da PCR Componentes da PCR Componentes da PCR Condições da PCR Condições da PCR Condições da PCR Condições da PCR Condições da PCR Condições da PCR Condições da PCR PCR Multiplex Nested PCR Nested PCR RT - PCR RT - PCR RT - PCR
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