Relatório Técnicas Cromatográficas

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Introdução
A palavra cromatografia surge do grego, significando cor (chroma) e escrever (grafia), e tornou-se um método importante de separação a partir de 1903, quando foi desenvolvida pelo botânico Mikhail Semenovich Tsweet. É um processo de separação de amostras complexas, entre uma fase móvel – eluente – e uma fase estacionária – adsorvente. A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido depositado num sólido inerte, empacotada numa coluna ou espalhada numa superfície, formando uma fina camada. A fase móvel é a que se desloca por dentro ou por cima da fase estacionária, transportando com ela o analito [1]. 
A cromatografia pode ser definida como uma técnica em que os compostos de uma mistura são separados dependendo da velocidade com que são transportados através de uma fase estacionária, por um líquido ou gás da fase móvel. Esta técnica tem inúmeras aplicações, desde a separação de componentes relativamente voláteis, como purificações de produtos farmacêuticos, proteínas, esteroides, entre outras [2].
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados são considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separação [3].
Dentre os vários tipos de cromatografia, especial ênfase será dada à cromatografia em papel e cromatografia por coluna.
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de adsorção líquido–líquido. Nesse caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária [4]. O parâmetro mais importante a ser considerado em CP é o fator de retenção (Rf), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel. Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6. A CP pode ser usada tanto na escala analítica quanto na preparativa [1].
A CP trata-se de uma técnica simples para análise e separação de amostras em pequenas quantidades. O papel consiste em celulose que é um polímero de cadeia longa, presentes nas paredes celulares das plantas. A celulose é altamente polar, sendo essa característica muito importante para utilização em experimentos cromatográficos, ela pode absorver até 22% de água. É a água absorvida que funciona como fase estacionária líquida que interage com a fase móvel também líquida. Os componentes da amostra são separados entre a fase estacionária e a fase móvel em movimento no papel. Os componentes que têm capacidade de formar ligações de hidrogênio migram mais lentamente [4].
Uma coluna cromatográfica clássica é constituída basicamente por uma fase estacionária normalmente utilizando a sílica (polar), empacotada em um tubo, e uma fase móvel ou eluente. A separação de uma mistura em um sistema cromatográfico depende das interações intermoleculares que ocorrem entre os componentes da mistura e as fases estacionária e móvel [5].
Materiais e Reagentes
Béquer;
Conta gotas;
Papel filtro de café e quantitativo;
Canetas esferográficas;
Régua;
Coluna Cromatográfica;
Espátula;
Balança;
Sílica Gel;
Etanol;
Ácido acético;
Azul de metileno; 
Alaranjado de metila.
Procedimento 
Cromatografia em camada delgada
Recortou-se 2 tiras de papel quantitativo e papel filtro de café nas seguintes dimensões (retângulos de 2 cm de diâmetro por 15-20cm de comprimento), traçando uma linha de 2cm de uma das extremidades dos papeis, marcando-o com duas canetinhas esferográficas de cores verde e laranja. Em seguida, preparou-se um béquer com etanol e emergiu-se os papeis neste, de modo que a tinta não entrasse em contato direto com o etanol. Observou-se o etanol eluir pelo papel, realizando o arraste e separação dos componentes da tinta. Calculou-se então o Rf para cada cor e assim foi analisado o desempenho de cada papel filtro, comparando-os. 
Este procedimento foi realizado mais uma vez com canetinhas esferográficas de cores roxa e rosa. 
Cromatografia em coluna
A cromatografia em coluna foi usada para separar os compostos de uma solução preparada de azul de metileno e alaranjado de metila. Inicialmente preparou-se uma coluna com 1,5 g de sílica gel como fase estacionária e etanol como eluente. Misturou-se a sílica gel e o etanol em um béquer até estes apresentaram um aspecto pastoso, transferindo-os para a coluna cromatográfica. Após toda a adição da sílica na coluna, lavou-se com etanol, deixando-o escoar até atingir aproximadamente uns 4 cm da sílica.
 Posteriormente, adicionou-se 4 gotas de alaranjado de metila e azul de metileno à coluna. Retirou-se então o primeiro composto com a adição de etanol. Em seguida, para a retirada do segundo composto foi acrescentado etanol e ácido acético. 
