MEIOS DE CULTURA

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11/10/2017
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MEIOS DE CULTURA
Profa. Ana Paula Alves
FaSar - 2017
 Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados
 Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas
 Outros são tão exigentes quanto o homem
 Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o 
cultivo em laboratório:
- Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais
- Cultivo in vivo: quando não se conhece as exigências nutricionais
Exemplo de microrganismos que precisam de hospedeiro para ser cultivado: 
- Mycobacterium leprae (causador da hanseníase)
- Glomus clarum (fungo simbionte)
Introdução
Nutrição de microrganismos
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Classificação nutricional dos microrganismos:
Tabela 1 – Classificação nutricional das bactérias e de outros
organismos.
▪ Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de cultura que simulam e 
até melhoram as condições naturais.
▪ Os elementos químicos principais para o crescimento das células são 
denominados macronutrientes (C, N, H, O, S, P).
▪ O carbono é um dos elementos mais importante para o crescimento 
microbiano.
Necessidade de meios de cultura adequados
Com exceção para CO2, os compostos orgânicos
são os que contém carbono
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Macronutrientes: - Necessários em grande quantidade. 
- Tem papel importante na estrutura e metabolismo.
Micronutrientes: - Necessários em quantidades mínimas.
- Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas
Matéria seca
Água
C
N
H
P, S, K, Na ...
célula
Introdução
Nutrição de microrganismos
Componentes necessários às células
Macronutrientes
▪Fonte de carbono:
- Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):
carboidratos
lipídeos 
proteínas
- Dióxido de carbono (microrganismos autotróficos): 
É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia deve vir da luz ou de outros
compostos inorgânicos.
▪ Fonte de Nitrogênio:
- É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12 %.
(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)
moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos)
moléculas inorgânicas (NH3, NO3
-, N2)
A capacidade de algumas 
bactérias em utilizar o nitrogênio 
atmosférico (FBN) é de 
fundamental importância para a 
vida de todos os seres.
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Componentes necessários às células
 Hidrogênio:
- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases) 
 Função:
Manutenção do pH
Formação de ligações de H entre moléculas 
Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração
• Oxigênio:
- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos)
- É obtido a partir das proteínas e gorduras.
Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.
Componentes necessários às células 
▪ P – Síntese de ácidos nucléicos, ATP
▪ S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas
▪ K – Estabilidade dos ácidos nucléicos, bomba de Na/K
▪ Mg – Estabilidade dos ribossomos
▪ Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos
▪ Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. 
Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15 % de sal.
▪ Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das 
proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
Outros macronutrientes:
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Componentes necessários às células
Micronutrientes
 Metais em quantidades muito pequenas (traços) na composição de um meio de 
cultura:
Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B
► Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação)
- Nem sempre sua adição é necessária
- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra
pura podem apresentar deficiências desses elementos.
Ex: Mo+6 é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte
o N2 para NH3 durante a FBN.
Água e outros aditivos
 Água:
- Componente absolutamente indispensável 
(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)
No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.
Outros aditivos:
Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar 
inibição, estabilizar o pH: 
 Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos
EDTA, ácido cítrico, polifosfatos.
 Inibidores
Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger
Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico
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 Tampões
- Carbonato de cálcio
- Fosfatos
- Proteínas (peptona)
Peptona é um tipo de substrato, que pode ser digerido pela enzima tripsina, secretada pelo
pâncreas. É uma proteína semi digerida que serve como fonte de nitrogênio
Indutores: a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.
Ex: celulose induz a celulase
pectina induz a pectinase
amido induz a amilase 
Antiespumantes: cultivos com aeração ocorre a produção de espuma
 Remoção de células, perda do produto, contaminação
 Redução do volume do meio
álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas
Outros aditivos
Meios de cultura
 Material nutriente preparado no laboratório para o
crescimento de microorganismos
 Algumas bactérias crescem em qualquer meio
 Outras → necessidade de meios especiais
 Outras → não são capazes de crescer em nenhum
meio já desenvolvido
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Meios de cultura
 Microorganismos colocado num meio de cultura para iniciar o
crescimento: inóculo
 Microorganismos que crescem e se multiplicam nos meios: cultura
 Critérios a serem considerados:
✓ Nutrientes corretos
✓ Quantidade de água necessária
✓ pH ajustado
✓ Quantidade específica de oxigênio ou ausência
✓ Meio inicialmente estéril
✓ Incubação em T adequada
Meios de cultura
 Ágar:
✓ Poucos microorganismos podem degradar
✓ Permanece sólido quando adicionado ao meio de cultura
✓ Após solidificação, suporta T de até 100°C (importante para
crescimento de bactérias termófilas)
✓ Uso em tubos ou placas de Petri
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Meios de cultura
Classes
Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água)
Complexos (utilizam hidrolisados carne e soja, extratos de levedura, sangue, soro, 
leite, solo e rúmem de bovino)
Não existe um meio de cultura universal, mas
Existem vários tipos meios para diversas finalidades
Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas
exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e
proporção adequada.
Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.
Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar as
necessidades nutricionais
Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais.
3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos
orgânicos.
Meio de 
cultura 
solidificado 
com 1,5 % de 
ágar.
Até 1880 os microrganismos eram
cultivados em meios líquidos.
Robert Koch introduziu os meios
de cultura sólidos, os quais
permitiram o estudo de espécies
isoladas (culturas puras).
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Meio quimicamente definido
 Fontes de energia e C, N, S, P e todos os fatores
orgânicos de crescimento que o organismo não é
capaz de sintetizar
 Composição química exata e conhecida
Meio quimicamente definido
Meio para bactéria quimioautotrófica típica: E. coli
Componente Quantidade
Glicose 5,0 g
Fosfato de amônia monobásico (NH4H2PO4) 1,0 g
Cloreto de sódio (NaCl) 5,0 g
Sulfato de magnésio (MgSO4 . 7H2O) 0,2 g
Fosfato depotássio dibásico (K2HPO4) 1,0 g
Água 1 litro
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Meio complexo
 Bactérias heterotróficas e fungos
 Compostos de nutrientes: extrato de levedura, carne ou de certas
plantas, produtos de digestão protéica
 Componente protéico: principal fornecedor de energia, C, N e S
 Digestão da proteína para que o microorganismo possa aproveitá-la
(peptona)
 Extratos: vitaminas e outros fatores de crescimento orgânico
Meio complexo
 Meio complexo na forma líquida: caldo nutriente
 Adição de ágar: ágar nutriente
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Meio complexo
Meio complexo para bactéria heterotrófica
Componente Quantidade
Peptona (proteína parcialmente digerida) 5,0 g
Extrato de carne 3,0 g
Cloreto de sódio 8,0 g
Ágar 15,0 g
Água 1 litro
Meios de cultura
 Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas 
de formulações para inúmeras finalidades.
Alguns são meios gerais: permitem o crescimento de muitas espécies
Outros são meios específicos: servem para identificação de espécies, por ex.
Escherichia coli e Shigella sonnei em meio MacConkey
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Microplacas com diferentes 
meios de cultura para 
identificação de 
enterobactérias.
Meios de cultura para bactérias
 Normalmente imitam o habitat normal
Ex.
Se a bactéria prefere os nutrientes encontrados no sangue, então o sangue é adicionado no meio de 
cultura.
Meio definido para quimioautotróficas Meio definido para heterotróficas Meio complexo para heterotróficas
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Meios de cultura para fungos
• Todos os fungos são heterotróficos
Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos 
pela peptona e extratos de carne ou soja.
Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os 
meios para bactérias. 
Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.
não possui capacidade de produzir seu alimento a partir da
fixação de dióxido de carbono e por isso se alimenta a
partir dos outros compostos inorgânicos ou orgânicos.
Meios de cultura para protozoários
• Os protozoários são heterotróficos aeróbios com exigências nutricionais 
complexas
Muitos não são cultivados in vitro.
Os que são necessitam muitos complementos, como emulsões de tecidos cerebrais, soro fetal, 
infusão de fígado e células bacterianas.
Ex: Tetrahymena pyriformis necessita de um meio contendo 10 aminoácidos, 7 vitaminas e sais 
inorgânicos.
Tetrahymena pyriformis não é patogênico mas é 
utilizado em pesquisas médicas e biológicas. 
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Meios de cultura para algas
• As algas utilizam luz como energia, dióxido de carbono, água e íons
inorgânicos solúveis. São fotoautotróficos.
Ao contrário dos meios para bactérias e fungos, existem poucos meios prontos para algas.
Preparar um meio definido para algas marinhas pode ser muito trabalhoso, pois muitos sais
contidos na água do mar poderão ser necessários.
Maré vermelha.
Algas que produzem toxinas. Algas unicelulares 
obtém seus nutrientes com a ajuda da luz do sol, nos
seus cloroplastos : algas, plantas e cianobactérias.
