antígeno anticorpo.2

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DISCIPLINA: 
Imunologia & 
Microbiologia
Profa. Me. Akemi Suzuki Cruzio
REAÇÕES ANTIGENO-ANTICORPO E TESTES SELECIONADOS
Natureza das reações antígeno-anticorpo
a) Conceito de Chave e Fechadura 
	- sítio de combinação de um ac  localizado na porção Fab 
	- é construído a partir de regiões hipervariáveis de cadeias pesadas e leves
	- estudos de cristalografia por raios X das interações antígeno-anticorpo mostram que o determinante antigênico se aninha em uma fenda formada pelo sítio de combinação do anticorpo 
REAÇÕES ANTIGENO-ANTICORPO E TESTES SELECIONADOS
Natureza das reações antígeno-anticorpo
b) Ligações não-covalentes 
	- ligações que unem o ag ao sítio de ligação do ac  todas não-										 covalentes 
			 pontes de hidrogênio, ligações eletrostáticas, 				forças de Van der Waals e hidrofóbicas. 
	- ligações múltiplas entre ag-ac garantem que o antígeno será ligado fortemente ao anticorpo
c) Reversibilidade
	- as reações antígeno-anticorpo ocorrem via ligações não-covalentes  são por natureza reversíveis
LIGAÇÕES NÃO-COVALENTES
Ligações eletrostáticas
	- atração entre grupamentos iônicos de carga opostas situadas nas duas cadeias laterais das proteínas:
	Ex.: 1 grupo amino ionizado (NH3+) numa lisina de 1 proteína e 1 	grupo carboxila ionizado (-COO-) de aspartato.
		 à medida que as cargas se aproximam mais, a força de 		atração aumenta consideravelmente
LIGAÇÕES NÃO-COVALENTES
Pontes de hidrogênio
	- distâncias menores  podem ser formadas pontes de hidrogênio 
	- ligação química caracterizada por uma ligação covalente entre o hidrogênio e uma ligação covalente com o oxigênio (O), nitrogênio (N) ou flúor (F), e uma interação do tipo dipolo-dipolo entre o átomo de hidrogênio e um átomo de oxigênio (O), nitrogênio (N) ou flúor (F). 
	ex.:
	- embora muito fracas  podem interferir por seu grande nº
	- pontes relativamente fracas e reversívieis 
	
LIGAÇÕES NÃO-COVALENTES
Forças de Van der Waals 
	- após maior aproximação das proteínas reagentes 				 ação das mais fracas das forças
	- caracterizadas por existirem entre moléculas eletricamente neutras 
Dividem-se em:
a) forças de van der Waals do tipo dipolo-dipolo					 responsáveis pela interação entre duas moléculas que possuem momento de dipolo elétrico permanente						 moléculas polares
LIGAÇÕES NÃO-COVALENTES
b) forças de van der Waals do tipo polarizabilidade-polarizabilidade		 responsáveis pela interação entre duas moléculas que apresentam momento de dipolo elétrico instantaneamente induzido			 moléculas polarizáveis
c) forças de van der Waals do tipo dipolo-polarizabilidade			 responsáveis pela interação entre uma molécula que apresenta momento de dipolo elétrico permanente e outra que apresenta momento de dipolo induzido
	
	- resultantes da interação entre as “núvens de elétrons” externas
LIGAÇÕES NÃO-COVALENTES
Forças hidrofóbicas
	- da mesma forma que as gotas de óleo na água se fundem para formar uma só gota de tamanho grande, os grupos hidrofóbicos não-polares tendem a associar-se em meio aquoso
	ex.: cadeias laterais da valina, leucina e fenilalanina
	- calculou-se que as forças hidrofóbicas podem contribuir com até 50% da força total da ligação Ag-Ac.
