Biofísica das membranas

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Biofísica e Fisiologia dos Fenômenos Elétricos e Contráteis no Coração Normal e Patológico
Profa. Carla Vasconcelos
2016
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Conteúdo Programático
Estrutura da membrana celular
Transporte transmembrana
Potencial de repouso
Potencial de ação
Acoplamento excitação-contração
Contração muscular cardíaca
ECG e arritmias cardíaca
Seminários
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EVOLUÇÃO DOS MODELOS DE MEMBRANA
1- GORTER & GRENDEL (1925) - bicamada lipídica
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2- DANIELLI & DAVSON (1935) 
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3- STEIN & DANIELLI (1956) 
4- LUCY & GLAUERT (1964) 
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5- BENSON (1966) 
6- LENARD & SINGER (1966) 
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7- SINGER & NICOLSON (1972) - Mosaico Fluido 
Protein distribution in erythrocyte membranes from Singer
and Nicolson (1972). Specific proteins were labeled with antibodies.
The circles indicate protein clusters with a diameter of about 30 nm.
Reprinted with permission from AAAS.
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Microscopia Eletrônica
Espessura (5 – 10 nm)
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Fluid-Mosaic Model
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COMPOSIÇÃO DAS MEMBRANAS
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Tipos de lipídios
1-Fosfolípídios 
 Fosfatidilcolina
 Fosfatidilserina
 Fosfatidiletanolamina
 Fosfatidilinositol
 Esfingomielina 
 
2- Glicolipídeos 
 
3- Esteróides 
 Colesterol
Fosfolipídio
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ASSIMETRIA DA BICAMADA LIPÍDICA
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 Flip-flop
 Difusão lateral (D = 10-8 cm2/s) = 2 m–1 seg
 Rotação
 Flexão 
A BICAMADA LIPÍDICA É UM FLUIDO BIDIMENSIONAL
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Como é possível avaliar a fluidez de membrana?
Transição de fase – é a temperatura em que a membrana congela (líquido para semi-sólido).
Presença da dupla ligação cis
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Tamanho da cauda
Presença do colesterol
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Fig 10-13 Seis modos pelos quais as proteínas da membrana associam-se com a bicamada lipídica . (1) única -hélice- unipasso, (2) múltiplas -hélice-multipasso, (3) lipídeo covalentemente lidado à proteína, (4) ligado a um fosfatidilinositol, (5 e 6) ligação não-covalente com outras proteínas. 
PROTEÍNAS DE MEMBRANA
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Transporte transmembrana
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Permeability of the Cell Membrane-
Differentially Permeable
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Permeabilidade da membrana
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Facilitated Transport
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CLASSIFICAÇÃO DOS CARREADORES
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Simporte
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Carreador antiporte – Bomba Na+/K+
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UNIPORTE ATIVO - Bomba de Ca++ do retículo sarcoplasmático
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MECANISMO CATALÍTICO DA SERCA
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Regulação da SERCA
Fosfolamban 
(desfosforilado inibe a SERCA)
Fosfolamban 
(fosforilada não inibe a SERCA)
Sarcolipina
(desfosforilado inibe a SERCA)
Sarcolipina
(fosforilado não inibe a SERCA)
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(-) inibidor endógeno
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Table 1. Expressão diferencial da SERCA, Fosfolamban e sarcolipina em tecido muscular de roedores
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Trocador Na+/Ca++
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• ~950 aminoácidos (108 kDa)
• 9 a-hélices
• Superfície de membrana (TT & SL)
• 1 Ca2+ para fora/3 Na para dentro da célula
• Movido pelo potencial do Na
(Bomba Na/K-ATPase)
• Modo reverso durante a despolarização
	NCX
Na+/Ca2+ eXchanger
Philipson & Nicoll, Annual Review in Physiology 2000
XIP – domínio de ligação para calmodulina
