Relatorio 03 Desnaturação e Precipitação de Proteínas

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Universidade Federal do ABC
Transformações Bioquímicas
RELATÓRIO 03
Desnaturação e Precipitação de Proteínas 
 
 
Caroline Delcole Borsolari
Diego Rodrigo Massa Monteiro
Henrique de Abreu Piccolo
Jucilaine dos Santos Pereira
 Lidia Furukawa
Profº Jiri Borecky
Santo André
2009
SUMÁRIO
PÁGINA
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 3
2 OBJETIVO .............................................................................................................. 5
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 6
3.1 Materiais ........................................................................................................... 6
3.2 Métodos ......................................................................................................... 6 
3.2.1 Extração do suco de abacaxi ......................................................................... 6 
3.2.2 Preparação da gelatina ................................................................................ 7 
3.2.3 Ensaio 1 ........................................................................................................ 7 
3.2.3 Ensaio 2 ......................................................................................................... 7 
4 RESULTADOS ........................................................................................................ 8
4.1 Tabelas e fotos dos resultados ............................................................................. 8
4.2 O efeito do suco de abacaxi no colágeno ............................................................. 12 
4.3 O efeito da temperatura sobre as enzimas do suco de abacaxi ............................. 13 
4.4 O efeito do etanol e do sulfato de amônio sobre as proteínas em solução ........... 13 
4.5 Dificuldades técnicas ............................................................................................ 14 
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 14
5.1 As proteoses do suco de abacaxi .......................................................................... 14
5.2 Purificação de proteínas ........................................................................................14 
5.3 A otimização da atividade das proteases .............................................................. 14 
5.4 O efeito da temperatura na desnaturação de proteínas no processo de cozimento
dos alimentos .............................................................................................................. 15 
5.5 A utilização do abacaxi para amaciar carne ..........................................................15
6 CONCLUSÃO.............................................................................................................15
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................16
1 INTRODUÇÃO
Proteases (ou enzimas proteolíticas) é um grupo de enzimas que catalisam a quebra das ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas.
A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB, 1984) sugeriram o uso do termo peptidase para um subconjunto de peptídeo-hidrolases (subclasse E.C 3.4). O termo protease é usado como sinônimo de peptidase. As peptidases compreendem dois grupos: endopeptidases (EC 3.4. 21-99) e exopeptidases (EC 3.4.11-19), de acordo com a posição da ligação peptídica a ser clivada na cadeia peptídica e a eliminação do aminoácido seqüencial do terminal N ou C. A Figura 1 mostra o esquema de nomenclatura das proteases. O termo proteinase também pode ser usado para endopeptidase [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006]. 
FIGURA 1: Esquema de nomenclatura moderna de proteases [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].
Endopeptidases 
Endopeptidases atuam preferencialmente nas regiões internas da cadeia polipeptídica, entre as regiões N e C terminal. A presença de grupos a-amino ou a- carboxila tem um efeito negativo na atividade da enzima. 
As endopeptidases podem ser subdivididas de acordo com o grupo reativo no sítio ativo envolvido com a catálise em serina- (EC 3.4.21), cisteína- (EC 3.4.22), aspártico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24). 
Exopeptidases 
As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região N ou C terminal. Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único resíduo de aminoácido (aminopeptidases), um dipeptídeo (dipeptidil-peptidases) ou um tripeptídeo (tripeptidil-peptidases). As exopeptidases que atuam na região carboxi terminal livre liberam um único aminoácido (carboxipeptidases) ou um dipeptídeo (peptidil-dipeptidases). Algumas exopeptidases são específicas para dipeptídeos (dipeptidases) ou removem resíduos terminais que são substituídos, ciclizados ou ligados por ligações isopeptídicas. Ligações isopeptídicas são ligações peptídicas diferentes daquelas entre uma a-carboxila e um a-amino grupo, e estes tipos de enzimas são denominados omega peptidases. 