AFINIDADE E AVIDEZ
Afinidade
	- é a força da reação entre 1 único determinante antigênico e 1 único sítio de combinação no anticorpo
	- é a soma das forças de atração e repulsão que operam entre o determinante antigênico e o sítio de combinação do anticorpo
	- depende do grau de complementariedade entre as duas moléculas
	- a maioria dos anticorpos têm uma elevada afinidade por seus antígenos
	
AFINIDADE E AVIDEZ
Afinidade
	
	
	- Ac de baixa afinidade ligam-se de modo fraco e tendem a se dissociar com facilidade
	- Ac de alta afinidade estabelecem ligações fortes e mais duradouras.
 Avidez
 Avidez é uma medida da força total de ligação de um antígeno contendo muitos determinantes antigênicos e anticorpos multivalentes. A avidez é influenciada tanto pela valência do anticorpo como pela valência do antígeno. Avidez é mais que a soma de afinidades individuais. Isto é ilustrado na Figura 4.
 Repetindo, afinidade se refere à força de ligação entre um único determinante antigênico e um sítio de combinação de um anticorpo particular, enquanto que avidez se refere à força total de ligação entre antígenos e anticorpos.
AFINIDADE E AVIDEZ
Avidez
	- é uma medida da força total de ligação de um antígeno contendo muitos determinantes antigênicos e anticorpos multivalentes
	- é influenciada tanto pela valência do anticorpo como pela valência do antígeno
	- quanto maior a avidez, melhor seu efeito biológico final
	- a baixa afinidade de um Ac pode ser compensada por sua elevada avidez
ESPECIFICIDADE E REATIVIDADE CRUZADA
Especificidade
	- se refere à habilidade de um sítio de combinação de anticorpo em particular de reagir com apenas um antígeno
	- em geral, há um elevado grau de especificidade nas reações antígeno-anticorpo
Anticorpos podem distinguir diferenças em:
estrutura primária de um antígeno
formas isoméricas de um antígeno
estrutura secundária e terciária de um antígeno.
 Reatividade cruzada
 Reatividade cruzada se refere à habilidade de um sítio de combinação de anticorpo em particular de reagir com mais de um determinante antigênico ou a habilidade de uma população de moléculas de anticorpos de reagir com mais de um antígeno. A Figura 5 ilustra como reações cruzadas podem ocorrer. Reações cruzadas aparecem porque o antígeno envolvido na reação cruzada compartilha um mesmo epitopo com o antígeno imunizador ou porque ele tem um epitopo que é estruturalmente semelhante ao epitopo no antígeno imunizante (multi-especificidade).
ESPECIFICIDADE E REATIVIDADE CRUZADA
Reatividade cruzada
	- habilidade de um sítio de combinação de anticorpo em particular de reagir com mais de um determinante antigênico
ou
	- habilidade de uma população de moléculas de anticorpos de reagir com mais de um antígeno
Podem ocorrer:
a) o antígeno compartilha 1 mesmo epítopo com o antígeno imunizador 
b) o antígeno tem um epítopo estruturalmente semelhante ao do antígeno imunizante (multi-especificidade)
ESPECIFICIDADE E REATIVIDADE CRUZADA
Reatividade cruzada
Ex.:
A) Tipagem sanguínea: glicoproteínas das hemácias
Bactérias intestinais possuem substancias quimicamente semelhantes
	 possuem reatividade antigênica cruzada com A e/ou B
	 Acs dirigidos contra os antígenos A ou B, ou ambos, são detectados pela primeira vez em crianças com 3-6 meses e atingem um pico com 5-10 anos, declinando posteriormente com a idade e em alguns estados de imunodeficiência
ESPECIFICIDADE E REATIVIDADE CRUZADA
Reatividade cruzada
Ex.:
B) Vários vírus e bactérias possuem determinantes antigênicos idênticos ou similares a componentes normais da célula hospedeira
- Antígenos microbianos estimulam anticorpos que reagem de maneira cruzada com os componentes da célula hospedeira e resultam em uma reaçãoautoimune que lesiona o tecido 	
	• Streptococcus pyogenes – expressam proteínas na parede celular chamados de antígenos M
