SELEÇÃO MARCADORES

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23/01/2014 
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SELEÇÃO ASSISTIDA POR 
MARCADORES 
MOLECULARES 
Sabrina Luzia Gregio de Sousa - Zootecnista 
DSc Ciência Animal 
Genes: 
 
Os genes estão localizados ao longo dos 
cromossomos. Ou melhor: É um trecho de uma 
molécula filamentar em dupla hélice 
 
 
Os genes contém a informação genética que é 
responsável pela expressão de uma característica em 
particular. 
 
 
São as regiões funcionais ao longo da molécula de DNA 
PELA DEFINIÇÃO MOLECULAR: 
 
GENE seria toda sequência de ácidos nucléicos, 
geralmente DNA, necessária para a síntese de 
um polipeptídio funcional, ou mesmo de uma 
sequência de RNA. 
 
Ou seja, seriam todas as sequências requeridas 
para se fazer uma transcrição. 
Os cromossomos existem aos pares nas células somáticas. 
Cada gene ocupa um lugar definido no cromossomo. Esse 
lugar definido é denominado locus gênico. 
 
 
 
Locus Gênicos Genes Alelos 
Os genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos 
homólogos são denominados genes alelos. 
 
 
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Homozigotos e Heterozigotos 
 
exon 2 exon 1 
intron 2 
exon 3 
intron 1 5´ não 
transcrita 
(seqüências 
 promotoras) 
 
3` não 
transcrita 
Stop codon 
TRANSCRIÇÃO RNAm PERCURSOR 
SPLICING RNAm MADURO 
TRADUÇÃO A POLIPEPTÍDEOS 
Cauda poli-A 
Cauda poli-A 
TTTTCTTACTGT 
UUUUCUUACUGU 
DNA 
RNA 
CISTEÍNA TIROSINA SERINA FENILAMINA 
UUU UCU UAC UGU 
Citoplasma 
Núcleo 
UAA 
UAU 
Stop Codon 
 
Ou seja, 64 códons possíveis e 
existem apenas 20 aminoácidos 
resultantes? 
 
 
Este fato explica por que muitas vezes o 
aparecimento de mutações gênicas não 
são detectadas fenotipicamente. 
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A SEQUENCIA DE 
NUCLEOTÍDEOS DEFINE 
VALOR GENÉTICO? 
 
 Como avaliar a transferência de 
informações no Melhoramento? 
 
O que é melhoramento genético 
animal? 
 
Obtenção de melhoria na produção dos animais 
devido a alterações das frequências dos genes nos 
rebanhos. 
• Duas “etapas” 
– Alteração das frequências gênicas (seleção) 
– Sistemas de acasalamento 
 
Reprodutores valem o valor 
de seus gametas! 
 
Material genético dos 
progenitores 
 
REPLICAÇÃO 
Como selecionar? 
 • De acordo com o “olho” do proprietário? 
Observando o fenótipo dos animais (padrão 
racial, pelagem, tamanho, conformação)? 
• Pelo “Pedigree” 
• Pelo peso? 
• Outra forma? 
Que tal conhecermos mais, um 
pouco antes de decidir?!!!! 
 
Um modelo 
 • P = G + E + GE 
P = Fenótipo 
G = Genótipo 
E = Ambiente 
 • P = A + D + I + E + GE 
A = efeito aditivo dos genes 
D = efeito de dominância dos genes 
I = efeito da interação entre os genes (epistasia) 
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P = A + D + I + E + GE 
 O que é avaliação genética? 
• Procedimento de análise dos dados de produção dos 
animais, com uso de metodologia estatística adequada, 
para: 
– Separar os efeitos genéticos aditivos(A) dos demais 
efeitos (D+I+E) 
– Ordenar (rankear) os animais segundo o valor genético 
aditivo de cada um. 
P = A + D + I + E + GE 
Isso pode gerar a informações 
sobre Valor genético aditivo. 
Valor Genético Aditivo 
Informações sobre o valor médio 
dos gametas de um reprodutor. 
O que há de novo? 
 
• Novas metodologias de estimação de valores 
genéticos levam a aumento de acurácia da escolha 
de reprodutores e a progressivos ganhos genéticos. 
 