Fontes
Proteases podem ser obtidas das plantas, animais e microorganismos. Proteases produzidas das plantas incluem a papaína, bromelina, queratinase e ficina. A papaina é extraída do mamão (Carica papaya). A bromelina é extraída do caule e frutos do abacaxi e a ficina é obtida do látex da figueira (Ficus glabrata). Essas três proteases têm especificidades similares, apesar de serem obtidas em diferentes fontes. Alguns grupos de plantas botânicas produzem queratinase, que pode degradar o cabelo. 
Alguns exemplos de proteases produzidas por animais são protaminase, tripsina, quimotripsina, pepsina e renina. A protaminase é isolada de pâncreas bovino, leões marinhos e porcos, enquanto a tripsina e a quimotripsina são sintetizadas no pâncreas e secretadas na forma de zimogênio (tripsinogênio e quimotripsinogênio, respectivamente). A pepsina pode ser obtida a partir de células da mucosa gástrica de porcos, e a renina, do estomago de carneiros [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006].
Aplicação das Proteases
Proteases têm grandes aplicações industriais, principalmente nas indústrias de comida, detergentes, medicina e biotecnologia. Muitas proteases bacterianas foram purificadas, classificadas e comercializadas. Na indústria alimentícia, por exemplo, a aplicação das proteases inclui a produção de queijos, solubilização de pasta de peixe e amaciamento de carnes. Além disso, as proteases também são muito utilizadas no tratamento do couro em substituição aos compostos tóxicos e poluentes até então utilizados. Pelos aspectos econômicos e tecnológicos, as proteases bacterianas são as enzimas industriais mais utilizadas, com grandes aplicações em várias indústrias, como detergente, couro, seda, pão, carnes e cervejarias. As proteases englobam 60% da venda internacional de enzimas, sendo a enzima de detergente a maior usuária de proteases [SALLEH, RAHMAN & BASRI, 2006]. 
As proteases também estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Estes fatos tornam as proteases um alvo quimioterápico valioso para o desenvolvimento de novos compostos farmacêuticos. As enzimas proteolíticas também participam no catabolismo de proteínas, tanto nas vias degradativas como nas biossintéticas, e na liberação de hormônios peptídeos farmaceuticamente ativos a partir de proteínas precursoras. Certas modificações específicas e seletivas de proteínasdurante a ativação de enzimas ocorrem via proteólise, que também colabora no transporte de proteínas secretórias na membrana. 
Na indústria farmacêutica, as proteases são usadas em pomadas cicatrizantes e têm um uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as proteínas em peptídeos e aminoácidos, facilitando a sua absorção pelas células; devido a seu papel despolimerizante, as enzimas extracelulares têm um papel importante na nutrição. 
2 OBJETIVO
	Mostrar a atividade proteolítica presente no suco de abacaxi, o efeito da desnaturação protéica por temperatura e o efeito da alteração de solubilidade protéica e conseqüente precipitação provocados pela adição de álcool ou sal de amônio em solução de gelatina (colágeno).
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais 
8 tubos de ensaio de 20 mL
1 tubo de ensaio de 30 mL
Pegador de tubo de ensaio
Estande para tubo de ensaio
Béquer de 100mL da Laborglás
Béquer de 400mL da Laborglás
Béquer de 20mL da Laborglás
Funil de vidro
Papel de filtro
Gelo
Almofariz e pistilo
2 pipetas graduadas de 5mL
Bastão de vidro
Pera
Balança
Estufa
H2O destilada
Solução de Sulfato de Amônio 3mol/L
Etanol
Abacaxi
Gelatina incolor sem sabor
3.2 Métodos
3.2.1 Parte 1 – Extração do suco de abacaxi
Macerou-se os pedaços de abacaxi com o auxílio do almofariz e do pistilo, até que uma boa quantidade de suco fosse produzida. O suco foi filtrado em funil de vidro com papel de filtro dentro de um tubo de ensaio de 20mL que se encontrava em um béquer com gelo para que fosse mantida as propriedades do suco de abacaxi. 