	 anticorpos produzidoscontra antígenos M reagem de forma cruzada com várias proteínas do miocárdio e do músculo esquelético			 lesões cardíacas e renais
FATORES QUE AFETAM A RELAÇÃO AG-AC
Afinidade: 
	- quanto maior a afinidade do ac pelo ag, mais estável será a interação
Avidez: 
	- reações entre antígenos multivalentes e anticorpos multivalentes são mais estáveis e portanto mais fáceis de detectar
Razão entre antígeno e anticorpo: 
	- influencia a detecção dos complexos ag-ac porque o tamanho dos complexos está relacionado com a concentração do antígeno e do anticorpo
FATORES QUE AFETAM A RELAÇÃO AG-AC
Forma física do Ag (solúvel ou particulado): 
	- se o antígeno é particulado  geralmente, se observa a aglutinação do antígeno pelo anticorpo
	- se o antígeno é solúvel
 geralmente, se pesquisa a precipitação de um antígeno após a produção de grandes complexos antígeno-anticorpo insolúveis
Concentração dos anticorpos  equilíbrio entre concentração de Ag e Ac)
pH do meio de reação
Temperatura de reação
Tempo de reação
FATORES QUE AFETAM A RELAÇÃO AG-AC
Forma física do Ag (solúvel ou particulado): 
	- se o antígeno é particulado  geralmente, se observa a aglutinação do antígeno pelo anticorpo
	- se o antígeno é solúvel  geralmente, se pesquisa a precipitação de um antígeno após a produção de grandes complexos antígeno-anticorpo insolúveis
Concentração dos anticorpos  equilíbrio entre concentração de Ag e Ac)
pH do meio de reação
Temperatura de reação
Tempo de reação
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Aglutinação/Hemaglutinação
Antígeno particulado
	- a reação de 1 anticorpo com o antígeno pode ser detectada pela aglutinação (agrupamento) do antígeno
Aglutinina 
	- termo geral usado para descrever acs que aglutinam antígenos particulados
Hemaglutinação
	- termo usado quando o antígeno é um eritrócito 
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Todos os anticorpos podem teoricamente aglutinar antígenos particulados mas IgM (elevada valência)  boa aglutinina 
	 pode-se inferir que um anticorpo deve ser da clase IgM se este 	for um bom anticorpo
Teste de aglutinação qualitativo
	- testes de aglutinação podem ser usados de maneira qualitativa para investigar a presença de um antígeno ou um anticorpo
	 o anticorpo é misturado com o antígeno particulado e um teste positivo é indicado pela aglutinação do antígeno particulado
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Ex.: células vermelhas do sangue de um paciente podem ser misturadas com um anticorpo dirigido a um antígeno de grupo sanguíneo para determinar o tipo sanguíneo da pessoa. 
Ex2.: soro de um paciente é misturado com células vermelhas do sangue de um tipo sanguíneo conhecido para pesquisar pela presença de anticorpos para aquele tipo sanguíneo no soro do paciente.
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Teste de aglutinação quantitativo
	- testes de aglutinação podem também ser usados para medir o nível de anticorpos para antígenos particulados
		٥ é realizada 1 diluição seriada de 1 amostra a ser testada 	para acs;
		٥ a seguir é adicionado 1 nº fixo de células vermelhas 	sanguíneas, bactérias ou outro antígeno particulado;
		٥ em seguida, é determinada a diluição máxima que ainda 	permite aglutinação visível  chamada de título;
	
		 resultados são descritos como a recíproca entra a 	diluição máxima que ainda permite aglutinação visível.
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Teste de aglutinação quantitativo
							teste quantitativo 
							de hemaglutinação
Efeito prozona 
	- ocasionalmente, é observado que quando a concentração do ac é elevada não há aglutinação, mas quando a amostra é posteriormente diluída ocorre a aglutinação (Paciente 6)
	- ausência de aglutinação no efeito prozona  excesso de acs 					 complexos muito pequenos que não se 					aglomeram para produzir aglutinação visível.