• A biologia molecular começa chegar ao campo, se 
concentrando na análise direta do DNA, com as 
descobertas de marcadores moleculares. 
 
O que é isso? 
 
Como funciona a genética 
no nível celular? 
 
O DNA 
 
• A molécula de DNA é uma hélice 
dupla helicoidal, em que o 
filamento externo é constituído 
por fósforo e açúcar e a parte 
mais interna pela ligação por 
pontes duplas de hidrogênio 
entre adenina e guanina e triplas 
entre citosina e timina. 
 
• Cada molécula de DNA contém 
milhares de genes 
 
 
• Os genes, sequência de bases nitrogenadas que se 
expressam através da síntese de peptídeos e proteínas. 
 
Esses peptídeos estão envolvidos nos processos 
bioquímicos que determinam a produção dos animais. 
 
• Ao longo da evolução, várias variantes dos genes, os 
chamados alelos, foram se formando, por mudanças da 
sequência de bases nitrogenadas (nucleotídeos) na molécula 
de DNA. 
Como os genes determinam 
as características? 
 
Isso explica porquê os organismos 
são diferentes uns dos outros. 
 
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Como funciona a identificação 
animal baseada na sequência de 
DNA? 
• Cada animal possui uma sequência única e exclusiva 
de DNA. 
 
• Nenhum outro animal vivo (ou morto) possui a mesma 
sequência (exceção: gêmeos uni vitelinos, clones). 
 
• O DNA contém a informação genética básica 
responsável pelo desenvolvimento de um organismo. 
 
• Cada bezerro recebe, em cada loco do DNA, um alelo 
do touro e um outro da vaca. 
 
 
 
A identificação é baseada na 
variabilidade das sequências de 
DNA. 
 
 
 
De que forma é feita a 
análise de DNA? 
As tecnologias de análise 
molecular da variabilidade do 
DNA permitem determinar 
pontos de referência nos 
cromossomos. 
 
 
Marcadores Moleculares 
 
E como isso tem relação com 
características quantitativas? 
1. QTL 
 
2. Poligênicas 
 
. 
Variações nas características 
e Produtividade 
Lócus da Característica Quantitativa (QTL) – 
Identificados como associações estatísticas entre 
dados relativos a uma região genômica e a 
variabilidade fenotípica. 
QTL 
Variações nas características 
e Produtividade 
QTL 
Variações nas características 
Seleção Assistida por Marcadores 
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• O desafio é encontrar marcadores moleculares ou 
genéticos que tenham associação com 
características produtivas, explicando uma parcela 
significativa da variação das características. 
 
 
O desafio 
 
MARCADORES 
MOLECULARES 
Para entendermos o princípio das 
técnicas moleculares é preciso 
entendermos como REPLICAR ou 
MULTIPLICAR um material 
genético. 
A fiel transmissão da informação 
hereditária depende da 
REPLICAÇÃO precisa do 
material genético. 
 
 
Como tentar multiplicar ou copiar 
sequências de interesse in vitro ? 
 
• O DNA, constituinte fundamental do cromossomo, é 
formado por bases nitrogenadas, 
 -Purinas, representadas pela adenina e guanina, 
 -Pirimidinas, representadas pela citosina e 
timina. 
 
•A molécula de DNA é uma hélice dupla helicoidal. 
 
•A função do DNA é de transportar a informação 
necessária para síntese de proteínas. 
Reação em cadeia da 
polimerase. 
 Um método in vitro rápido, sensível e 
versátil para amplificação seletiva de 
sequências definidas de DNA apartir de 
amostras complexas de ácidos nucléicos. 
 
 Gera quantidade de DNA suficiente para 
manipulação e análises subsequentes. 
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Reação em cadeia da 
polimerase 
Como funciona? 
 
 Requer a ligação de pequenas sequências de 
DNA (oligonucleotídeos iniciadores-”primers”) a 
sequências complementares que flamqueiam a 
região alvo a ser amplificada. 
 
 Requer a ação da enzima DNA polimerase para 
sintetizar novas cópias idênticas a região alvo. 
Tópicos 
1. DNA 
2. PCR 
– Alvos 
– Denaturação 
– Primers 
– Anelamento 
– CiclosDNA 
O DNA tem quatro bases nitrogenadas. 
 
