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Glicólise Bioquímica para Enfermagem Prof. Dr. Didier Salmon MSc. Daniel Lima Glicólise Oxidação da glicose a piruvato O que acontece com a glicose que ingerimos? 2 Via Glicolítica Citossol Glicólise (quebra da glicose) – via catabólica, transdução da energia presente na glicose em ATP e NADH 1 molécula de glicose é degradada em 10 reações enzimáticas a 2 moléculas de piruvato 10 Etapas catalisadas por enzimas livres no citossol 3 Pode ser dividida em fases hexoquinase fosfoglicose isomerase fosfofrutoquinase-1 triose fosfato isomerase G0’ = - 16,7 kJ/mol G0’ = + 23,8 kJ/mol G0’ = - 14,2 kJ/mol G0’ = + 1,7 kJ/mol aldolase G0’ = + 7,5 kJ/mol Investimento de energia A glicose é fosforilada duas vezes e clivada para gerar duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato. Fase Preparatória (Gasto de ATP) – investimento de energia 4 Pode ser dividida em fases gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase fosfoglicerato quinase fosfoglicerato mutase enolase piruvato quinase G0’ = + 4,4 kJ/mol G0’ = - 18,8 kJ/mol G0’ = + 6,3 kJ/mol G0’ = + 7,5 kJ/mol G0’ = - 31,4 kJ/mol Recuperação de energia As duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato são convertidas em 2 moléculas de piruvato com a produção de 4 ATPs, tendo um saldo líquido de 2 ATPs. Fase de pagamento: recuperação da energia investida com saldo positivo de 2 ATPs e 1 NADH 5 Delta G fisiológico diferente do delta G padrão 6 As Reações da Glicólise Hexoquinase 1ª Etapa: Dupla fosforilação as custas de 2 ATPs Hexoquinase - catalisa reação exergônica, irreversível nas condições celulares Fosforilação da Glicose no carbono 6 7 As Reações da Glicólise Fosfoglicose isomerase Isomerização de uma aldose em uma cetose (glicose em frutose) 8 As Reações da Glicólise Fosfofrutoquinase-1 (PFK1) As Reações da Glicólise Aldolase Nas concentrações pequenas de reagentes a reação é reversível 2ª Etapa: clivagem da hexose produzindo 2 trioses fosforiladas, que são interconvertíveis Reaction #4 is catalyzed by aldolase. It has a strongly positive Delta G zero prime. In the cell, however, the reaction is pulled by reactions ahead of it (which remove products) and pushed by reactions behind it (which increase amounts of reactants), making the Delta G favorable (negative). The products of this reaction are G3P and DHAP. 10 Reação da Aldolase (Classe I) Em aldolase de mamífero, os principais resíduos de aminoácidos envolvidos cataliticamente na reacção são a lisina e a tirosina. A tirosina actua como um aceitador eficiente de hidrogénio enquanto a lisina covalentemente liga-se e estabiliza os intermediários. Uma base de Schiff (ou azometina), nomeada após Hugo Schiff, é um grupo funcional que contém uma ligação dupla carbono-nitrogênio com o átomo de nitrogênio conectado a um grupo arila ou alquila mas não há hidrogênio 11 As Reações da Glicólise Interconversão de trioses (Triose Fosfato Isomerase) As Reações da Glicólise As Reações da Glicólise Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase 3ª etapa: oxidação e nova fosforilação das trioses fosfato (por Pi), formando 2 moléculas de 1 intermediário com 2 grupos fosfato Reaction #6 is catalyzed by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. It contains the only oxidation reaction of glycolysis. Electrons from G3P are donated to NAD+ to form NADH. Note that an additional phosphate group is added to G3P in this reaction to form 1,3BPG. The overall Delta G zero prime is slightly positive. The amount of NAD+ is critical for determining the direction of this reaction. 