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• ~1300 aminoácidos
• 10 a-hélices
• Superfície de membrana (SL & TT)
• 1 Ca/ATP hidrolizado
PMCA
Plasma Membrane Ca-ATPase
Carafoli, Journal of Biological Chemistry 2000
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Coelho, homem, gato, cão, cobaia, furão
Rato,
camundongo
Sistemas de remoção do cálcio intracelular
Bassani et al (1994)
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Representação Esquemática de uma Célula Ventricular Cardíaca 
(Bers, 2002 – Nature) 
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Fase de platô – influxo de cálcio
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Acoplamento excitação-contração
Ca++
Ca++
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Nas ULCs, canal de cálcio tipo-L e RyR (grupos)
 Músculo esquelético Músculo cardíaco
Grupo menor de RyR (até 50) - Grupo maior de RyR (50-200)
Maior organização espacial (tétrade) - Menor organização espacial (randômico)
Número maior de justaposição - Número menor de justaposição
Acoplamento conformacional - CICR 
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AEC no miócito ventricular
C
TANAKA et al., 2003
di-2-ANEPEQ
Fluo-3
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AEC no miócito atrial
TANAKA et al., 2003
di-2-ANEPEQ
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Família de canais liberadores de cálcio localizado na membrana do retículo sarcoplasmático (RS)
Unidades liberadoras de cálcio (ULC) – justaposição entre as membranas do RS e plasmática 
A – Tríade 
- 1 Túbulo T 
- 2 cisternas terminais do RS
B e C – Díade 
- 1 Membrana (B) ou Túbulo T (C) 
- 1 cisterna terminal do RS
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FKBP 12.6 – promover o acoplamento entre os RyR
 Condições normais
Insuficiência cardíaca
Dissociada
(Gomes; Guatimosim, 2012)
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Calsequestrina
Calsequestrina condensadas
Túbulo T
Retículo Sarcoplasmático
Tríade 
Wagenknecht et al,, 2002
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CANAIS IÔNICOS
Canais iônicos são seletivos
Canal de Na+:
 Diâmetro do poro
 Tamanho do íon
 Carga do canal
 Carga do íon
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ESTÍMULOS QUE ATIVAM OS CANAIS
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Canais para cálcio
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Figure 1. Signal transduction by voltage-gated Ca2+ channels. Ca2+ entering cells initiates numerous intracellular events, including contraction, secretion, synaptic transmission, enzyme regulation, protein phosphorylation/dephosphorylation, and gene transcription. (Inset) Subunit structure of voltage-gated Ca2+channels (Adapted from Takahashi et al. 1987).
Papel fisiológico dos canais para cálcio dependentes de voltagem
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Canal para cálcio
Figure 1. Subunit structure of voltage gated calcium channels (VGCC). The α1 is the pore-forming subunit which contains voltage-sensing machinery and the binding sites of channel blockers. α1 subunit contains 4 homologous domains (I–IV), each containing 6 transmembrane helices (S1–S6). The α2δ and β subunits enhance expression and modulate the voltage dependence and gating kinetics of VGCCs.
 - 6 -hélices mas não é transmembranar
 - glicoproteína 4 -hélices transmembranar
2 - glicoproteína extrínseca ligada por ponte dissulfeto a subunidade 
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Figure 1. Three-dimensional architecture of Ca2+ channels. Skeletal muscle CaV1.1 channel based on cryo-electronmicroscopy. The proposed model allows for a tight interaction between α1 and δ as well as α1 and γ.
2 – subunit extracellular is anchored via the disulfide-linked δ subunit within the α1 subunit. 
α1, γ, and δ subunits are embedded into the lipid membrane
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Canal para cálcio
Subunidade α1C formadora do poro
4 domínios homólogos (DI-DIV)
6 segmentos (S1-S6)
Conectados por loop intracelular
Os S1-S4 sensor de voltagem
Os S5-S6 formam o poro e filtro de seletividade
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 Ca2+ channel at rest when no Ca2+ influx occurs. At rest, in the absence of Ca2+, the CaM binds to peptide A, located between the EF hand and the IQ motif of the C terminus of the L-VDCC α1C subunit. 
