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EXAMES BACTERIOLÓGICOS Semeadura característica das colônias em diferentes meios de cultura – Coloração de Gram Técnicas assépticas: inoculação de microorganismos em meios de cultura que possibilitem o seu rápido crescimento, livre de contaminações. As alças podem ser em argola, em anel ou em agulha. Há vários tipos de semeio 1. Por esgotamento, “zigue-zague”: sem tirar da placa deve-se fazer um novo semeio e assim sucessivamente, sendo importante fazer colônias isoladas. A máquina identifica apenas as colônias puras, então essa preparação da amostra é manual e é preciso tomar muito cuidado. Deve-se semear atrás do bico de Bunsen e na zona de esterilidade (até 15 cm do bico), atrás para não haver contaminação nem do meio e nem do manipulador. Tudo que for ser utilizado deve ser passado no bico de Bunsen antes e depois de ser usado. 2. Semeio por “swab”: exige 3 giros de 60°. O semeio é feito até a metade da placa. 3. O semeio também pode ser feito em tubo ágar inclinado em “zigue-zague” para manutenção ou identificação. Pode ser feito também em picada com alça em agulha: introduz e retira na mesma posição, sem inclinar. Serve para observar motilidade, para requerimento de oxigênio, etc. A quantidade de ágar é menor que no inclinado. Os principais microorganismos que serão estudados: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes (garganta - febre reumática), Enterococcus faecalis e E. faecium, Bacillus subtilis(vive no solo, mas pode causar infecção). Gram-negativos: Scherichia coli, Klebsiella sp, Salmonella, Shigella... Ágar manitol salgado: específico para Staphylococcus aureus. Há alta concentração de sal (7,5%) que inibe outras bactérias. Ocorre degradação do manitol, formando ácido; o vermelho de fenol funciona como indicador de pH, passando de vermelho para amarelo. Ágar bile esculina: identifica Enterococcus que fazem parte do grupo sorológico D. Eles usam, na verdade, identificam o grupo D em si, onde os Enterococcus fazem parte. A bile hidrolisa a esculina, produzindo glicose e esculatina. Esta se liga ao ferro no meio, formando uma cor escura (um complexo negro) no local da inoculação. EMB: meio seletivo inibidor de gram-positivos e diferencial, pois os fermentadores de lactose produzem colônias escuras, podendo apresentar brilho metálico característico e tom esverdeado. É característica da Escherichia coli: colônias secas, com brilho metálico. São sugestivas de E. coli, mas é preciso fazer testes bioquímicos. Os mais fracos apresentam uma cor que varia de creme a marrom, com centro escuro e bordas claras, como a Klebsiella sp. As colônias são mais mucoides. Nesse caso, ocasionalmente apresentam brilho metálico. Os não fermentadores de lactose, como Salmonella, Shigella e Proteus, formam colônias incolores. Para ocorrer a diferenciação de cor, precisa-se de um açúcar (lactose e sacarose) para fermentar, um inibidor e um indicador de pH, que são os mesmos componentes (eosina e azul de metileno). [OBS.: o meio original é âmbar/marrom] Ágar MacConkey: meio seletivo (inibe Gram+) e diferencial. Os fermentadores de lactose produzem cor que varia de rosa a vermelho. Os mais fortes produzem cor mais forte (ex.: Escherichia), enquanto os mais fracos (ex.: Klebsiella) são mais claros e mucóides. Os não fermentadores são incolores (ex.: Salmonella, Shigella e Proteus). Nesse meio há carboidratos (lactose), inibidores (sais biliares e cristal violeta) e indicador (vermelho neutro). Ágar Sangue: meio extremamente nutritivo e de grande importância para as bactérias que fazem hemólise (grupo dos Streptococcus e alguns Enterococcus). O pH do meio (6,8) é especialmente favorável para conservar os eritrócitos. As enzimas da bactéria lisam e formam um halo de hemólise. Há 3 tipos de hemólise: Hemólise δ: ausência de hemólise Hemólise α: parcial (halo esverdeado) Hemólise β: total (forma-se ao redor da colônia um halo transparente). Ágar Nutritivo: meio base onde só crescem microorganismos que não são exigentes. Não é um meio seletivo nem diferencial. As bactérias que crescem em ágar sangue não crescem em ágar nutritivo. SIM (Sulfeto Indol Motilidade): produção de indol de sulfetos (H2S) para motilidade. Contém tiossulfato de sódio, sulfato de ferro e amônio. O meio pode ter motilidade positiva ou negativa, vista pela turvação do meio; quanto mais turvo, maior foi sua motilidade. Os microorganismos que não possuem motilidade crescem apenas no local de inoculação. A produção de sulfeto escurece o meio. [OBS2: se a bactéria produz tiossulfato redutase, este será responsável por degradar tiossulfato de sódio, produzindo H2S, reagindo com o sulfato ferroso presente no meio, formando um preciptado preto de sulfeto ferroso.] Indol: produzido a partir do triptofano do meio, pela triptofanase da bactéria que o degrada, produzindo o indol, o ácido pirúvico e a amônia. O indol é detectado pelo reativo de Kovacs (p-dimetilaminobenzaldeído), formando um anel rosa. Motilidade: cocos geralmente não têm flagelos, consequentemente, não possuem motilidade. Streptococcus pyogenes e Staphylococcus aureus: não apresentam motilidade. Os Enterococcus: às vezes, têm pouca motilidade, pois apresentam um flagelo delicado. Klebsiella e Shigella: não possuem motilidade. E. coli: pode ou não apresentar motilidade. Proteus