Enologia Redução da acidez volátil de vinhos por células de Saccharomyces cerevisiae imobilizadas em esferas de alginato quitosano

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38 outubro/novembro/dezembro 2012
enologia
A acidez volátil, expressa em g/L de ácido acético, pode conferir, acima de certos limites, um sabor ácido ou azedo e um aroma indesejável a vinagre, o que torna o vinho impróprio para consumo traduzindo-se em 
perdas económicas para o produtor. Neste contexto, a remoção 
de ácido acético de vinhos é uma questão importante para a in-
dústria enológica.
O ácido acético pode ser formado em qualquer momento da pro-
dução do vinho. Com efeito, pode ser produzido antes da fermen-
tação alcoólica por deterioração microbiana das uvas infectadas 
com Botrytis cinerea. Também pode ser formado pelas leveduras 
durante a fermentação alcoólica e mais tarde, pelas bactérias do 
ácido láctico durante a fermentação maloláctica. O teor elevado 
em ácido acético pode resultar da atividade metabólica das bac-
térias do ácido acético [1 e 2]. Em circunstâncias peculiares pode 
ocorrer produção de ácido acético mesmo após o engarrafamento 
do vinho. É o que se observa em vinhos tintos armazenados em 
garrafas colocadas na posição vertical em que persista uma popu-
lação de bactérias do ácido acético [3].
Têm sido propostos vários processos com o objetivo de diminuir 
a acidez volátil de vinhos azedos, nomeadamente (a) loteamento 
dos vinhos; (b) a osmose reversa (OR) e a nanofiltração [4] e (c) a 
remoção biológica de ácido acético através de refermentação [5 e 
6]. O primeiro processo pressupõe a estabilização microbiológica 
do vinho anteriormente à sua mistura com vinhos de baixo teor de 
ácido acético. No entanto, o vinho resultante tem um valor comer-
cial reduzido [7]. Alternativamente, o vinho azedo pode ser vendi-
do para fins de destilação para a obtenção de etanol. Esta solução 
está associada também a perdas económicas consideráveis. A OR 
e a nanofiltração são processos alternativos de desacidificação 
dos vinhos azedos mas requerem equipamentos sofisticados. En-
tretanto, foram desenvolvidos processos de biodesacidificação a 
fim de obter vinhos com um bom equilíbrio entre os teores de 
açúcar e de ácido, mas que se aplicam apenas à redução do teor 
em ácido málico [8 - 14]. Apesar de já terem sido obtidas em labo-
ratório estirpes geneticamente modificadas que diminuem subs-
tancialmente o ácido acético [15], devido à polémica na Europa 
sobre a sua utilização na produção de alimentos é pouco provável 
que, num futuro próximo, estas venham a ser utilizadas em vini-
ficação [16 e 17].
Em alternativa, a redução de concentrações anormalmente eleva-
das de ácido acético no vinho podem ser obtida por um processo 
de refermentação [5]. A remoção biológica de ácido acético por 
estirpes de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae é uma 
prática enológica que tem vindo a ser utilizada desde o trabalho 
pioneiro de Peynaud em 1938 [5]. Este processo empírico de desa-
cidificação biológica consiste na refermentação associada ao con-
sumo de ácido acético por leveduras e pode ser conseguido pela 
adição ao vinho azedo de mosto ou bagaço residual de um vinho 
acabado. Com o objectivo de desenvolver um processo controla-
do de remoção biológica da acidez volátil de vinhos baseado na 
utilização de estirpes de levedura selecionadas procedemos, num 
estudo anterior, à caracterização de diferentes leveduras vínicas 
indígenas e comerciais no que respeita à capacidade de degrada-
ção de ácido acético em condições de vinificação [18]. Verificá-
mos que algumas das estirpes de leveduras indígenas e comer-
ciais analizadas eram capazes de degradar o ácido acético durante 
a fermentação alcoólica [18] e que a desacidificação também podia 
Redução da acidez volátil de vinhos 
por células de Saccharomyces 
cerevisiae imobilizadas em esferas 
de alginato-quitosano
A ocorrência de vinhos com teores de acidez volátil excessiva é um problema grave e atual 
e as soluções enológicas disponíveis não são satisfatórias. A utilização de leveduras imobilizadas 
é uma alternativa promissora e eficiente para a correção da acidez volátil de vinhos e, 
consequentemente, para a melhoria da sua qualidade.
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ser realizada diretamente no vinho, sem adição de açúcares [19]. 
No entanto, a eficiência de degradação do ácido acético era re-
duzida em vinhos com teores de etanol superiores a 10% (v/v) e 
baixo pH [19].
