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Reação em cadeia da polimerase - PCR

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Reação em Cadeia da Polimerase
Reação em Cadeia da Polimerase
Consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, 
usando os elementos básicos do processo 
de replicação natural.
Reação de síntese de regiões específicas 
de DNA em ciclos repetitivos.
Reação em Cadeia da Polimerase
- Obtenção de um grande número de cópias de 
DNA.
- Síntese de regiões específicas do DNA.
- Amplificação a partir de uma única cópia de 
DNA molde.
Reação em Cadeia da Polimerase
- Desnaturação: separação da dupla fita 
de DNA t = 95 oC
- Anelamento: pareamento dos primers ao 
DNA molde t = Tm - 5 oC (50 a 70 oC)
- Extensão: síntese do DNA pela DNA 
polimerase t = 72 oC
Reação em Cadeia da Polimerase
Reação em Cadeia da Polimerase
Reação em Cadeia da Polimerase
Reação em Cadeia da Polimerase
- Amplicon:
Fragmento de DNA dupla fita definido pela 
extremidade 5` de cada um dos primers.
5`
5`
3`
3`
Reação em Cadeia da Polimerase
PCR
Componentes da PCR
DNA molde
- [DNA molde] => 1 a 2 μg
- [DNA molde] > 2 μg (falso anelamento)
- [DNA molde] < 1 μg [amplificado]
Componentes da PCR
DNA polimerase termoestável (Taq polimerase)
- adiciona dNTPs na porção 3’ OH do primer
- tolerância t ≤ 95 oC (não inativada)
- atividade t = 72 oC (temp. extensão)
- atividade é proporcional a [Mg 2+] livre
Componentes da PCR
Taq polimerase
- Não possui atividade de exonuclease no
sentido 3’ 5’ para realizar a “leitura de revisão”.
- Taq polimerase insere um erro a cada 300 pb.
Componentes da PCR
Íons magnésio
- co-fator para atividade enzimática
- forma complexo equimolecular com o dNTP
- [Mg 2+] = 1,5 mM total (0,5 a 5,0 mM)
- [Mg 2+] pouco ou nenhum produto
- [Mg 2+] aumento da taxa de erro
Componentes da PCR
Desoxirribonucleosídeo trifosfato dNTP
- [dATP] = [dCTP] = [dGTP] = [dTTP] = 0,05 mM
- [dNTP] = (0,05 a 0,2 mM)
- [dNTP] => [Mg 2+] pouco produto
- [dNTP] => [Mg 2+] aumento da taxa de erro
Componentes da PCR
Primers ou iniciadores
- anelar a uma única seqüência alvo
- conteúdo GC de 35 a 65% (50%)
[GC] => temp. anelamento
- primers de 18 a 30 mer => fragmentos < 4 Kb
- primers de 30 a 35 mer => fragmentos > 4 Kb
Componentes da PCR
Primers ou iniciadores
- primers não podem ser complementares entre si
- não há necessidade que os primers sejam 
completamente homólogos a molécula alvo
- a seqüência da terminação 3` do primer é a 
mais importante para a amplificação
Componentes da PCR
Primers ou iniciadores
- evitar a formação de estruturas secundárias
hairpins
- evitar a formação de dímeros de primers
Condições da PCR
Dímeros de primers:
Condições da PCR
Temperatura de fusão Tm
Temperatura na qual 50% da sequência
do primer encontra-se associada ao DNA -
alvo.
Condições da PCR
Temperatura de fusão Tm
- primers menores que 25 mer
Tm = 2(A + T) + 4(G + C)
- Tanelamento= Tm - 5 oC (50 a 70 oC)
- Tm PA <=> Tm PB (≠ 6 oC)
Condições da PCR
Temperatura de fusão Tm
- primers acima de 25 até 100 mer 
- [Na+] = 0,01 a 1,0M
Tm = 81,5 + 16,6 [log10(Na+)] + 0,41(G + C) - 600
- Tanelamento= Tm - 5 oC
- Tm PA <=> Tm PB (≠ 6 oC)
Condições da PCR
Ciclos Térmicos da PCR
- Padrão de 25 a 35 ciclos para a Taq comum.
- Maior número de ciclos maior a [primers]
- O tempo de incubação de cada ciclo 
depende do termociclador utilizado e da 
espessura do microtubo.
Condições da PCR
Ciclos Térmicos da PCR
Considerações com o aumento de ciclos:
- [amplicon] => [primers] 
- Taq polimerase não é totalmente termoestável.
- Tempo de incubação de cada ciclo.
Condições da PCR
Inibidores da PCR
(inibidores da Taq polimerase)
- grupamentos heme, bilirrubina e bile. 
- sais provenientes de fluidos biológicos.
- proteinase, SDS, fenol, EDTA, tiocianato de 
guanidina.
PCR Multiplex
Várias regiões do DNA são amplificadas 
simultaneamente por pares de primers 
diferentes.
- Tanelamento dos pares de primers semelhante
- Tamanho de amplicons diferentes
- Maior rapidez e economia
Nested PCR
O DNA molde utilizado é o produto proveniente 
de uma amplificação anterior.
- região de amplificação de um par de primers é 
interna ao produto do outro
- o amplicon do nested PCR é menor que o da 
primeira amplificação
- aumento da especificidade e sensibilidade
Nested PCR
1
2
3
4
1
5
RT - PCR
A informação genética a ser amplificada é 
uma molécula de RNA.
RNA cDNA
Primers:
- Primers aleatórios
- Oligo – dT
- Primers específicos
transcriptase reversa
primer
amplificação
RT - PCR
Primers para transcriptase reversa:
- Primers aleatórios: mistura de hexámeros de 
nucleotídeos (inespecíficos)
- Oligo – dT: primer de timina anela com a 
cauda poli A de mRNA eucariótico.
- Primers específicos: sequência complementar 
RNA alvo.
RT - PCR
	Reação em Cadeia da Polimerase
	Reação em Cadeia da Polimerase
	Reação em Cadeia da Polimerase
	Reação em Cadeia da Polimerase
	Reação em Cadeia da Polimerase
	Reação em Cadeia da Polimerase
	Reação em Cadeia da Polimerase
	Reação em Cadeia da Polimerase
	Slide Number 9
	Reação em Cadeia da Polimerase
	Componentes da PCR
	Componentes da PCR
	Componentes da PCR
	Componentes da PCR
	Componentes da PCR
	Componentes da PCR
	Componentes da PCR
	Componentes da PCR
	Condições da PCR
	Condições da PCR
	Condições da PCR
	Condições da PCR
	Condições da PCR
	Condições da PCR
	Condições da PCR
	PCR Multiplex
	Nested PCR
	Nested PCR
	RT - PCR
	RT - PCR
	RT - PCR

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