 Duas são chamadas purinas 
– Adenina ( A ), Guanina ( G ) 
 
 Duas são pirimidinas 
– Citosina ( C ), Timina ( T ) 
DNA 
Essas quatro bases são ligadas 
em um padrão repetitivo por 
pontes de hidrogênio entre as 
bases nitrogenadas. 
 
DNA 
Uma purina sempre se liga a uma pirimidina 
para manter a estrutura do DNA. 
 
Adenina ( A ) se liga a timina ( T ), através de 
duas pontes de hidrogênio. 
 
Guanina ( G ) se liga a citosina ( C ), através 
de três pontes de hidrogênio. 
 
 
PCR 
PCR (Reação em Cadeia da 
Polimerase) é uma técnica que 
amplifica uma sequência específica 
de DNA, como objetivo de torná-la 
abundante e disponível para diversas 
técnicas de biologia molecular. 
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OS Alvos do PCR 
Os alvos a serem considerados no PCR são 
as regiões que flanqueiam a sequência 
específica de DNA a ser amplificada, a 
qual pode ser um gene inteiro ou somente 
uma região pequena. 
PCR 
O número de bases nos alvos pode variar. 
 
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA 
 
O . . . . Representa o meio da sequência de 
DNA, e não há problemas em não 
conhecê-la para poder amplificá-la. 
 
 
 
 
 
 
 
Reação em Cadeia da 
Polimerase 
Passos da Reação em 
Cadeia da Polimerase 
1 - Desnaturação da fita de 
DNA 92ºC 
2 - Anelamento dos primers 
54 a 60ºC 
3 - Extenção da fita 
72ºC 
Termociclador 
PCR Ciclos 
BIOLOGIA MOLECULAR 
 
 
 TÉCNICAS MOLECULARES 
APLICADAS 
ATCGAAT 
ATCGAAT 
ATCGACT 
ATCGATT 
Gene Gene da 
 CALPAST 
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TÉCNICAS MOLECULARES 
APLICADAS 
Principais Técnicas Aplicadas à Produção Animal: 
 
• RFLP - Enzimas Restrição – Genes Candidatos. 
 
• Microssatélites – Repetições aleatórias. 
 
• SNPs. 
 
• Microarray. 
 
TÉCNICAS MOLECULARES 
APLICADAS: 
 
 
CGGAGGTGCGCATACTGACCGCGGTATACTAG 
GCCTCCACGCGTATGACTGGCGCCATATGATC 
 
 
Gene da 
CALPAST 
Enzima de restrição X 
TÉCNICAS MOLECULARES 
APLICADAS: 
RFLP - Enzimas Restrição – Genes Candidatos 
 
CGTATACT 
GCATATGA 
CGACCGCGGTATACTAGTCCT 
GCTGGCGCCATATGATCAGGA 
CGGAG 
GCCTC 
A enzima de restrição X possui sítios 
de restrição que estarão localizados 
entre as seguintes bases nitrogenadas 
 
 
CT CG 
GA GC 
As endonucleases são capazes de romper 
as pontes de hirogênio que ligam as bases 
nitrogenadas em uma molécula de DNA. 
8 pares de base 21 pares de base 5 pares de base 
CGTATACT 
GCATATGA 
CGACCGCGGTATACTAGTCCT 
GCTGGCGCCATATGATCAGGA 
CGGAG 
GCCTC 
8 pares de base 21 pares de base 5 pares de base 
8 pares de base 26 pares de base 
CGACCGCGGTATACTAGTCCT 
GCTGGCGCCATATGATCAGGA 
CGTATACT 
GCATATGA 
AGGAG 
TCCTC 
ANIMAL A 
ANIMAL B • Sequências de 1 a 6 nucleotídeos 
 
• Repetidos em tandem 
 
• Distribuídos uniformemente no genoma 
 
• Regiões instáveis: taxas mutacionais altas 
 
•Marcadores altamente polimórficos, multialélicos 
 
 
TÉCNICAS MOLECULARES 
APLICADAS 
Marcadores Microssatélite 
CGACCGCGCGCTACTAGTCCT 
GCTGGCGCGCGATGATCAGGA 
CGGAG 
GCCTC 
CGTATACT 
GCATATGA 
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Algumas utilizações: 
 