(B). In response to a depolarizing stimulus, Ca2+ enters through the L-VDCC and binds to CaM. In the open Ca2+ channel state, the EF hand prevents structural conformation of the I–II loop required to block Ca2+entry through the channel pore . 
(C). Upon elevation of [Ca2+]i , the Ca2+/CaM complex undergoes the Ca2+-dependent conformational change that relieves the inhibition of EF hand, permitting the I–II loop to interact with the pore and accelerate the fast inactivation process .
(D) Involvement of CaM and CaMKII in the facilitation process. CaMKII enhances the ICa through phosphorylation of L-VDCC. We show murine whole-cell ICa generated from paired depolarizing pulses (–60 mV ± 10 mV at 0.5 Hz) representing Ca2+-dependent facilitation (graph).
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Figure 1. Evolutionary tree of voltage-gated Ca2+ channels. Tree is based on an alignment of the putative membrane-spanning regions and pore loops of the human channels. Alignment of the full-length sequences yields a similar pattern, although all the branch points
are shifted to the left due to inclusion of nonconserved sequences. Low-voltage-activated (LVA) channels appear to have diverged from an ancestral Ca2+ channel before the bifurcation of the high-voltage-activated (HVA) channel family into Cav1 and Cav2 subfamilies. 
LVA - Low-voltage-activated
HVA - High-voltage-activated
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T
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Menezes-Filho et al., 2014
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The four main classes of potassium channel
a | 2TM/P channels (which consist of two transmembrane (TM) helices with a P loop between them), exemplified by inwardly rectifying K+ channels and by bacterial K+ channels such as KcsA. 
b | 6TM/P channels, which are the predominant class among ligand-gated and voltage-gated K+ channels. 
S4 is marked with plus signs to indicate its role in voltage sensing in the voltage-gated K+ channels.
c | 8TM/2P channels, which are hybrids of 6TM/P and 2TM/P, and were first found in yeast. 
d | 4TM/2P channels, which consist of two repeats of 2TM/P channels. 8TM/2P 
Senyon Choe, 2002
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Schematic representation of the structural classification of K+ channel subunits. 
A, 6-TM subunits. 
Voltage-gated K+ channels
B, 2-TM subunits. 
Kir channels
C, 4-TM subunits 
 
IACh, muscarine-activated K+ current; 
IKDR, delayed rectifying K+ current; 
IKTO, transient outward delayed rectifier; 
IKUR, ultrarapid delayed rectifier;
IKr, cardiac rapid delayed rectifier; 
IKs, cardiac slow delayed rectifier;
IK1, inward rectifier; 
TWIK, two-pore weak inward rectifier; 
TASK, TWIK-related acid-sensitive K+ channel; 
TRAAK, TWIK-related arachidonic acid-stimulated K+channel.
Homotetramérico
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O painel superior mostra o estado fechado, no qual os resíduos carregados (+) situam-se dentro de uma estreita fenda interna que se abre para a solução intracelular. 
O painel inferior mostra o estado aberto. Depois do domínio transmembranar S4 sofrer uma rotação e inclinação anti-horária (setas vermelhas acima de S4), os resíduos carregados tornam-se acessíveis ao lado extracelular através da fenda externa. 
Model for the molecular motion associated with voltage-mediated gating
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The family of inward rectifier potassium channels
All members of this family share significant structural similarity but only Kir2 and Kir3 subfamilies represent channels carrying classical strongly rectifying currents. Four members of each Kir2 and Kir3 subfamilies were cloned in mammals. Heteromeric assemblies of Kir2.1, Kir2.2 and Kir2.3 subunits underlie IK1 current, and heteromeric assembly of Kir3.1 and Kir3.4 subunits underlies IKACh current. 
Anumonwo JM1, Lopatin NA, 2010.