A imobilização de células por aprisionamento em esferas tem re-
cebido crescente atenção nos últimos anos e resultado num gran-
de número de aplicações na biotecnologia, agricultura e até na 
medicina. Em comparação com as suspensões de células livres, 
esta técnica tem a vantagem de possibilitar a utilização contínua 
de células e de promover a proteção das células imobilizadas em 
relação às substâncias inibidoras do meio de fermentação. Como 
exemplo, podemos referir o trabalho realizado por Ciani em 1995 
[20] com células de Schizosaccharomyces pombe encapsuladas em 
esferas de alginato de cálcio utilizadas para diminuir a acidez fixa 
de vinhos através da degradação do ácido málico.
Uma técnica comum para o aprisionamento de microrganismos 
em esferas de 0,3-3,0 mm de diâmetro é a gelificação ionotrópica 
de macromoléculas com catiões multivalentes. A matriz porosa 
é sintetizada in situ em torno das células. A imobilização pode 
ser conseguida por mistura de uma suspensão de microrganis-
mos com um polímero aniónico, seguida de ligação cruzada com 
catiões multivalentes para formar uma estrutura que retém os mi-
crorganismos. A imobilização das células em Ca-alginato (algina-
to de cálcio) é um dos métodos mais simples, barato e frequente 
para o aprisionamento de diferentes tipos de células, incluindo 
as microbianas [21]. O problema mais comum que pode ocorrer 
durante a fermentação alcoólica utilizando células de levedura 
imobilizadas em esferas de alginato de cálcio é a libertação de 
células do interior da esfera para o meio de fermentação, devi-
do à desestabilização do gel. A ruptura das esferas pode ocorrer 
Figura 1 – Imagens de microscopia eletrónica de varrimento (MEV) de esferas e células de uma levedura comercial de S. cere-
visiae, imobilizadas em camada dupla (CD) de alginato-quitosano:
A) Esfera de camada dupla com alginato a 2% (p/v) e quitosano 1,5% (p/v), antes do processo de desacidificação (130X);
B) Esfera de camada dupla com alginato a 2% (p/v) e 1,0% de quitosano (p/v), antes do processo de desacidificação (2000X);
C) Esfera de camada dupla com alginato 2% (p/v) e 1,0% de quitosano (p/v), antes do processo de desacidificação (2000X);
D) Distribuição das leveduras no interior de uma esfera de camada dupla de alginato de 2% (p/v) e quitosano 1,0% (p/v) depois 
de 168 h de desacidificação a pH 3,12 (5000x);
E) Camada externa (quitosano a 1,0%, p/v) de uma esfera após 168 h de desacidificação, a pH 3,12 (4000X);
F) Camada externa (quitosano a 1,0%, p/v) de uma esfera após 168 h de desacidificação, a pH 3,50 (5000X).
A
D E F
B C
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devido ao crescimento celular, à formação e acumulação de CO2 
[22], à presença de agentes quelantes (lactato, citrato ou fosfato) 
e à presença de iões não gelificantes, nomeadamente Mg2+, Na+ 
ou K+, que substituem os iões de cálcio no gel de alginato [23]. O 
quitosano é um polímero natural com numerosas aplicações e tem 
a propriedade de forma um gel por gelificação ionotrópica como 
o alginato. Não é tóxico, é biocompatível, biodegradável, e possui 
propriedades antimicrobianas [24]. Esferas de camada dupla de 
alginato-quitosano têm sido utilizadas para a imobilização de cé-
lulas de levedura em fermentações alcoólicas [25]. A presença de 
uma camada de quitosano, exterior à camada de alginato, melhora 
a estabilidade química e mecânica das esferas durante a fermenta-
ção e impede a libertação de células para o meio [26].
Neste contexto resolvemos explorar a imobilização emesferas 
de alginato-quitosano de células da estirpe comercial de Saccha-
romyces cerevisiae que se revelou, nos ensaios anteriormente re-
feridos [18-19], entre as mais eficientes para a redução de ácido 
acético de vinhos azedos. Com o objetivo de uma melhor compre-
ensão do potencial das células imobilizadas para a desacidifica-
ção de vinhos, à escala industrial, avaliamos o efeito de diferentes 
parâmetros relevantes no processo de imobilização de células, 
tais como a concentração celular, o pH inicial, o número de ca-
madas e a composição da matriz de imobilização na eficiência do 
processo de desacidificação .
No presente estudo, utilizamos um vinho branco, com 12,5% 
(v/v) de etanol, 1,12 g/L de açúcar residual e uma acidez volátil de 
1,1 g/L em ácido acético. Testamos dois valores de pH inicial, pH 
3,50 (vinho A) ou 3,12 (vinho B) e duas concentrações celulares 
Tabela 2 – Parâmetros enológicos dos vinhos após desacidificação por células de uma levedura comercial de S. 
cerevisiae imobilizadas em esferas de camada simples (CS) de alginato ou camada dupla (CD) de alginato-quito-
sano. Os resultados são valores médios de experiências efetuadas em triplicado, após 168 h de desacidificação. 