 Testes de paternidade 
 
 Geração de mapas de ligação 
 
 Estudo de estruturas populacionais 
TÉCNICAS MOLECULARES 
APLICADAS 
Marcadores Microssatélite 
CGACCGCGCGCTACTAGTCCT 
GCTGGCGCGCGATGATCAGGA 
QTL 
Marcadores Moleculares e o 
Melhoramento Genético Animal 
ETAPAS: 
Genética molecular 
 
• Procura por 
marcadores 
 
 
• Detecção de QTL 
 
Genética Quantitativa 
 
• Correlação genética 
marcador x QTLs 
 
 
• Seleção Assistida por 
Marcadores 
Unicidade : cada indivíduo tem um perfil de DNA 
único com exceção de gêmeos univitelinos ou 
clones de uma planta ou microorganismo 
Variabilidade: apesar do fato de que a maior 
parte do genoma é muito conservada entre 
indivíduos, algumas regiões genômicas 
específicas são altamente variáveis permitindo 
uma discriminação altamente precisa, 
quantificável e reproduzível. 
Marcadores de DNA: 
Ferramenta poderosa 
Imutabilidade : o DNA de um indivíduo é o 
mesmo em todas as células e este é estável ao 
longo de sua vida. 
Estabilidade física : moléculas de DNA podem 
ser recuperadas, purificadas e analisadas de 
quase qualquer material biológico. 
Marcadores de DNA: 
Ferramenta poderosa 
Considerações sobre testes de DNA em geral 
(adaptado de Thallman M. 2004) 
 
• Benefícios potenciais: acurácia aumentada na seleção 
especialmente para características de mensuração cara, 
limitadas pelo sexo ou mensuradas post mortem. 
 
• Usar ou não?: é uma decisão comercial que deve ser 
tomada de acordo com a posição no mercado e os custos 
envolvidos. 
 
• Apenas uma ferramenta de marketing? Adoção de novas 
tecnologias também tem este componente no início, mas 
geralmente leva ao sucesso. 
 
Considerações sobre testes de DNA em geral 
(adaptado de Thallman M. 2004) 
 
• Quais animais testar? Reprodutores mais influentes; 
candidatos de maior valor potencial; animais 
provavelmente portadores de alelos favoráveis. 
 
• Como usar os resultados? Combinados com avaliações 
fenotípicas; DNA aumenta a contribuição da 
informação fenotípica mas não substitui fenótipo. 
 
• O que esperar da minha associação? Estabelecer 
procedimentos para aquisição direta de resultados; 
estabelecer políticas para evitar relatos seletivos de 
resultados; fomento a redes de pesquisa ; informação e 
educação de produtores. 
 
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ATENÇÃO!! 
• Testes de DNA para heranças multifatoriais 
ainda constituem um desafio. 
 
• Testes de DNA vão se tornar melhores e mais 
baratos com o tempo. 
 
• Testes de DNA não vão simplificar o 
melhoramento mas torná-lo mais rápido. 
 
• Deverá se tornar rotina no melhoramento 
bovino e possivelmente em sistemas de 
produção. 
 
Marcadores estudados no 
Melhoramento Genético Animal 
PCR-RFLP 
 
GADO DE LEITE 
 
• K-caseína – (Kemenes et al.,1999) 
• ß-lactoglobulina – (Bovenhuis et al.,1992) 
 
GADO DE CORTE 
 
• Calpastatina - (Suguisawa,2005) 
• Leptina - (Suguisawa,2005) 
• Tiroglobulina 
• HORMONIO DO CRESCIMENTO - (Unanian et al,2000) 
 
 
Marcadores estudados no 
Melhoramento Genético Animal 
MICROSSATÉLITE 
 
 
GADO DE CORTE (Cromossomo 04 e 14) 
 
• Microssatélite BM1500 – Cr04 - (Sousa, 2008) 
• Microssatélite CSSM66 – Cr14 - (Sousa, 2008) 
 
 
 
OBRIGADA 
sgregio@hotmail.com