Coração
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Figure 1. The primary structures of the subunits of the voltage-gated sodium channels. 
PKA
Sítio de glicolisação
PKA
PKA
PKA
PKC
PKC
TTX
Bloqueia a inativação
Aumenta a ativação 
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Bomba de Na+/K+
Dean (1941) – propôs a existência da bomba de Na/K
“some sort of a pump possibly located in the membrane which can pump out the sodium or, what is equivalent, pump in the potassium” 
 Hodgkin & Keynes (1955)
1- Axônio gigante de sépia (Sepia officinalis) – água do mar (24Na)
2- Estimulação do axônio
3- Lavagem do axônio
4- Axônio – água do mar (Na)
5- Observaram o aparecimento de radioatividade no meio extracelular
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Fonte: Garcia (1998)
HODGKIN & KEYNES (1955) 
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Fonte: Garcia (1998)
CALDWELL et al (1960) 
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Sodium-potassium pump with potassium ions (green) in the transport sites and a phosphate analogue (yellow) in the ATP-binding site. The cell membrane is shown schematically in gray.
Bomba de Na+/K+
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TRANSPORTE ATIVO
Bomba de Na+/K+
 2 subunidades ( e )
  (112.000 daltons) – 10 -hélices
  ( 35.000 daltons) – 1 -hélice - glicoproteína
147.000 daltons – 11 -hélices
The two potassium ions (green) are surrounded by oxygen atoms (red) from the protein.
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A BOMBA NA+/K+ É ELETROGÊNICA
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Citosol
H2O
H2O
H2O
H2O
3 Na+
2 K+
H2O
H2O
H2O
ATP
Mantem equilíbrio osmótico da célula 
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Ouabaína se ligando a Na/K ATPase 
5. É Bloqueada pela Ouabaína ou estrofantina G (Strophantus gratus) 
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No músculo cardíaco os íons cálcio que entram durante a fase de platô dos potencial de ação fazem o acoplamento entre a atividade mecânica e contrátil, um processo conhecido como acoplamento excitação contração. A membrana do miócito cardíaco apresentam invaginações ao longo da célula chamadas de túbulos T e ocorrem em intervalos de 2 um ao longo do eixo longitudinal da célula e coincide com a linha Z do sarcômero. 
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Tanto na membrana superficial e na membrana do TT são encontrados os canais de cálcio tipo L que são sensíveis a voltagem e vão se abrir durante a fase de platô. Podemos observar que o retículo sarcoplasmático está bem próximo a membrana do TT. Nessa região existe uma estrutura chamada de couplon, onde os canais de Ca tipo-L da membrana do TT e os receptores de RyR localizados na membrana do RS estão bem próximos separados apenas por uma distância de 15 nm. Esse arranjo é fundamental para garantir que o influxo de cálcio via canais tipo L ative os RyR e o cálcio estocado no RS seja liberado no citosol e promova a contração muscular. No relaxamento, é preciso fazer a receptação desse cálcio, que será bombeado de volta para o retículo por uma bomba de cálcio chamada SERCA, e vai ser transportado para o meio extracelular pelo trocador Na/Ca e pela ATPase de cálcio sarcolemal.
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Essa figura mostra a compração da ULC nos músculos esquelético e cardíaco. Podemos observar que no musc esquelético a ULC é menor podendo conter até 50 RyR e como podemos notar ocorre um número maior de justaposições. Já no músculo cardíaco as ULC são maiores podendo conter de 50 a 200 ryR e com menos justaposição entre o DHPR e RyR 
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Fig. 1. E-C coupling in ventricular myocytes. A: Transiente de calico evocado por estimulação. A célula foi estimulada no tempo 0. Podemos ver que o cálcio começa a aumentar em regiões que estão espaçadas a intervalos de 1,8 um ao longo do eixo longitudinal da célula, que é justamente a distancia entre os tubulos T
B: Em B foi usado uma sonda fluorescente (di-2-ANEPEQ) que cora a membrane cellular e do tubule T. O ponto onde o cálcio aumenta primeiro coincide com tubule T na linha Z. C: Scheme for E-C coupling in ventricular myocytes. Ca2+ influx through Ca2+ channels on the T-tubules trigger Ca2+ release from the adjacent SR Ca2+ release channel, resulting in simultaneous rise in Ca2+ throughout the cytoplasm.