14 As Reações da Glicólise Oxidação do aldeído (gliceraldeído 3-fosfato) a ácido carboxílico, com redução de NAD. Reação termodinamicamente favorável. 2 R – CO – H + 2 NAD+ + 2 H2O → 2 R – CO – OH + 2 NADH + 2 H+ 2. Ligação do Ác. Carboxílico com Pi, formando anidrido carboxílico-fosfórico, que é endergônica. 2R – CO – OH + 2 HPO4-2 → 2 R – CO – O – PO3-2 + H2O As reações ocorrem acopladas por um intermediário rico em energia. Reação pode ser inibida pelo arseniato que compete com o fosfato A oxidação do carbono torna a entrada do Pi favorável ... 15 Oxidação pelo NAD+ fosforólise Inibição de GAP desidrogenase As Reações da Glicólise Fosfoglicerato quinase Formação de ATP por transferência de fosforila 4ª etapa: transferência dos grupos fosfato para ADP, formando 4 ATPs e 2 piruvatos. Fosforilação ao nível do substrato!! Acoplamento das reações GAPDH e PGK: GAP + Pi + NAD+ → 1,3-BPG + NADH DG 0’ = +6.3 kJ/mol 1,3-BPG + ADP → 3PG + ATP DG 0’ = -18.5 kJ/mol DG 0’ = -12.2 kJ/mol As Reações da Glicólise Fosfoglicerato mutase As Reações da Glicólise Enolase Reação de desidratação As Reações da Glicólise Piruvato quinase Duas partes: - ADP ataca a fosforila do PEP formando ATP e enolpiruvato - tautomerização do PEP a piruvato Acoplamento das reações: -61.9 kJ/mol (hidrólise de PEP) suficiente para impulsionar a síntese do ATP. A glicólise é uma via quase que universal, onde 1 molécula de glicose é oxidada a 2 moléculas de piruvato sendo a energia liberada conservada em 2 moléculas de ATP e 2 moléculas de NADH Todas as enzimas da via glicolítica são citoplasmáticas e seus intermediários são moléculas fosforiladas de 3 ou 6 átomos de carbono Na fase preparatória da glicólise, 2 moléculas de ATP são consumidas Na fase de pagamento da glicólise, há produção de 1 molécula de NADH e 2 moléculas ATP para cada triose. Resumindo... Equação geral da glicólise Glicose + 2ATP + 2NAD+ + 4ADP + 2Pi 2Piruvatos + 2ADP + 2NADH + H+ + 4ATP + H2O 2 2 Glicose + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi 2Piruvatos + 2NADH + H+ + 2ATP + H2O De onde vem a glicose circulante? Gliconeogênese Quebra do glicogênio, alimentação ou gliconeogênese 23 Digestão de Carboidratos Inicia-se na boca a-amilase salivar: rompimento das ligações a(1→4) Amilopectina e glicogênio possuem ligações a(1→6), e sendo assim, o produto da digestão da a-amilase contém uma mistura de moléculas de oligossacarídeos menores e ramificados. Como adquirimos os carboidratos da dieta? Digestão inicia-se na boca (digestão do amido -> amilase salivar) 24 Digestão de Carboidratos A digestão dos carboidratos cessa temporariamente no estômago, devido ao pH que inativa a a-amilase salivar O conteúdo gástrico é neutralizado pelo bicarbonato secretado pelo pâncreas, e a a-amilase pancreática continua o processo digestivo no intestino Digestão de Carboidratos A digestão final ocorre pela ação de enzimas da mucosa intestinal –dissacaridases e oligossacaridases Há a absorção de monossacarídeos pelas células da mucosa intestinal Estrutura e Papel dos Polissacarídeos Como os açúcares que ingerimos na alimentação entram na via glicolítica? Outros açucares além da glicose: frutose e galactose 28 Frutose A frutose livre presente em frutos ou formada pela hidrolise da sacarose é fosofrilada pela hexoquinase. Esta é a principal via pela qual a frutose entra na via glicolítica. Frutose + ATP → frutose-6-fosfato + ADP No fígado a frutose entra na via glicolítica através da frutoquinase que catalisa a fosforilação do C1 da frutose. Frutose + ATP → frutose-1-fosfato + ADP A frutose-1-fosfato é clivada em gliceraldeído e diidroxicetona-fosfato pela frutose 1-fosfato aldolase. A diidroxicetona-fosfato é convertida em gliceraldeído-3-fosfato e o gliceraldeído é fosforilado. Portanto os produtos frutose-1-fosfato entram na via glicolítca como gliceraldeído-3-fosfato. Frutose Frutose-1-fosfato Frutose-1-fosfato-aldolase gliceraldeído + diidroxicetona-fosfato gliceraldeído-3-fosfato Triose quinase Frutose-1-fosfato-aldolase VIA GLICOLÍTICA Entry of fructose to the glycolysis cycle may be problematic in some cases. Fructose can be converted to F6P by hexokinase. Fructose can also be converted to fructose-1-phosphate (F1P) by fructokinase. Conversion of F1P to glyceraldehyde and DHAP allows fructose to be metabolized by glycolysis without being controlled by PFK. Ingestion of a lot of fructose (via high fructose corn syrup in many foods) may be a factor in obesity. 30 Como os açúcares que ingerimos na alimentação entram na via glicolítica? Galactose Galactose é um monossacarídeo resultante da hidrolise da lactose (açúcar presente no leite e seus derivados) Galactoquinase Deficiency of galactose conversion enzymes results in accumulation of galactose (from breakdown of lactose). Excess galactose is converted to galactitol (a sugar alcohol). Galactitol in the human eye lens causes it to absorb water and this may be a factor in formation of cataracts. 32 Resumindo... Os destinos do Piruvato Condições anaeróbicas Condições anaeróbicas Condições aeróbicas 34 Um pouco de história... Louis Pasteur 1861: crescimento de leveduras, por grama de glicose, maior na presença do que na ausência de ar. “EFEITO PASTEUR”: Glicose consumida mais lentamente na presença de ar do que na ausência. Teoria vitalista (“força vital”) Eduard Buchner 1907 – Prêmio Nobel Derruba a Teoria vitalista – a fermentação ocorre sem vida organizada – Zimases Harden e Young 1909: isolamento do primeiro intermediário da via glicolítica 1929: Arthur Harden - Prêmio Nobel Descoberta de um procedimento para acelerar a fermentação: adição de Pi ao meio. Destinos do Piruvato em Anaerobiose Fermentação (Reoxidação do NADH) Alcoólica Lática Lactato é um “beco sem saída” O equilíbrio da reação é favorecido em direção a formação do lactato devido ao G negativo da reação. 37 Otto Meyerhof 1922: Prêmio Nobel Descoberta da correlação entre o consumo de oxigênio e o metabolismo do ácido lático nos músculos de coelho Ativador: obtido por autólise de levedura. O ativador perde a atividade se aquecido por 1 minuto a 50ºC e conserva-se bem em gelo. Você pode imaginar a natureza desse ativador? Para você é espantoso que se obtenha um ativador de músculo de coelho a partir de levedura? 38 Metabolismo do Etanol no Fígado Acetaldeído desidrogenase Ressaca Álcool desidrogenase O álcool desidrogenase está presente no nosso corpo porque necessitamos metabolizar o álcool produzido em pequenas quantidades pela digestão e quebra dos carboidratos e, em grandes quantidades pelas bactérias em nosso intestino. 39 Hipoglicemia pelo Etanol Sensibilidade Diferencial ao Etanol Consumo de álcool segundo diferentes padrões levou a uma evolução divergente. Existem várias enzimas ADH no homem: dímeros (5 genes). ADH são essenciais pois quebram e metabolizam as moléculas de álcool (tóxico) que é absorvida para o sangue. População do Sudeste Asiático: maior intolerância ao álcool – acúmulo de acetaldeído – rubor alcoólico (“Asian flush”) Sudeste asíatico: ~ 50 % pop. possui o alelo mutante ALDH2*2 (8% da atividade do gene wt) Alcoolismo (tolerância ao álcool) Populações europeias: alelos ADH2 e ADH3 menos ativas metabolizam lentamente o etanol Sensibilidade Diferencial ao Etanol Homens x Mulheres 42 Regulação da Glicólise Regulação da Glicólise 1. Número de enzimas (por controles transcricionais/traducionais; Ocorre em minutos ou até horas). 