aula 2 akemi

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aec
DISCIPLINA: CITOGENÉTICA
ORGANIZAÇÃO MOLECULAR DA CROMATINA
Prof. Me. Akemi Suzuki Cruzio
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA CROMATINA
DNA – material genético
Cromossomos  genes – “informação genética”
Cromossomo, massa de DNA?
Fração protéica do cromossomo
	- proteínas básicas: histonas;
	- proteínas ácidas: não-histonas.
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ESTRUTURA DO DNA
DNA – dupla cadeia helicoidal
Cada cadeia  subunidades - nucleotídeos
						* púricas (A/G) e pirimídicas (C/T)
Cadeias  unidas por pontes de hidrogênio 
 * entre bases (A = T) ou (G ≡ C)
Pareamento específico, consequências
Quantidade de púricas = pirimídicas (A+G = T+C ou A+C = T+G)
Sequência de 1 cadeia é dedutível da oposta
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“CONSTRUÇÃO DO MODELO”/”PEÇAS DO QUEBRA-CABEÇA”
Conhecimento dos blocos estruturais
 do DNA
- 1 ácido fosfórico;
- 1 açúcar de 5 C;
1 das 4 bases nitrogenadas. 
 
 nucleotídeo
 
DNA: Estrutura
ESTRUTURA DO DNA
DNA  transcrição  RNA  tradução  proteínas
Informação genética do DNA  proteínas – código
1 aminoácido  1 trinca de nucleotídeos
1 segmento de DNA  várias trincas  1 proteína
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VARIAÇÃO NA QUANTIDADE DE DNA
Quantidade de DNA varia entre espécies
Variação casual ou a nível evolutivo?
Filo de baixa complexidade vs mais complexo
	- Conteúdo médio > mais complexo
Ex.: fungos < moluscos < mamíferos
Variação entre alguns, ausência de correlação
Ex.: gimnospermas e angiospermas/peixes e anfíbios
	- ang. valores extremos em arruda e liliácea  1 cerca de 670x mais DNA
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COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA CROMATINA
Codificação de informações genética de 1 organismos
	 quantidade mínima de DNA proporcional a sua complexidade
Seres vivos  possuem “excesso” de DNA	
	- centenas de vezes superior
	- difícil correlacionar quantidade de DNA e estágio evolutivo
Disparidade entre quantidade de genes estimada e de DNA
	- mais DNA que o necessário  genes
Ex.: humanos – DNA por núcleo espermático = 3,65pg  +/- 6 milhões de genes
	  cerca de 20 mil, 
								 necessário 1 a 5% do DNA
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SEQUÊNCIA DE BASE NO DNA
Como se explica esse excesso de DNA?
Por que a disparidade entre quantidade de informação genética e quantidade de DNA?
Não é possível ler a sequência inteira de 1 fio de DNA.
Técnicas para leitura – sequenciamento de bases
	 - segmentos pequenos de DNA
“quebra-cabeça”, aumento do nº de peças = aumento da dificuldade
Segmento pequeno  cortar em pedações menores  reunir as sequências
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SEQUÊNCIA DE BASE NO DNA
Organização descontínua dos genes  DNA espaçador
Tamanho do espaçador pode ser bem maior que o do gene
Pode variar entre indivíduos da mesma espécie
Fonte de variação na quantidade de DNA
	- não influencia o vol. de informação;
	- não influencia a complexidade do organismo.
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SEQUÊNCIA DE BASE NO DNA
Apenas parte do gene contém informação
	- íntrons e éxons
Éxons de 1 gene são +/- os mesmos em tamanho e sequência entre espécies
Íntrons variam entre espécies e dentro de 1 mesma espécie
Fonte de DNA “em excesso” – trechos repetidos no DNA 
Classes:
	- DNA altamente repetitivo – mais de 100.000x;
	- DNA moderadamente repetitivo – menos de 100.000x;
	- DNA de sequências únicas – não se repetem/poucas vezes
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Gene éxons
 íntrons
 remoção + união dos éxons = splicing
RECOMPOSIÇÃO DO RNA (SPLICING)
SEQUÊNCIA DE BASE NO DNA
3 classes sempre ocorrem
			- proporções variáveis 
DETERMINAÇÃO DA REPETITIVIDADE DO DNA
Grau de repetitividade
		 solução contendo DNA isolado
			 DNA fragmentado
				 DNA desnaturado
Desnaturação:
	- separação das cadeias  aquecimento
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DETERMINAÇÃO DA REPETITIVIDADE DO DNA
Renaturação:
	- reassociação das cadeias  redução da temperatura
		 velocidade de renaturação
			- concentração de cadeias complementares
				 constante de reassociação
Sequência de bases repetitivas  concentração relativa superior
		 fragmentos com essas sequencias reassociam mais rapidamente
DNA apenas com sequências únicas
	 cada segmento terá que encontrar seu complementar
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DETERMINAÇÃO DA REPETITIVIDADE DO DNA
DNA com 10.000 sequências repetidas
	 cada segmento terá 10.000 cadeias complementares
Constante de reassociação do DNA repetitivo ≠ DNA não-repetitivo
	- medir repetitividade por comparação
IDENTIFICAÇÃO DO DNA ALTAMENTE REPETITIVO
Pode ser facilmente isolado  apresenta mais pares AT ou GC
	- demonstrado por densidade de flotação
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IDENTIFICAÇÃO DO DNA ALTAMENTE REPETITIVO
Extração do DNA nuclear  fragmentação  centrifugação em CsCl
DNA de vírus ou bact.  1 única faixa de densidade
Eucariontes  2 faixas distintas