e Salmonella: apresentam motilidade Tioglicolato fluido: meio para verificar o requerimento de glicogênio. Ele possui alta viscosidade que impede a penetração rápida de O2. As substâncias redutoras são o tioglicolato e a cisteína. O indicador de oxigênio é a resazurina sódica. Os aeróbios restritos crescem apenas em cima; os anaeróbios, em baixo; os facultativos , em toda extensão. Os facultativos não móveis só crescem na picada e em cima. Os microaerófilos crescem um pouco abaixo da superfície. Bacillus subtilis: pode crescer na superfície ou em toda extensão. Pseudomonas aeruginosa: só cresce na superfície. Clostridium: só cresce na base. Os outros crescem em toda a extensão, incluindo o Bacillus subtilis. Staphylococcus aureus Apresenta; sítios de infecção em orofaringe, urina, sangue, feridas, ponta de cateter, dreno, abscessos, furúnculos, entre outros. É altamente importante na UTI. Características do microorganismo: cocos com cerca de 1 µM de diâmetro, anaeróbio facultativo, não fastidioso. Coloração de gram: cocos gram positivos, arranjados em cacho. Colônias grandes e amareladas/douradas. Apresenta β- hemólise. Streptococcus pyogenes (Grupo A) Apresenta sítios de infecção em orofaringe e pele. Duas sequelas: febre reumática e glomerulonefrite, ambas de natureza imunológica. Características: cocos gram positivos com cerca de 0,5 µM. Apresenta cadeias longas, translúcidas e β- hemólise. Enterococcus (Grupo D) Gram positivos: cadeias curtas, translúcidas, β ou δ- hemólise. Cor: violeta Cocos com camada espessa de peptideoglicano Gram negativos: bastonetes, anaeróbios facultativos. Salmonella sp, E. coli, Shigella. Cor: vermelho Bastonetes com camada delgada de fosfolipídeos PROTOCOLO Fixação do esfregaço, coloração primária com cristal violeta (duração de até 1 minuto), mordente (colocar lugol durante 1 minuto – ele fixa o cristal violeta à célula), descoloração (com álcool etílico a 95% em tempo delicado), contraste (safranina ou fucsina de 30 segundos a 1 minuto), lavar em água corrente, secar e observar. Todas as bactérias secoram com o cristal violeta. Com o lugol há formação do complexo iodo-pararosalina, fixando em todos os microorganismos. Algumas estruturas perdem rapidamente a cor com o álcool; outras não perdem ou demoram a perder. A safranina cora as estruturas descoradas. As bactérias com mureína retêm o corante durante o processo. As que têm principalmente lipopolissacarídeos e lipoproteínas perdem a cor e assumem a cor da safranina/fucsina. O álcool dissolve a porção lipídica das membranas externas facilitando a descoloração das células. Forma: cocos, geralmente gram positivos. Arranjo: em cachos (estafilococos), em cadeia (estreptococos e enterococos), aos pares (diplococos, pingo de vela – pneumococos ou S. pneumoniae)(Gonococos ou N. gonorrhoae, meningococos ou N. meningitide), em cubo (sarcina), em tétrade (micrococos). Forma: bacilos ou bastonentes. Arranjo: espirilos (espiroquetas – hélice- T. pallidum ou vibrião – forma de vírgula – V. cholerae) e cocobacilos (bacilos curtos que lembram cocos). Exceções Gram e exigência de O2: Bacilos Gram + Cocos Gram - Aeróbios ou anaeróbios facultativos Bacillus Acinetobacter Aeróbios ou anaeróbios facultativos Corynebacterium Branhamella Aeróbios ou anaeróbios facultativos Listeria Neisseria Aeróbios ou anaeróbios facultativos Lactobacillus Aeróbios ou anaeróbios facultativos Erysipeothrix Anaeróbios Clostridium Veillonella Anaeróbios Actinomyces Anaeróbios Eubacterium [OBS3: em negrito e sublinhado - os mais importantes na clínica] Bacillus subtillis Oportunistas: encontram-se no solo; ocasionalmente é o causador de infecções nosocomiais. Corynebacterium diphteriae Delgado, não forma esporos. Apresenta arranjos em paliçadas e/ou letras chinesas. Pode promover a difteria (febre alta, dificuldade para engolir). Listeria Bacilos pequenos e gram positivos. Causa listerose (quadro grave). Causa sepsis e meningite. Lactobacillus acidophilus (bacilo de Doderhein): apresenta-se na microbiota normal da vagina. É responsável por manter o pH vaginal ácido, metabolizando glicogênio à ácido lático e impedindo a colonização de outras bactérias. Erysipelothrix rhusropathiae: bacilos longos e delgados, encontrados em mamíferos, aves e peixes. A infecção humana mais comum é a erisipela. Clostridium: gram positivo anaeróbico. Bacilos largos, formadores de endosporos. O C. tetani e o C. botullinum produzem as toxinas mais conhecidas. Actinomyces: bacilos não formadores de esporos. São encontrados na microbiota normal da boca e do trato urogenital. A actinomicose é caracterizada pela presença de grânulos de enxofre no exsudato da inflamação como em DIU. Acinetobacter: cocos ou cocobacilos. Comuns em ambientes hospitalares. Infecções pulmonares, feridas e trato urinário são comuns. A A. baumannii é a mais comum. Branhamella: baixa virulência. Ocasionalmente pode causar meningite, bacteremia, pericardite e pneumonia, podendo ser confundido com Neisseria. Neisseria: diplococos, aeróbios estritos, não formam esporos, são parasitas intracelulares. Os facultativos são: N. meningitidis e a N. gonorrhoeae. Veillonella: parasitas da boca e dos tratos intestinal e respiratório do homem e de outros animais; raro causador de infecções em humanos.
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