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
 Aplicações dos testes de aglutinação
	- determinação dos tipos sanguíneos 
			ou 
	- de anticorpos para antígenos de grupos sanguíneos
	- avaliar infecções bacterianas
ex.: O aumento em título de um anticorpo dirigido a uma bactéria em particular indica uma infecção por aquele tipo bacteriano. 
	- 1 quadruplo em aumento do título é geralmente considerado como um aumento significante de título de anticorpos. 
AGLUTINAÇÃO DIRETA
 1) Adicionar a amostra de sangue na placa teste:
 2) Adicionar o reagente (anticorpo anti A, B ou Rh):
 Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas. 
 COMO FAZER:
 3) Adicionar o controle negativo:
 4) Misturar:
5) Movimentar levemente a placa teste por dois minutos:
6) Fazer a leitura do resultado:
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível 
(aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima. 
negativo positivo
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Hemaglutinação passiva
	- os testes de aglutinação só funcionam com antígenos particulados
	- entretanto, é possível se cobrir eritrócitos com um ag solúvel
 (ex. antígeno viral, um polissacarídeo ou hapteno) 
e usar as céls vermelhas cobertas em um teste de aglutinação com acs para o ag solúvel  hemaglutinação passiva
	- o teste é realizado tal como o teste de aglutinação
٥ aplicações: detecção de anticorpos para			 antígenos solúveis e detecção de acs para 			 antígenos virais
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Teste de Coombs (Teste de Antiglobulina)
Teste de Cooms Direto
	- quando acs se ligam a eritrócitos, eles nem sempre resultam em aglutinação 	 pode se dever à relação ag/ac:
		٥ o antígeno em excesso prejudicam a eficiência da
		٥ o anticorpo em excesso ligação cruzada entra as 
		٥ cargas elétricas nas céls 	 céls 	vermelhas 
	- esses acs que ligam mas não causam aglutinação das células vermelhas sanguíneas são referidos como anticorpos incompletos 		 não significa que os acs sejam diferentes em sua estrutura
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Teste de Coombs (Teste de Antiglobulina)
Teste de Cooms Direto
	- para detectar a presença de acs não-aglutinadores nas céls vermelhas  adiciona-se um segundo ac diretamente contra o ac que cobre as céls vermelhas
	- esta anti-imunoglobulina pode agora fazer reação cruzada com as céls vermelhas e levar à aglutinação
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Teste de Coombs (Teste de Antiglobulina)
Teste de Cooms Indireto
	- realizado caso seja necessário saber se 1 amostra de soro tem acs dirigidos contra uma cél vermelha em particular e você quer se assegurar de que também vai detectar acs não-aglutinadores potenciais na amostra
	- é feito incubando as céls vermelhas com a amostra de soro, lavando-se para retirar quaisquer anticorpos não ligados e depois adicionando um segundo reagente anti-imunoglobulina para fazer ligação cruzada com as células
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Teste de Coombs (Teste de Antiglobulina)
Teste de Cooms Indireto
	- realizado caso seja necessário saber se 1 amostra de soro tem acs dirigidos contra uma cél vermelha em particular e você quer se assegurar de que também vai detectar acs não-aglutinadores potenciais na amostra
	- é feito incubando as céls vermelhas com a amostra de soro, lavando-se para retirar quaisquer anticorpos não ligados e depois adicionando um segundo reagente anti-imunoglobulina para fazer ligação cruzada com as células
Teste de Cooms Indireto
Aplicações
	- detecção de anticorpos (Rh) anti-fator rhesus
	 acs contra o fator Rh geralmente não aglutinam céls vermelhas
 	٥ portanto, céls verm. de crianças Rh+ nascidas de mães Rh- , que têm acs anti-Rh, devem estar cobertas por esses acs  Coombs direto
	٥ para verificar se a mãe têm anticorpos anti-Rh no seu soro 			 teste de Coombs Indireto  
	
 TESTES DE AGLUTINAÇÃO
Inibição de Hemaglutinação
	- o teste de aglutinação pode ser modificado para ser usado na medição de antígenos solúveis  inibição de hemaglutinação
	- é medida a habilidade de 1 ag solúvel de inibir a aglutinação por acs de céls vermelhas cobertas por ags
	- neste teste, 1 quantidade fixa de acs dirigidos ao ag em questão é misturada com uma quantidade fixa de céls vermelhas cobertas com o antígeno 
	- também estão incluídas na mistura diferentes quantidades da amostra a ser analisada para a presença do ag
Inibição de Hemaglutinação
	- se a amostra contém o ag  o ag solúvel irá competir com o ag que cobre as céls vermelhas pela ligação com os acs  inibindo aglutinação das céls vermelhas
	
	- pela diluição seriada da amostra você pode quantificar o antígeno na sua amostra desconhecida pelo seu título
	- é geralmente usado para quantificar antígenos solúveis
e é sujeito às mesmas considerações práticas do teste de aglutinação.
