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Prof.: Cynthia Canedo da Silva Aula 8: Micro-‐organismos e Engenharia Gené7ca Tortora et al., 2012 Cap. 9: 247-‐272 Aula: Micro-‐organismos e Engenharia Genética Prof. Cynthia Canêdo da Silva Tortora et al., 2012 Cap 9: 247-‐272 Departamento de Microbiologia MBI 102 Microbiologia Básica para Engenharias Ao final desta aula o estudante deverá ser capaz: • Reconhecer o papel e a importância dos micro-organismos na engenharia genética • Identificar as principais etapas e elementos necessários para a clonagem de genes • Explicar como as enzimas de restrição e as DNA ligases são utilizadas para construir plasmídeos recombinantes • Descrever estratégias que possibilitam a identificação de bactérias recombinantes • Reconhecer problemas associados com a clonagem de genes 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 4. Características do vetor ideal MBI 102 Produtos farmacêuticos Produtos para agricultura e pecuária 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 1. Introdução ü Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA Recombinante -1973 ü Por que os micro-organismos são importantes ferramentas na Engenharia Genética? 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Vantagens da utilização de micro-organismos ü Fácil cultivo – custos relativamente barato ü Obtenção de um grande número de células em um curto período de tempo ü Produção de compostos por tempo indefinido 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Cristais de insulina obtidos por engenharia genética E. coli geneticamente modificada Produção de insulina 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Visão Geral da Engenharia Genética 1. Vetor 2. Gene de interesse 3. Hospedeiro 4. Clonagem 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 3. Características do hospedeiro ideal ü Aceitar o DNA exógeno sem provocar modificação no gene ü Permitir a seleção das células que apresentarem o DNA exógeno ü Baixo potencial de proliferação no meio ambiente 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 4. Características do vetor ideal ü Duplicar o DNA exógeno ü Apresentar marcadores para a seleção ü Apresentar propriedades que facilitem sua ligação ao DNA que vai ser clonado Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 3. Características do vetor ideal Região em que o DNA exógeno pode ser inserido Plasmídeo Vetor de clonagem 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Construção de uma bactéria recombinante a) Isolamento do DNA doador b) Isolamento do DNA plasmidial c) Tratamento com endonucleases de restrição - DNA plasmidial e DNA a ser clonado clivados com as mesmas enzimas de restrição -> ligação dos fragmentos de DNA 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 a) Isolamento do DNA doador Células Liberação do DNA Purificação do DNA Lise das células 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 b) Isolamento do DNA plasmidial O DNA liberado é misturado a uma solução de cloreto de césio e brometo de etídio Separação do DNA plasmidial por gradiente em cloreto de césio O tubo é colocado em um rotor e submetido à centrifugação em alta velocidade 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 c) Tratamento com endonucleases de restrição ü Presentes em quase todos os micro-organismos ü Reconhecem sítios específicos na sequência do DNA (4-6 pares de bases) ü Função na bactéria: Identificação e destruição de DNA estranho (que não está metilado) ü Produção de terminais coesivos ou cegos 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Clivagem Extremidades coesivas Enzima de restrição EcoRI ü Extremidades coesivas ü Unem uma as outras por complementaridade Sítio específico 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Aula 8: Micro-‐organismos e Engenharia Gené7ca Ação das enzimas de restrição DNA “estranho” não metilado Clivado DNA do hospedeiro - metilado Não clivado DNA metilado 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Alguns kits comerciais Kit de extração de DNA genômico Kit de extração de DNA plasmidial Kit de clonagem de DNA 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Transformação ü Transformação com cloreto de cálcio e choque térmico ü Transformação por eletroporação Método u7lizado para inserir os plasmídeos contendo o DNA de interesse nas bactérias receptoras 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Plasmídeo recombinante 1) Mistura de E. coli com os plasmídeos em presença de CaCl2 2) Aplicado choque térmico 3) Cultivo em ágar nutriente contendo Ampicilina Células que NÃO receberem o plasmídeo morrerão em placa com ampicilina Células transformadas sobrevivem em placa com ampicilina Cromossomo Plasmideo recombinante Transformação com cloreto de cálcio 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Transformação de E. coli Os íons de CaCl2 atuam neutralizando as cargas negativas da membrana e do DNA plasmidial 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Transformação com CaCl2 e Choque Térmico Preparo de células competentes 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Transformação por Eletroporação Preparo de células competentes 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 f) Identificação das bactérias produtoras da nova proteína ü Uso de plasmídeos com genes que conferem resistência a antibióticos ü Uso de plasmídeos com genes que permitam a detecção de bactérias recombinantes ü Hibridização de colônias para identificar bactérias recombinantes 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Detecção da bactéria recombinante ü Seleção branca-azul 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Seleção branca-azul ü Inserção do DNA de interesse no gene lacZ ü DNA de interesse inserido no meio do gene lacZ 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Detecção da bactéria recombinante ü Seleção branca-azul Transformação 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenhariagenética MBI 102 Colônias branca-azul ü Todas as colônias contêm o plasmídeo ü Colônias azuis -> transformantes ü Colônias brancas -> transformantes recombinantes 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Hibridização de colônias ü Emprego de sonda de DNA para identificar colônias contendo o gene de interesse ü As sondas de DNA são complementares ao gene desejado 4. Características do vetor ideal MBI 102 Problemas com a clonagem de genes de eucariotos em bactérias • Presença de íntrons • A bactéria não reconhece as sequências reguladoras de eucariotos • Formação de agregados protéicos insolúveis • Síntese em excesso da proteína • Destruição da nova proteína • Dificuldades na extração e purificação da nova proteína 4. Características do vetor ideal Aula: Micro-organismos e Engenharia genética MBI 102 Síntese de cDNA ü Transcriptase reversa ü Fita molde: mRNA A primeira fita de DNA é sintetizada pela transcriptase reversa. 4. Características do vetor ideal MBI 102
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