3.2.2 Parte 2 – Preparação da gelatina
Pesou-se 2g de gelatina incolor sem sabor e dissolveu em 20mL de água destilada em um béquer com a ajuda do bastão de vidro. Após total solubilização a gelatina derretida foi transferida para um tubo de 20mL e levada à estufa de banho maria à 60°C. A gelatina ficou na estufa até o momento da sua utilização.
3.2.3 Parte 3 – Ensaio 1
Com a pipeta colocou-se 2mL do suco de abacaxi obtido na parte 1 do experimento em três tubos de ensaio de 20mL. Colocou-se 2mL de água em um tubo de ensaio de 20mL. Um tubo com abacaxi e o de água foram mantidos à temperatura ambiente, os outros dois foram aquecidos, ao mesmo tempo, um à 60ºC e o outro à 100°C durante 5 minutos. Após esse tempo os dois tubos foram resfriados imediatamente no béquer com gelo. Retirou-se o tubo com a gelatina da estufa e adicionou-se 2mL em cada um dos quatro tubos. Armazenou-se os 4 tubos à 37°C por 10 minutos. Após o tempo resfriou-se as amostras no béquer com gelo por 15 minutos. As amostras foram observadas e os resultados anotados.
3.2.4 Parte 4 – Ensaio 2
Com a pipeta colocou-se 2mL de água, sulfato de amônio e etanol, um em cada tubo de ensaio. Adicionou-se 2mL de gelatina em cada um dos três tubos. As amostras foram observadas e os resultados anotados.
4 RESULTADOS 
4.1 – Tabelas e fotos dos resultados
Os resultados obtidos na Parte 1 podem ser observados na Tabela 1:
TABELA 1: A ação das proteases do abacaxi sobre o colágeno
	
	Branco
	Abacaxi
	Abacaxi 60º C
	Abacaxi fervido
	Água
	2 mL
	-
	-
	-
	Amostra
	-
	2 mL
	2 mL
	2 mL
	Gelatina
	2 mL
	2 mL
	2 mL
	2 mL
	Resultado
	Sólido e sem partículas.
	Líquido e sem partículas.
	Líquido e com pequenas partículas.
	Sólido e com muitas partículas.
	As respectivas fotos dos resultados da Tabela 1 estão nas Figuras 2, 3, 4 e 5:
FIGURA 2: Resultado Branco Parte 1
FIGURA 3: Resultado Abacaxi
FIGURA 4: Resultado Abacaxi 60ºC
FIGURA 5: Resultado Abacaxi Fervido
Os resultados obtidos na Parte 2 podem ser observados na Tabela 2:
TABELA 1: A ação do etanol e do sulfato de amônio sobre o colágeno
	
	Branco
	Ensaio 1
	Ensaio 2
	Água
	2 mL
	-
	
	Gelatina
	2 mL
	2 mL
	2 mL
	Sulfato de Amônio
	-
	2 mL
	-
	Etanol Absoluto
	-
	-
	2 mL
	Resultado
	Solubilizou, a solução adquiriu coloração amarelada.
	Solubilizou parcialmente, com formação de placas sólidas.
	Solubilizou parcialmente, com formação de precipitado gelatinoso.
As respectivas fotos dos resultados da Tabela 2 estão nas Figuras 6, 7 e 8:
FIGURA 6: Resultado Branco Parte 2
FIGURA 7: Resultado Ensaio 1
FIGURA 8: Resultado Ensaio 2
4.2 – O efeito do suco de abacaxi no colágeno
A desnaturação de proteínas acarreta perda de sua estrutura original (Figura 9). A proteína assume sua conformação nativa, ocorrendo alteração na conformação tridimensional das proteínas (estrutura secundária, terciária e quaternária) sem romper as ligações peptídicas (estrutura primária).