 TESTES DE PRECIPITAÇÃO
Imunodifusão Radial (Mancini)
	- o ac é incorporado no gel de ágar quando este for derramado e diluições diferentes do ag são aplicadas nos poços perfurados no ágar
	- à medida que o ag se difunde no gel ele reage com o ac 
	- quando o ponto de equivalência é atingido é formado um anel de precipitação
	- o diâmetro do anel é proporcional ao log da concentração do antígeno, uma vez que a quantidade de anticorpo é constante
		 ao correr diferentes concentrações de um antígeno 	padrão pode-se gerar uma curva padrão a partir da qual se pode 	quantificar a quantidade de um antígeno em uma amostra 	desconhecida  teste quantitativo
 TESTES DE PRECIPITAÇÃO
Imunodifusão Radial (Mancini)
	- se aparecerem no teste mais de um anel  ocorreram mais de uma reação ag/ac  pode ser devido à mistura de ag ou de ac
	- é comumente usado em laboratório clínico para a determinação dos níveis de imunoglobulina em amostras de pacientes
 TESTES DE PRECIPITAÇÃO
Imunoeletroforese
	- 1 mistura complexa de ags é aplicada em um poço perfurado em um gel de ágar 
	- os ags são submetidos à eletroforese  ags são separados de acordo com suas cargas
	- após a eletroforese, um sulco é feito no gel e os acs são adicionados
	- à medida que os acs se difundem no ágar são produzidas linhas de precipitina na zona de equivalência  quando ocorre uma reação ag/ac
	
 TESTES DE PRECIPITAÇÃO
Imunoeletroforese
	- é usado para a análise qualitativa de misturas complexas de antígenos, embora uma medida grosseira da quantidade (espessura da linha) pode ser obtida
	- é comumente usado para a análise de componentes no soro de um paciente  soro é colocado no poço e acs para soro total é 			 colocado no sulco								  através da comparação com o soro normal, é possível 		 determinar se há deficiências em um ou mais 				 componentes do soro ou se há uma super-abundância 		 de algum dos componentes do soro (espessura)
	- pode também ser usado para avaliar a pureza das proteínas de soro isoladas
 TESTES DE PRECIPITAÇÃO
Eletroforese contracorrente 
Neste teste o antígeno e o anticorpo são colocados em poços perfurados no gel de ágar e o antígeno e o anticorpo são submetidos à eletroforese um contra o outro, onde eles formam uma linha de precipitação como ilustrado na Figura 15. Este teste somente funciona se forem conseguidas as condições em que em que o antígeno e o anticorpo tenham cargas opostas. Este teste é primariamente qualitativo, embora a partir da espessura da banda você possa obter alguma medida da quantidade. Sua maior vantagem é a rapidez.
