Metodos moleculares

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Métodos de análise molecular
Msc. Franciane Cabral Pinheiro
Universidade Federal do Pampa
Programa de Pós Graduação em Bioquímica 
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Biologia molecular!!
Estuda as interações, a função e a estrutura dos genes a nível molecular 
Está intimamente envolvida com a bioquímica, pois as interações genéticas ocorrem a níveis de átomos e moléculas
Visa o estudo dos processos de replicação, transcrição, tradução, suas regulações e seus possíveis erros e características.
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Um pouco da história....
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Princípios básicos!
DNA
RNA
Dupla hélice de nucleotídeos 
Fitas em sentido antiparalelo com sequência de pares de bases complementares
Pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas A-T; C-G
Fita simples
Ribose 
A, U, C e G 
Obtido pela transcrição do DNA
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Princípios básicos!
Genotoxicidade: estudo da ação de qualquer agente físico, químico ou biológico que produz danos no material genético de células (DNA e cromossomo). Os testes avaliam o dano diretamente na célula.
Mutagenicidade: mudança ou dano gênico no mecanismo de reparo ao DNA provocado pelo agente físico, químico ou biológico, resultando em uma célula alterado. Os teste avaliam a expressão da mutação
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Análise!
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Extração de DNA!!!
SDS
CTAB
Proteínase K
Congelamento
Maceração
Fenol
Clorofórmio
Cloreto de sódio
Acetato de sódio
Membrana
Beads
Etanol
Iso-propanol
Processo
Procedimento comum
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Métodos:
In house
Kits comerciais
Etapas:
Lise das membranas lipídicas;
Purificação do DNA;
Precipitação do DNA;
Reidratação do DNA.
Extração de DNA!
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Enzimas de restrição
As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição como também são conhecidas, são enzimas que cortam a molécula de DNA através do reconhecimento de sequências nucleotídicas específicas.
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Eletroforese 
É o movimento de partículas dispersas em relação a um fluido sob a influência de um campo elétrico espacialmente uniforme.
É comumente utilizada para a separação de proteínas e ácidos nucleicos (DNA e RNA)
É realizada em géis de poliacrilamida ou agarose.
1-Gel gelitificado de agarose
2-Separa fragmentos longos de DNA
3-Corrente elétrica sobre gel
4-Partículas menores tem maior velocidade de chegar ate o pólo positivo
Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese em gel de policrilamida
1-Fragmentos pequenos de DNA ou outra molecula
2-Recupera e purifica amostras
3-Em cubas de vidros
4-Aplicacao de corrente
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Eletroforese 
Preparo do gel
Aplicação da 
amostra de DNA no Gel 
Posicionar o gel na 
cuba e cobrir 
com TBE
Ligar à cuba 
à uma fonte de energia para aplicação 
do potencial 
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Eletroforese 
Coloração
Brometo etídio
Nitrato de prata
Gel Red
Revelação
Visualização das bandas em transiluminador ultravioleta
Brometo de etídio
Nitrato de Prata
Gel Red
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Em resumo....
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PCR - Reação em Cadeia da Polimerase 
Amplificação de cópias de uma sequência específica a partir de pequenas quantidades de DNA molde.
Aplicações:
Diagnóstico (análise de mutações, detecção de patógenos, tipagem para transplantes)
Testes forenses (paternidade e investigação criminal)
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PCR: Taq polimerase
Taq polimerase é usada no PCR para desnaturar o DNA molde.
Taq polimerase (Thernus aquatic)
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PCR: Primers
Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de sequência complementar e flanqueadora à fita molde, com extremidade 3’-OH livre.
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Componentes do PCR
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PCR - ciclagem
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PCR - Visualização
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do uso da eletroforese em gel.
Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.
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Determinação da ordem precisa dos nucleotídeos em uma molécula de DNA 
Determinar a ordem das bases nitrogenadas
• Método tradicional – Método Didesoxi de Sanger (1980)
Sequenciamento de DNA
Método enzimático, dideoxi ou de término da cadeia Síntese enzimática de uma fita complementar, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleotídeo!
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Sequenciamento de DNA
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Método de Sanger Manual
Sequenciamento de DNA
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Método de Sanger Manual
Sequenciamento de DNA
Aquecimento
Resfriamento
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Método Automático
Substituição das técnicas de detecção por radioatividade pelo uso de marcadores fluorescentes
Radioisótopos – danosos à saúde, dificuldade de automação 
Fluorófos – sistema de detecção que permite a leitura automática das seqüências 
 Ocorre apenas uma reação de sequenciamento com os 4 ddNTPs, que são lidos automaticamente durante a eletroforese 
Corantes fluorescentes – reações no mesmo poço no gel 
Sequenciamento de DNA
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Método Automático
Sequenciamento de DNA
A amostra é aplicada num gel 
ou em um capilar de poliacrilamida
e então passa para um detector
De fluorescência. 
O detector identifica o sinal 
Fluorescente emitido pelas bandas
E transmite os dados para o 
Computador, que converte a 
Informação na sequencia 
De DNA apropriado.
A sequencia pode ser impressa
para analise ou enviada
para um arquivo para ser analisado
por sofwares específicos
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Southern, Northern e Western blot
No caso de RNA é necessário realizar eletroforese em géis desnaturantes (formaldeído, glioxal, entre outros). 
À transferência, envolve a imersão da membrana em uma solução que contém, uma mistura definida de sais, a sonda molecular., que poderá ser um fragmento de DNA, RNA ou oligonucleotídeos ,marcados para permitir a identificação dos híbridos que se formarão. 
A marcação pode ser feito com o emprego de radioisótopos ou pela adição química de grupos reativos ou enzimas
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Western blot
A fim de tornar as proteínas acessíveis à detecção por anticorpos realiza-se a transferência destas de um gel para uma membrana adsorvente
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Northern blot
Extração do DNA
Eletroforese do RNA
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Southern blot
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Obrigada pela atenção!!!