Os resultados obtidos para as duas concentrações celulares iniciais e as duas condições de imobilização, com a 
mesma letra, não são significativamente diferentes (P≤0,05)
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CD A (1,1) 3,50 11,4±0,4 a, b 3,34±0,03 g 21,8±3,6 d 5,10±0,00 c 71,05±3,44 a 0,0±0,0 a 4,0x107 ± 6,0x105 a
CD B (1,1) 3,12 11,8±0,3 b 3,01±0,04 f 38,2±6,4 a, b 5,70±0,21 a 71,04±0,91 a 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b
CS B (1,1) 3,12 11,3±0,3 a, b 2,74±0,32 c 35,5±6,4 a 5,89±0,05 b 75,83±0,29 b 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b
8,0x107
CD B (1,1) 3,12 11,8±0,1 b 2,95±0,05 e 61,8±0,9 e 5,80±0,13 a, b 71,05±0,01 a 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b
CD C (1,3) 3,12 11,5±0,1 a, b 2,84±0,01 d 50,0±0,8 c 6,07±0,02 d 72,80±0,40 a 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b
CD D (1,5) 3,12 11,3±0,1 a, b 2,63±0,01 b 50,0±4,0 c 6,32±0,03 e 75,56±1,41 b 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b
CD E (1,7) 3,12 11,1±0,4 a 2,60±0,01 a 38,2±0,6 b 6,58±0,06 f 77,03±0,75 b 0,0±0,0 a 0,0±0,0 b
*Características químicas do vinho inicial: Densidade (20 °C) – 0,9910; SO2 livre – 4,8 mg/L; SO2 total – 70,5 mg/L; açúcares residuais – 1,12 g/L; 
acidez total – 5,55 g/L; Grau alcoólico – 12,5% (v/v) em etanol
Tabela 1 – Remoção de ácido acético (%) e número de células no meio (CFU/ml), após 48 ou 72 h de desacidifi-
cação com células de uma levedura comercial de S. cerevisiae imobilizadas em esferas de camada simples de 
alginato ou camada dupla de alginato-quitosano. Os ensaios, valores médios de experiências efetuadas em tri-
plicado, foram realizados em vinho branco (1,12 g/L de açúcar residual; 1,1 g/L de ácido acético e 12,5% (v/v) de 
etanol), em condições de aerobiose limitada, a 25 °C e pH 3,50 ou 3,12. Os resultados obtidos para os vinhos com 
a mesma letra não são significativamente diferentes (P≤0,05)
Esferas de camada simples 
Alginato, 2% (p/v)
Esferas de camada dupla 
Alginato, 2% (p/v) e quitosano, 1% (w/v)
Celulas/ml 4,0 x 107 4,0 x 107 8,0 x 107
Vinhos 48 h 72 h 48 h 72 h 48 h 72 h
Ácido acético %
(CFU/ml)
Vinho (A)
pH 3,50
23,5 ± 5,2 a, b 28,3 ± 3,2 c 17,9 ± 1,2 d 21,6 ± 2,3 a, d 25,7 ± 1,6 a, b, c 28,1 ± 3,2 c
3,3x106 b 2,0x107 c 4,4x103 * a 3,5x104 * a 5,6x103 * a 6,7x104 * a
Vinho (B)
pH 3,12
23,1 ± 5,7 a, b 24,9 ± 5,2 a, b, c 24,8 ± 9,7 a, b, c 27,3 ± 5,1 b, c 31,1 ± 3,4 d 42,9 ± 2,4 e
(0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a (0,0 ± 0,0) a
* Floculação celular
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(4,0 x 107 células/ml e 8,0 x 107 células/ml). A 
redução do pH conduziu a um aumento signi-
ficativo no consumo de ácido acético em 6,9% 
e 5,7% após 48 h e 72 h, respetivamente (Ta-
bela 1), quando foram utilizadas esferas com 
camada dupla de alginato-quitosano (2,0%, 
p/v e 1,0%, p/v, respetivamente) contendo 4,0 
x 107 células/ml. A pH 3,50 a libertação de cé-
lulas das esferas diminuiu significativamente 
com a utilização de esferas de camada dupla 
enquanto que, a pH 3,12, não se observou li-
bertação de células do interior das esferas, 
independentemente do número de camadas 
ou da concentração celular utilizada (Tabe-
la 1). A análise das células imobilizadas por 
microscopia eletrónica de varrimento (MEV) 
confirmou estes resultados, sugerindo que o 
valor de pH é crítico para a manutenção da 
integridade das esferas. Com efeito, o reves-
timento das esferas de alginato com quitosano 
(1,0%, p/v) conferiu uma maior integridade à 
camada externa das esferas após o processo de 
desacidificação (Figura 1-E). No entanto, para o vinho a pH 3,50 
(o pH desejável para vinhos brancos de mesa é de 3,0-3,3 [1]), a 
camada externa de quitosano não manteve a sua integridade ao 
longo do processo de desacidificação, provavelmente devido ao 
elevado crescimento celular que ocorreu no interior das esferas 
(Figura 1-F). Verificámos também que a utilização de uma con-
centração superior de quitosano (1,5%, p/v) não conferiu às esfe-
ras uma superfície integra, mesmo antes do início do processo de 
desacidificação (Figura 1-A).