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)/ENSAIO ENZIMÁTICO DE IMUNOABSORÇÃO (ELISA)
Radioimunoensaios (RIA) 
	- ensaios baseados na medição da radioatividade associada com complexos imunes
	- em 1 teste particular, o marcador pode ser tanto o ag como  ac 
Ensaios Enzimáticos de Imunoabsorção (ELISA) 
	- ensaios baseados na medição de uma reação enzimática associada com complexos imunes
	- em 1 teste em particular, a enzima deve estar ligada ao ag ou ao ac
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)/ENSAIO ENZIMÁTICO DE IMUNOABSORÇÃO (ELISA)
 RIA/ELISA Competitivo para Detecção de Ac
	- o método e o princípio do RIA e ELISA para a medição de ag é marcado por:
	٥ uso de quantidades conhecidas de um ag padrão não marcado 		 pode-se gerar uma curva padrão							 relacionando a radioatividade da enzima ligada 				versus quantidade do ag
	٥ curva padrão  pode-se determinar a quantidade de um ag em 	uma amostra desconhecida
	- ponto crucial: 
	٥ separação dos complexos imunes do restante dos componentes
		 pode ser conseguido maneiras diferentes que servem como base para o nome atribuído ao ensaio:
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)/ENSAIO ENZIMÁTICO DE IMUNOABSORÇÃO (ELISA)
Precipitação por sulfato de amônia
	- Sulfato de amônia (concentração final 33 - 50%) irá precipitar imunoglobulinas mas não muitos ags
	- conhecida como técnica de Farr.
Anticorpo anti-imunoglobulina
	- a adição de um segundo ac dirigido contra o primeiro ac pode resultar na precipitação de complexos imunes 						 separação dos complexos e ags livres.
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)/ENSAIO ENZIMÁTICO DE IMUNOABSORÇÃO (ELISA)
Imobilização do Anticorpo
	- o ac pode ser imobilizado na superfície de uma pérola de plástico ou cobrindo a superfície de uma placa de plástico 				 os complexos imunes podem facilmente				 	ser separados dos outros componentes					pela simples lavagem das pérolas ou da					placa 
	- comumente usado hoje em dia e é referido 		como RIA ou ELISA de fase Sólida
	- RIA e ELISA competitivo são comumente 			 usados para quantificar proteínas séricas, hormônios 			 e metabólitos de drogas
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)/ENSAIO ENZIMÁTICO DE IMUNOABSORÇÃO (ELISA)
RIA/ELISA não-competitivo para Ag ou Ac
	- são também usados para a medição de antígenos e anticorpos
	- a pérola é coberta pelo ag e é usada para a detecção de ac na amostra desconhecida
	- a quantidade do segundo ac marcado ligado está relacionada com a quantidade de ac na amostra desconhecida
RADIOIMUNOENSAIO (RIA)/ENSAIO ENZIMÁTICO DE IMUNOABSORÇÃO (ELISA)
RIA/ELISA não-competitivo para Ag ou Ac
	- é comumente empregado para a medição de acs da classe IgE dirigidos contra um alergeno em particular, pelo uso de um ag e acs anti-IgE como reagente marcador 						 teste RAST (teste radio-alergo-								 absorvente)
	- a pérola está coberta com ac e é usada para medir um ag desconhecido
	- a quantidade do segundo ac marcado que liga é proporcional à quantidade do ag que se liga ao primeiro ac
TESTES PARA ANTÍGENOS ASSOCIADOS A CÉLULAS
Imunofluorescência
	- técnica pela qual um ac marcado com 1 molécula fluorescente 
(fluoresceína, rodamina ou 1 dos vários outros corantes fluorescentes) 
é usado para detectar a presença de 1 ag dentro ou sobre uma célula ou tecido  fluorescência emitida pelo ac ligado
Imunofluorescência Direta
	- o ac específico para o ag é diretamente 			 marcado com o fluorocromo
Testes para Antígenos Associados a Células
Imunofluorescência Indireta
	- o ac específico para o ag não é marcado e um segundo ac anti-imunoglobulina dirigido ao primeiro ac é marcado com o fluorocromo 	