Meios e metodologia para 
crescimento de anaeróbios
 Contato com o oxigênio → morte
 Uso de meios especiais: redutores
✓ Contém reagentes como tioglicolato de sódio → combina-se com o
oxigênio e o elimina do meio de cultura
✓ Tubos: tampas seladoras
✓ Placas de Petri: jarras especiais
✓ Uso da enzima oxirase: reduz oxigênio em água
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Meios de cultivo seletivo
 Meio seletivo: Favorece o crescimento de bactéria
de interesse e impede o crescimento de outras
 Ágar sulfeto de bismuto → isolamento da bactéria
causadora do tifo: Salmonella typhi, a partir das fezes
✓ Sulfeto de bismuto: inibe crescimento de bactérias
Gram-positivas e maioria das Gram-negativas
presentes no TI
Meios de cultivo diferencial
 Meio diferencial: fácil identificação da colônia de interesse
quando existem outras bactérias crescendo na mesma placa
 Ágar Sabouraud dextrose: pH 5,6 → crescimento de fungos
(pelo pH baixo)
 Agar sangue: identificação de microorganismos capazes de
destruir células sanguíneas (Streptococcus pyogenes) → formam
um anel claro em torno da colônia
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Meios de cultivo seletivo e 
diferencial
Agar Sabouraoud dextrose Agar sangue
Meios de cultivo seletivo e 
diferencial
 Em alguns casos: uso de meio seletivo e diferencial combinados
✓ Isolamento de Staphylococcus aureus: tolerante a altas concentrações
de NaCl e fermenta o manitol, formando ácido
✓ Meio agar sal manitol: 7,5% de NaCl (nessa concentração impede
crescimento de outros microorganismos competidores) → seleção
✓ Também contém indicador de pH que altera a cor quando manitol é
fermentado a ácido → diferenciação de colônias que não
fermentam
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Meios de cultivo seletivo e 
diferencial
Agar sal manitol
• amarelo: +
• vermelho: -
Meios de cultivo seletivo e 
diferencial
 Agar MacConkey – seletivo e diferencial
 Contém sais biliares e cristal violeta (inibidores de
Gram-positivas)
 Também contém lactose → diferencia de Gram-
negativas que produzem ácido a partir do
metabolismo desse açúcar
destinado ao crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de
lactose. Colónias bacterianas que fermentam lactose tornam o meio rosa choque
e as bactérias que não são fermentadoras de lactose tornam o meio amarelo
claro.
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Meios de cultivo seletivo e 
diferencial
Agar MacConkey Agar MacConkey
Bactérias fermentadoras
de lactose – colônias 
vermelhas ou rosas
Agar MacConkey
Bactérias não 
fermentadoras
de lactose – colônias 
incolores
Meio de enriquecimento
 Isolamento de bactéria presentes em pequeno n°
 Empregada em amostras de fezes e solo
 Normalmente o meio é líquido e contém todos os
nutrientes
 Pode ser considerado um meio seletivo
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Meio de enriquecimento
 Isolamento de um microorganismo de solo:
✓ Capaz de crescer utilizando fenol, mas que está presente em menor
n° que as outras espécies
✓ Amostra de solo → colocada num meio de enriquecimento líquido
com fenol (única fonte de C e energia)
✓ Microorganismos que não são capazes de utilizar fenol não
crescerão
Meio de enriquecimento
 Isolamento de um microorganismo de solo:
✓ O meio será incubado por alguns dias
✓ Posteriormente, pequena quantidade será inoculada em outro
tubo contendo o mesmo meio
✓ Após algumas transferências de inóculos → presença da
bactéria que for capaz de metabolizar fenol
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RESUMO: Meios de cultura
TIPO FINALIDADE
Quimicamente definido Crescimento de quimioautotróficos e autotróficos e
análises microbiológicas
Complexo Crescimento da maioria dos microorganismos
quimio-heterotróficos
Redutor Crescimento de anaeróbicos obrigatórios
Seletivo Impedir crescimento de microorganismos não
desejados, favorecer o crescimento do organismo
de interesse
Diferencial Diferenciar as colônias do organismo de interesse
dos outros microorganismos
Enriquecimento Semelhante ao seletivo, mas com a característica
de aumentar o n° da bactéria de interesse tornando-
a detectável
Obtenção de culturas puras
 Proveniente de amostras de materiais infecciosos: pus, escarro,
fezes, urina
 Amostras de solo, água ou alimentos
 Semeadura dessas amostras: crescimento de várias colônias
 Colônias microbianas: apresentam características morfológicas
distintas que permitem diferenciação
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Obtenção de culturas puras
 Método de esgotamento:
✓ Alça de inoculação estéril → mergulhada na cultura mista
✓ Semeadura na placa demeio nutriente sólido
✓ Espalhar a bactéria na superfície do meio
✓ Final da semeadura: poucas células ainda na alça → nova semeadura
colônias isoladas
Obtenção de culturas puras
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Preservando culturas bacterianas
 Refrigeração – curtos períodos
 Longos períodos:
✓ Congelamento em baixas temperaturas
✓ Liofilização
Preservando culturas bacterianas
 Congelamento em baixas temperaturas:
✓Culturas puras colocadas num líquido de suspensão
✓Congeladas rapidamente em T entre -50°C a
-95°C
✓ Permanecem viáveis por anos
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Preservando culturas bacterianas
 Liofilização:
✓ Suspensão microbiana é rapidamente congelada em T entre -
54°C a -72°C
✓ Remoção imediata da água utilizando alto vácuo (sublimação)
✓ Selamento das ampolas – chama de alta T que derrete o vidro
✓ Resíduo = pó, contendo microrganismos viáveis
✓ Recuperação pela adição de meio líquido nutriente ao resíduo