A proteína é dita desnaturada quando sua conformação nativa é destruída devido a quebra de ligações não-covalentes e o resultado é uma cadeia polipeptídica distendida. 
FIGURA 9: Desnaturação de Proteínas
Um dos agentes de desnaturação de proteínas é ação de ácidos ou base fortes.
 Quando adicionamos o suco de abacaxi ao colágeno ocorrem modificações no pH que resultam em alterações no estado iônico de cadeias laterais das proteínas, modificando as pontes de hidrogênio e as pontes salinas (associação de grupos iônicos de proteínas de carga oposta). Como afeta a ionização da proteína, conferem a molécula uma elevada carga positiva, ou negativa, ocasionando repulsão intramolecular, com exposição do núcleo hidrofóbico. 
4.3 – O efeito da temperatura sobre as enzimas do suco de abacaxi
Quando elevamos a temperatura do suco de abacaxi, as enzimas presentes no suco de abacaxi são também desnaturadas, e a capacidade de quebra do colágeno é corrompida. 
Como a estrutura tridimensional específica das proteínas é fundamental para o exercício de suas funções, alterações estruturais provocadas pela desnaturação ocasionam a perda parcial ou completa das suas funções. Com o aumento da temperatura, a velocidade de vibração molecular aumenta. Eventualmente, interações fracas como as pontes de hidrogênio são rompidas promovendo alterações na conformação das enzimas presentes no abacaxi.
4.4 – O efeito do etanol e do sulfato de amônio sobre as proteínas em solução 
A adição de solvente orgânicos solúveis em água, como o etanol, ao colágeno presente na gelatina diminuem a constante dielétrica do meio, interferem com as interações hidrofóbicas por sua interação com os grupos R não−polares e forma pontes de hidrogênio com a água e grupos protéicos polares. Os solventes não-polares também rompem interações hidrofóbicas.
A adição de sais, como o sulfato de amônio a grupos ionizáveis do colágeno, enfraquecem as interações entre grupos de cargas opostas da molécula protéica. As moléculas de água solvatam os grupos protéicos, havendo a formação de um precipitado gelatinoso. As moléculas de água competem pelo sal adicionado tornando a quantidade de solvente muito pequena e, com isso, promovendo a agregação de moléculas protéicas e a sua precipitação. Esse efeito é chamado salting out.
4.5 – Dificuldades técnicas
O suco de abacaxi poderia ter sido coado em antes de ser filtrado, para que os maiores pedaços fossem tirados primeiro e não interferissem na filtragem de caráter tão delicado.
	
5 DISCUSSÃO
5.1 – As proteases do suco de abacaxi
O abacaxi possui uma potente enzima, a bromelina, que leva esse nome pelo fato de o abacaxi pertencer à família das bromeliáceas. A bromelina foi detectada pela primeira vez em 1892 por Chittenden. Ela está presente em todas as partes do abacaxi, porém é no caule que se encontra maiores quantidades, por isso que se diz que a bromelina não é fornecida em grandes quantidades se apenas for degustado o abacaxi.
A enzima não está presente nos primeiros estágios de desenvolvimento do fruto, porém, seu nível aumenta rapidamente, mantendo-se elevado até o amadurecimento, onde tem um pequeno decréscimo. Essa é uma das vantagens da utilização das proteases do abacaxi em comparaçãocom outras proteases vegetais. Apesar da diminuição da atividade proteolítica durante a maturação, o abacaxi é o único fruto que possui concentrações relativamente altas de proteases no estado maduro.
5.2 – Purificação de proteínas
	A purificação da bromelina pode ser realizada através de um método conhecido por ALE (Adsorção em Leito Expandido). Esta é uma técnica cromatográfica para separação e purificação de produtos biológicos diretamente de seu extrato bruto, sem o uso de centrifugação, microfiltração e outros passos primários de clarificação. Esta técnica permite que o extrato bruto seja alimentado na coluna cromatográfica sem tratamento inicial, e enquanto o leito expande, a superfície de contato do adsorvente aumenta, fazendo que a interação com a molécula alvo seja mais efetiva. 