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Fig. 2. E-C coupling in atrial myocytes. A: Typical di-2-ANEPEQ fluorescence image. B: Typical band scan images of a stimulation-evoked Ca2+ transient obtained in 4 ms. The start of each image is indicated on the left. Electrical stimulation of the cell was applied at 0 ms. Rise in Ca2+ began from the whole cell periphery and spread to the cell interior. C: Scheme for E-C coupling in atrial myocytes. Ca2+ influx through sarcolemmal Ca2+ channels trigger Ca2+ release from subsarcolemmal SR and a wave of Ca2+-induced-Ca2+ release propagates towards the cell center. 
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Nas células musculares o AEC ocorre em unidades liberadoras de cálcio e são formadas pela justaposição entre a cisterna terminal do RS e a membrane externa. Elas são chamadas de tríade ou diáde a depender do número de elemetos que compoe. A Triade é formada por 1 tubule T e 2 cisternas terminais do RS. Já a díade é formada pela membrana superfiacial e cisterna terminal (B) ou membrane do túbulo T e cisterna terminal.
Figure 1. Different types of Calcium Release Units in muscle cells. CRUs, or junctions, are formed by the close apposition of SR terminal cisternae and exterior membranes. They are called triads, dyads, and peripheral couplings depending on the number and nature of the elements that constitutes them.
A) Triads are formed by one T-tubule flanked by two SR cisternae (from adult toadfish swimbladder muscle). B and C) Peripheral couplings and dyads are formed by only two elements: one SR vesicle and respectively the surface membrane or a T-tubule (B, peripheral coupling in a BC3H1 cell; C, dyad in canine heart). The evenly spaced densities pointed by arrows in the junctional gap between the two membranes have been named feet by Clara Franzini-Armstrong and have been identified with the cytoplasmic domain of RyRs, the Ca2+ release channel of the SR. Bar, 0.1 mm (EM courtesy of Clara Franzini-Armstrong).
 
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A célula cardíaca estoca cálcio no RS que consegue manter alta concentração de cálcio m relação ao citosol. E esse cálcio é liberado no citosol através de canais liberadores de cálcio, um deles é o RyR. O RyR é um canal que recebeu esse nome devido a sua capacidade de se ligar a rianodina, um alcaloide obtido de plantas. Em tecidos de mamíferos já foram identificados 3 isoformas mas a RyR2 é a mais abundante no músculo cardíaco. O RyR é um complexo macromolecular formado por várias proteínas que se organizam em volta do RyR (calsequestrina, tiadina, junctina) e podem modular a atividade do RyR. O RyR pode ser modulado pelo canal de cálcio tipo L, pelo ca, Mg, ATP.......
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A FKBP tem um papel fundamental na regulação do RyR. No músculo cardíaco são encontrados 4 FKBP por RyR. Ele é responsável por promover o acoplamento do RyR com os seus respectivos vizinhos garantindo a ULC funcione de forma coordenada ou sincrônica na liberação de cálcio. Se a FKBP está dissociada do RyR, os RyR passam a funcionar como unidades isoladas perdendo o sincronismo na liberação do cálcio
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Figure 5.  Surface-rendered representation of triad. SR- and TT-derived vesicles in green and red,  respectively. Yellow spheres in lumen of SR represent calsequestrin and continuous yellowslabs near junctional surfaces of SR represent the condensed calsequestrin.  Blue structures correspond to feet/RyRs. Magenta particles in lumen of TT are of unknown identity.[from Wagenknecht et al, 2002]
 
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