	- banda principal – quase todo DNA
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IDENTIFICAÇÃO DO DNA ALTAMENTE REPETITIVO
Eucariontes  2 faixas distintas
	- banda satélite – DNA altamente repetitivo
Separação
	- DNA satélite – maior proporção de AT ou GC
	- densidade de GC > AT  densidade do DNA satélite é diferente
DNA satélite não constitui 1 fração homogênea
	- técnicas refinadas  bandas satélites em densidades diferentes
	- bandas menores  6 a 20 nucleotídeos repetidos 1.000.000x ou +
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DISTRIBUIÇÃO E SIGNIFICADO DAS CLASSES DE DNA
Cromossomos eucarióticos
	 3 classes de DNA
DNA altamente repetitivo
	- em blocos;
	- sequências em tandem.
DNA moderadamente retetitivo/de sequências únicas
	- dispersos pelo cromossomo
Proporções variam entre espécies
	- DNA altamente rep.  menor proporção , 10%
		ex., exceção: Drosophila virilis  40%
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DISTRIBUIÇÃO E SIGNIFICADO DAS CLASSES DE DNA
Maioria dos genes  DNA sequências únicas 			 DNA
	- Genes codificadores de histonas e RNA ribossomais  moderadamente 
										repetitivo
genes repetidos em frequências muito baixas
	- classificados como sequências únicas;
	- evolução  modificações.
		ex.: 5 a 7 loci para hemoglobina
		 10 loci para isoenzimas
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RNA
Componente da cromatina
Humanos
	- 10% cromossomo metafásicos; 5% cromatina interfásica
Classificação:
	- RNA-m  tradução  proteínas  maior parte; 
	- RNA-t auxiliares
	- RNA-r tradução
Nucleo  vários tipos classificados pelo peso molecular
						 número de nucleotídeos
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RNA
Composição da cromatina  RNA de baixo peso molecular
					- extremamente diversificado
					- variam entre tecidos e espécies
					- se liga por complementação de bases
					- função: ativação gênica
RNA-t  64 tipos diferentes
RNA-m  DNA de sequências únicas
Exceção: hitonas  DNA moderadamente repet.
RNA-r e RNA-t  DNA moderadamente repet.
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HISTONAS
Grande número de aminoácidos
20 aminoácidos totais  lisina e arginina  básicos
Classificação: H1, H2a, H2b, H3 e H4
Quanto aos aminoácidos
	- ricas em lisina: H1, H2a e H2b;
	- ricas em arginina: H3 e H4.
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HISTONAS
Metabolicamente instáveis  4 ciclos celulares
Codificadas  DNA moderadamente repetitivo
	- 1 und de repetição  5 genes diferentes
	- organização descontínua
	ex.: ouriços  400 a 1.200 repetições
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HISTONAS
Particularidade
	- constância evolutiva
H3 e H4  comparação com organismos distanciados
	- praticamente não sofreram alterações
	- 2 dos 102 aa de H4 e 4 dos 135 de H3 ≠
Estabilidade evolutiva: H4 e H3 > H2a e H2b > H1
Quanto mais inalterada > importância	
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INTERAÇÃO HISTONAS X DNA
Cromatina interfásica: histonas proporcional DNA
Cromatina metafásica: histonas > DNA
Experimentos  remoção das histonas em núcleos interfásicos
			- núcleos maiores;
			- cromatina mais descondensada.
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INTERAÇÃO HISTONAS X DNA
Microscópio eletrônico  desenrolamento máximo do DNA
	- fio intercalado por contas
		- 1 conta = 2 moléculas de H2a, H2b, H3 e H4
			- octâmero envolvido 2x pelo DNA
				- H1  lateralmente ao octâmero
Ligação  grupo amina com grupo fosfato  nucleossomo VÍDEO
						 	 - menor unidade
Transcrição  nucleossomo desaparece
			- função reguladora  bloqueio do DNA
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PROTEÍNAS NÃO-HISTONAS
Demais proteínas
Não são semelhantes entre si
	ex.: proteínas contráteis;
	 ribossomais;
 enzimas (funções do núcleo);
 outros tipos.
1 tecido  500 tipos diferentes 
				 pequena quantidade
					 	 isolamento e identificação difícil
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PROTEÍNAS NÃO-HISTONAS
Tecidos diferentes  diferença na quantidade e qualidade
	- se relacionam diretamente com a função exercida pelo núcleo
Papel regulatório
	ex.: núcleos de fígado fetal  RNAm  hemoglobina
	 do cérebro  ausência deste RNAm
	
	- proteínas do fígado diferem das do cérebro
	
	- proteínas extraídas do fígado  cromatina do cérebro
						 	 RNAm  hemoglobina	
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PROTEÍNAS NÃO-HISTONICAS
Papel na organização dos cromossomos
Experimento:
Histonas removidas
Cromossomos metafásicos  água  capturados  microscópio eletrônico
Grande halo de DNA + centro  esqueleto protéico  forma do cromossomo
Halo  único fio de DNA  grande alças  30um ao longo
Esqueleto  não-histônicas de dezenas de tipos
Suporte para o fio parcialmente condensado
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EMPACOTAMENTO DO DNA
Humano 
cromossomo 1  156 mm
Cromossomos 21 e 22  31 mm
Metáfase  14 e 2,5 micrômetros
Empacotamento:
DNA + histonas = nucleossomos  DNA 20 Å  110 Å
Nucleossomos  esperial estreira  solenóide  110 Å  250 Å
Solenóide  dobra-se  cromômero
						- distendido  alças 
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