5.3 – A otimização da atividade das proteases
	A atividade das proteases pode ser otimizada com o aumento da temperatura e com a proximidade do pH neutro. Esta temperatura não pode ser muito elevada, senão irá ocorrer a desnaturação da protease.
	
5.4 – O efeito da temperatura na desnaturação de proteínas no processo de cozimento dos alimentos
A desnaturação de proteínas não tem grande influência na utilidade nutricional dos alimentos, mas tem grande efeito em outras propriedades como sabor, cor, estabilidade e solubilidade, ou seja, a desnaturação de proteínas pelo fornecimento de calor é útil, pois facilita a digestão dos alimentos. Por exemplo, quando cozinhamos um ovo, as proteínas desnaturadas tornam-se insolúveis e se solidificam, separando-se da água, o que torna-se melhor para o consumo. 
5.5 – A utilização do abacaxi para amaciar carne
Esta propriedade deve-se à bromelina, que é capaz de desdobrar proteínas em substâncias mais simples como proteoses e peptonas. Ela quebra as proteínas das fibras musculares e do tecido conjuntivo, que dá liga ao músculo e é um dos principais responsáveis pela eventual dureza da carne. A relação do suco de abacaxi e os amaciantes de carne comerciais são de que a bromelina pode ser utilizada na fórmula do amaciante. Os amaciantes comerciais juntam temperos, fazendo com que não fique gosto de abacaxi na carne. Um exemplo que temos, é um amaciante de carne da Nestlé, que utiliza a protease do mamão, a chamada papaína.
6 CONCLUSÃO
	Durante o experimento, verificamos que as proteases (enzimas catalíticas biológicas) atuam nas ligações peptídicas, neste caso, foram às ligações do colágeno e as quebram. A prova disso é que quando a protease envolvida (bromelina) foi desnaturada, portanto perdendo sua função, o colágeno reagiu naturalmente, ou seja, enrijeceu a solução, como mostrado nos experimentos. 
	Observamos também que uma das vias para o desnaturamento é o aumento da temperatura, pois a 100 °C a bromelina perdeu totalmente seu poder de reação com o colágeno. Isto pode ser visto com as fases presentes nos tubos de ensaio. Além da temperatura, têm-se também a solvatação que foi realizada na segunda parte do experimento e que demonstrou mesmo com a temperatura sendo ambiente como as forças nas ligações peptídicas podem modificar-se de acordo com o reagente colocado para atuar na proteína.
	 Dessa maneira, acrescentamos mais um grau de complexidade aos organismos vivos, pois para eles existirem, para que suas proteínas exerçam suas devidas funções e não saiam de controle, deve haver intrincados sistemas de controle de temperatura e de reações bioquímicas.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
- SALLEH, Abuh B., RAHMAN, Rajah A., BASRI, Mahiran: New Lipases and Proteases. 1ª Ed. Nova Science Publishers: New York, 2006, p. 23-34.
- URL 01: Proteases de Microorganismos. Disponível em: http://acd.ufrj.br/proteases/ProteaseApres.htm. Acesso em 08/11/2009.
- URL 02: Bromelina. Disponível em: http://www.todafruta.com.br/todafruta/mostra_conteudo.asp?conteudo=19499. Acesso em 08/11/2009.
-URL 03: Bromelina como amaciante natural de carnes. http://www.sbpcnet.org.br/livro/57ra/programas/senior/RESUMOS/resumo_1398.html. Acesso em 08/11/2009.
- URL 04: Abacaxi. http://supermundo.abril.com.br/busca/?qu=abacaxi. Acesso em 08/11/2009.
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