O consumo mais elevado de ácido acético (42,9%), foi observado 
para o vinho B (pH 3,12, 12,5% (v/v) de etanol, 1,1 g/L de áci-
do acético), tratado com esferas de camada dupla contendo 8,0 x 
107 células/ml, após 72 horas de incubação (Tabela 1). O aumento 
da concentração de ácido acético (1,3; 1,5 e 1,7 g/L, vinhos C, D e 
E) traduziu-se numa redução do consumo de ácido nas condições 
descritas (Figura 2). Foi observada floculação celular a pH 3,50, 
quando foram utilizadas esferas de camada dupla (Tabela 1).
Após 168 h de desacidificação foram avaliados vários parâme-
tros enológicos para as diferentes condições testadas (Tabela 2). 
O prolongamento da desacidificação de 72 h (Tabela 1) para 168 h 
(Tabela 2) conduziu a um aumento na remoção de ácido acético de 
42,9% para 61,9% (a concentração final de ácido acético, ao fim 
de 168 h foi de 0,42 g/L, Figura 2) para o processo mais eficiente 
(vinho B, esferas de dupla camada com uma concentração celular 
de 8,0 x 107 células/ml). A diminuição do valor de pH inicial de 
3,50 para 3,12 levou a um aumento de 16,4% na remoção de ácido 
acético (vinhos A e B, Tabela 2). Além disso, para pH 3,12 a du-
plicação da concentração celular inicial levou a uma duplicação 
no consumo de ácido acético (de 35,5% para 61,8%, Tabela 2). 
No entanto, nestas estas condições, o aumento da concentração 
inicial de ácido acético (de 1,1 a 1,7 g/L) conduziu a uma redução 
no consumo do mesmo (Figura 2) e do pH final. Apesar de se 
observar este efeito negativo na eficiência de remoção do ácido 
acético foi ainda assim possível verificar uma redução da acidez 
volátil de um vinho azedo com 1,7 g/L de ácido acético (vinho 
E) para valores abaixo do limite legal (1,2 g/L). Estas alterações 
estiveram associadas a um aumento na acidez total e de SO2 total 
(Tabela 2) tendo em conta os valores iniciais no vinho de 5,55 g/L 
e 70,5 mg/L, respetivamente. Após 168 h de desacidificação ve-
rificámos um ligeiro decréscimo na concentração de etanol em 
todos os vinhos, independentementeda imobilização das células, 
do pH inicial, ou da concentração inicial de ácido acético. Esta di-
minuição foi tanto mais acentuada quanto mais elevada a concen-
tração inicial de ácido acético nos vinhos (Tabela 2 e Figura 2).
Até à data existem vários exemplos de aplicação de leveduras 
imobilizadas na produção de vinhos e, tanto quanto é do nosso 
conhecimento, não têm sido reportados efeitos negativos na qua-
lidade do vinho. No entanto, só a realização de ensaios à escala da 
adega, para avaliar o impacto da utilização de células imobiliza-
das de S. cerevisiae em camada dupla de alginato-quitosano nas 
Figura 2 – Concentração inicial de ácido acético (g/L) e após 48, 72 e 168 h de 
desacidificação de vinhos com células de uma levedura comercial de S. cere-
visiae imobilizadas em esferas de camada dupla de alginato-quitosano (8,0 x 
107 células/ml). Os ensaios foram realizados num vinho branco com concentra-
ções iniciais de ácido acético de 1,1; 1,3; 1,5 e 1,7 g/L (vinhos B, C, D e E, res-
pectivamente), a um pH inicial de 3,12 e uma concentração inicial de etanol de 
12,5% (v/v), em condições de aerobiose limitada, a 25 °C.
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características organolépticas do vinho desacidificado, permiti-
rá validar a sua aplicação como uma alternativa eficiente para a 
correção da acidez volátil de vinhos e, consequentemente, para a 
melhoria da sua qualidade. 
Alice Vilela(1), Dorit Schuller (2), 
Arlete Mendes-Faia(1) e Manuela Côrte-Real(2)
(1) Instituto de Biotecnologia e de Bioengenharia, 
Centro de Genómica e Biotecnologia, (IBB/CGB-UTAD), 
Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real
(2) Centro de Biologia Molecular e Ambiental, 
Departamento de Biologia, Universidade do Minho, Braga
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