	- é mais sensível do que a imunofluorescência direta 				 há amplificação do sinal
TESTES PARA ANTÍGENOS ASSOCIADOS A CÉLULAS
Citometria de Fluxo
	- comumente usada em laboratório clínico para identificar e enumerar céls contendo um ag particular
	- a céls em suspensão são marcadas com um marcador fluorescente pela imunofluorescência direta ou indireta
	- as céls são então analizadas no citômetro de fluxo
TESTES PARA ANTÍGENOS ASSOCIADOS A CÉLULAS
Citometria de Fluxo
	- princípio da citometria de fluxo:
 ٥ em 1 citômetro de fluxo as céls saem de uma 			 célula de fluxo e são iluminadas por um raio laser
 ٥ a quantidade de raios laser que é dispersa para 			 fora das céls durante a passagem das mesmas 			 pelo laser pode ser medida  proporciona informação a respeito do 					 tamanho das células
 ٥ o laser pode excitar o fluorocromo nas céls e a luz fluorescente emitida pode ser medida por um ou mais detectores
TESTES PARA ANTÍGENOS ASSOCIADOS A CÉLULAS
Dado obtido pela citometria de fluxo
	٥ histograma mono-paramétrico 
		- o aumento da fluorescência (ex. Fluorescência verde) é 	plotado no eixo dos x 
		- o nº de céls exibindo aquela qtd de fluorescência é 	plotado no eixo dos y
		- a fração de céls que são fluorescentes pode ser 	determinado pela integração da área sob a curva
TESTES PARA ANTÍGENOS ASSOCIADOS A CÉLULAS
Dado obtido pela citometria de fluxo
	٥ histograma bi-paramétrico
		- o eixo dos x é um parâmetro (ex. Fluorescência vermelha)
 
		- o eixo dos y é o segundo parâmetro (ex. Fluorescência 	verde)
		- o nº de céls é indicado pelo
contôrno e pela intensidade 	da cor
 FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO 
Complexos ag/ac podem também ser medidos por suas habilidades de fixar o complemento 									 porque um complexo ag/ac irá “consumir” o complemento se estiver presente								 enquanto que ags livres ou acs não irão
	- testes para complexos ag/ac que se baseiam no consumo do complemento são denominados testes de fixação de complemento			 usados para quantificar reações ag/ac
	- só irá funcionar com acs que fixam complementos 				 IgG e IgM são os melhores
 FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO 
Princípio do teste de fixação do complemento 
	- o ag é misturado com o soro teste para ser investigado para presença de acs  aguardar a formação de complexos ag/ac
	- 1 tubo controle no qual nenhum ag é adicionado também é preparado  se nenhum complexo ag/ac estiver presente no tubo  nenhum complemento será fixado
	- entretanto, se complexos ag/ac estiverem presentes  irão fixar o complemento  diminuir a quantidade de complemento no tubo
	- após se aguardar a fixação do complemento  adicionada qtd padrão de céls vermelhas, previamente cobertas com anticorpos anti-eritrócitos
 FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO 
Princípio do teste de fixação do complemento 
	- a qtd de céls vermelhas cobertas por ac é predeterminada para ser suficiente para usar todo o complemento inicialmente adicionado  se este ainda estiver lá									 todo o complemento ainda presente  todas as células vermelhas serão lisadas									 se complexos ag/ac são formados, algum complemento será consumido  nem todas as células vermelhas adicionadas irão lisar
	- pela medição da quantidade de lise de céls vermelhas pelos complexos ag/ac, pela medição da liberação de hemoglobina no meio  pode-se quantificar indiretamente os complexos ag/ac no tubo
 FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO 
Princípio do teste de fixação do complemento 
	- são mais comumente utilizados para pesquisa de acs em uma amostra teste  podem ser modificados para medição do ag