2. Mudança da atividade enzimática (ocorre em segundos) por: Modificação covalente ou ligação a proteína reguladora Regulação alostérica Seqüestro da enzima ou do substrato em compartimentos diferentes Fluxo de metabólitos de uma via metabólica pode ser modulado por: Regulação da via glicolítica 45 Via glicolítica Reações irreversíveis Hexoquinase Fosfofrutoquinase-1 Piruvato quinase DGº muito negativo G0’ = - 16,7 kJ/mol G0’ = - 14,2 kJ/mol G0’ = - 31,4 kJ/mol O fluxo da via glicolítica precisa se regulado em respostas às condições dentro e fora da célula. Duas demandas principais: Produção de ATP Fornecimento de blocos para biossíntese. 3 enzimas-chave: Hexoquinase Fosfofrutoquinase-1 Piruvato quinase 46 Hexoquinase Glicose + ATP Glicose-6-fosfato + ADP + H+ HK inibidor Hexoquinase Isoformas I, II e III – cinética michaelliana Km < 0,1 mM [plasmática] de glicose = 5 a 8 mM Ou seja, isoformas I, II e III funcionam sempre na Vmáx Glicoquinase Hexoquinase (músculo): I, II, e III Glicoquinase ou Hexoquinase IV – presente no fígado: menor afinidade pela glicose. Ligada a uma proteína reguladora forma um complexo inativo. Glicoquinase Não é inibida por glicose-6-fosfato Maior Km pela glicose: 10 mM Regulada pela [glicose]plasmática Regulação por sequestro no núcleo celular Estado Alimentado > 10 mM Hepatócito Glicose não é desperdiçada quando estiver abundante, síntese de glicogênio e ácidos graxos Glicoquinase Não é inibida por glicose-6-fosfato Maior Km pela glicose: 10 mM Regulada pela [glicose]plasmática Regulação por sequestro no núcleo celular Jejum < 10 mM Hepatócito Fígado não compete com demais órgãos pela glicose escassa. Prioridade cérebro e músculo Músculo? 51 Fosfofrutoquinase-1 (PFK-1) Fru 6-F → Fru 1,6-bF A partir desse ponto o açúcar está comprometido com a via glicolítica Reação altamente exergônica e irreversível DG0’ = - 14,2 kJ/mol Além do sítio ativo essa enzima possui diversos sítios onde inibidores e ativadores alostéricos se ligam. Before this enzyme's reaction, glucose-6-phosphate can potentially travel down the pentose phosphate pathway, or be converted to glucose-1-phosphate for glycogenesis. 52 Reguladores Alostéricos da PFK-1 Negativos: ATP (retroinibição) e Citrato (CK) Positivos: AMP (músc. Esq.) e frutose 2,6-bifosfato ATP – Alta de energia (diminuição glicolítica) ADP, AMP – Baixa de energia (aumento da via glicolítica) 53 Reguladores Alostéricos da PFK-1 Negativos: ATP (retroinibição) e Citrato (CK) Positivos: AMP (músc. Esq.) e frutose 2,6-bifosfato De maneira pouco comum, o ATP, que é um substrato da enzima, também é um modulador alostérico negativo. A ligação do AMP reverte parcialmente a inibição provocada pelo ATP 54 Reguladores Alostéricos da PFK-1 Negativos: ATP (retroinibição) e Citrato (CK) Positivos: AMP (músc. Esq.) e frutose 2,6-bifosfato Quando a glicose é abundante, há um excesso de frutose-6-fosfato, que passa a ser fosforilada também pela PFK2, gerando frutose-2,6-bifosfato. A f2,6p é um modulador alostérico da PFK-1, aumentando a atividade dessa enzima. 55 Frutose-2,6-Bifosfato O ativador mais potente da via glicolítica Enzima bifuncional (PFK2/F2,6BPase) Atividades 6-fosfofruto-2-quinase e frutose-2,6-bifosfatase Regulação Alostérica PFK2 Alta concentração de precursores biossintéticos Citrato O que quer dizer a animação? Um ano após a descoberta da PFK2, descobriu-se uma enzima que catalisava a reação reversa, defosforilando a frutose-2,6-bifosfato em frutose-6-fosfato. Por muito tempo tentou-se isolar a PFK-2 e a F2,6BPase, até descobrirem que elas eram uma única enzima 57 Regulação por Controle Covalente Piruvato quinase Último passo da via glicolítica Fosfoenolpiruvato + ADP → ATP + piruvato Tetrâmero apresentando diferentes isoformas L (fígado) e M (músculo) Regulação Alostérica Ativação anterógrada ATP / 59 Piruvato quinase Último passo da via glicolítica Fosfoenolpiruvato + ADP → ATP + piruvato Regulação por controle covalente Piruvato quinase Também é um tetrâmero apresentando diferentes isoformas em diferentes tecidos. Isoforma L (fígado) e isoforma M (músculo). Diferença: regulação por ligação covalente (fosforilação) Fígado deixa de fazer glicólise quando a [glicose] no sangue cai This protein kinase phosphorylates liver pyruvate kinase to deactivate it. Muscle pyruvate kinase is not inhibited by epinephrine activation of protein kinase A. Glucagon signals fasting (no glucose available). Thus, glycolysis is inhibited in the liver but unaffected in muscle when fasting. An increase in blood sugar leads to secretion of insulin, which activates phosphoprotein phosphatase I, leading to dephosphorylation and activation of pyruvate kinase. These controls prevent pyruvate kinase from being active at the same time as the enzymes that catalyze the reverse reaction (pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase), preventing a futile cycle 61 Regulação da via glicolítica Via antagônica à glicólise: Gliconeogênese Síntese de glicose a partir de compostos que não são carboidratos: aminoácidos, lactato e glicerol Três reações precisam ser contornadas para se fazer o caminho inverso à glicólise (gliconeogênese) Ênfase na etapa catalisada pela PFK-1. Assim como na PFK-2, existe uma enzima que catalisa a reação reversa: F1,6BPase. 64 Fosfofrutoquinase-1 e Frutose-1,6-Bifosfatase Que também é regulada por F2,6BP, regulação em conjunto com a PFK-1 Inibição de Ciclo fútil 65 Frutose-2,6-Bifosfato Regulação Glicólise x Gliconeogênese Aspectos clínicos 1) Isquemia (Infarto do miocárdio): Isquemia: Falta de suprimento sangüíneo para um tecido orgânico; Necrose do tecido por isquemia 69 Células tumorais Ascites convertem glicose equivalente a 30% do peso seco em lactato/h (Músculo esquelético humano = 6% do peso seco em lactato/h) Em muitos tumores, a taxa de entrada de glicose e a glicólise aumentam por um fator 10. 2) Células tumorais: Otto Warburg – 1920 Efeito Warburg – Células malignas (invasivas) tem a via glicolítica aumentada em torno de 200x Na tomografia de emissão de positrons podemos ver a captação de fluodeoxiglicose, mostrando localização de tumores com alta captação desse composto (Via glicolítica aumentada) Explicações para o efeito Warburg - The Warburg effect may simply be a consequence of damage to the mitochondria in cancer, or an adaptation to low-oxygen environments within tumors, or a result of cancer genes shutting down the mitochondria because they are involved in the cell's apoptosis program which would otherwise kill cancerous cells 70 Transformação de uma célula normal para tumoral: Mudança para um metabolismo glicolitico; Tolerância a baixo pH; Mais o tumor é agressivo maior é a sua taxa de fluxo glicolítico (superxpressão de enzimas glicolíticas e dos transportadores)
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