Resultados e Discussão
Cromatografia em camada delgada
Após o papel permanecer na cuba e o solvente chegar até a marca determinada no papel, o papel foi removido para proceder com as medidas requeridas para o cálculo do fator de retenção. O fator de retenção (Rf), também chamado na literatura de constante de corrimento, é a distância percorrida por cada composto em uma amostra, dividido pela distância pelo solvente. 
Onde:
 é a distância de retenção do analito 
 é a distância percorrida pela frente da fase móvel.
Cada pigmento arrastado pelo solvente estará contido nas tabelas abaixo, com os valores da distância percorrida e seu (Rf) devidamente calculados de acordo com a Equação 1. 
Tabela 1: Separação dos pigmentos no papel filtro café. 
	Caneta Esferográfica - Cores
	Separação de cores
	Distância de retenção - dr (cm)
	Distância da fase móvel -dm (cm)
	Fator de Retenção (Rf)
	Verde
	Azul
	5,6
	6,3
	0,8888
	Laranja
	Laranja
	5,9
	6,3
	0,9365
	Roxo
	Rosa
Azul
	4,8
2,3
	5,3
5,3
	0,9056
0,4339
	Rosa
	Rosa
	4,1
	5,3
	0,7735
Tabela 2 - Separação dos pigmentos no papel filtro quantitativo. 
	Caneta Esferográfica - Cores
	Separação de cores
	Distância de retenção - dr (cm)
	Distância da fase móvel -dm (cm)
	Fator de Retenção (Rf)
	Verde
	Azul
	4,2
	5,5
	0,7636
	Laranja
	Laranja
	5,2
	5,5
	0,9454
	Roxo
	Rosa
Azul
	4,5
1,3
	5,4
5,4
	0,8333
0,2407
	Rosa
	Rosa
	3,5
	5,4
	0,5925
Muitas das tintas e corantes que são usadas são, na realidade, misturas de vários pigmentos diferentes. Estes pigmentos são compostos diferentes que têm diferentes polaridades. Sendo assim, possuem uma maior ou menor afinidade pelo papel (fase estacionária) ou pelo etanol (fase móvel), podendo ser mais ou menos arrastada pela última. Dessa forma, a medida que o eluente corre pelo papel, os pigmentos das canetas são separados, evidenciando, assim, a grade de formação da cor inicial. 
Em relação as amostras presentes nas duas tabelas, observou-se que apenas a canetinha de cor roxa sofreu partição nos dois tipos de papeis e as outras não. A caneta roxa é constituída por dois pigmentos, que durante o contato com a fase móvel foram separados, apresentando assim uma maior afinidade com o etanol (fase móvel). Já as canetas de cores verde, laranja e rosa não sofreram partição, pois não houve uma boa afinidade com o etanol, fazendo com que não sofresse partição dos seus pigmentos, sendo apenas deslocado ao longo da fase estacionária, não havendo nenhum tipo de separação. 
Esta afinidade com o etanol é ocasionada pela interação que ocorre entre as polaridades do eluente com a amostra, uma vez que as tintas das canetas esferográficas apresentam um caráter polar, interagindo com a parte polar presente na hidroxila do etanol (Figura 2), fazendo com que ocorra um arreste destasamostras. Porém, quando as amostras não sofrem um grande arreste, significa que a alta polaridade presente no papel é maior que a do etanol, fazendo com que estas fiquem retidas no papel pela sua forte interação. 
Ao analisar os Rf obtidos por meio da equação 1, foi possível notar que o papel filtro de café apresentou um menor desempenho, pois este papel é constituído por poros muito grandes, espalhando a amostra sobre o papel. Já com o papel quantitativo a amostra fica mais contida, apresentando uma melhor visualização na separação das amostras. 
Cromatografia em coluna
Ao adicionar a sílica na coluna cromatográfica com etanol foi adicionado uma amostra de azul de metileno e alaranjado de metila, cuja coloração era verde-ecuro. Ao acrescentar etanol (fase móvel) na coluna, observou-se que houve inicialmente a separação dos componentes da amostra. O alaranjado de metila (Figura 1), que possui coloração amarela foi o primeiro composto a ser separado, por ser menos polar que o azul de metileno e apresentar um caráter ácido, semelhante ao da sílica gel (fase estacionária) que possui propriedades polares. Assim sendo arrastado para fora da coluna pelo etanol. Este fato se dá, pois, o alaranjado de metila possui íons positivos e íons negativos que se atraem eletrostaticamente, pelos polos positivos e negativos presente no etanol (Figura 2), apresentando ligações de íon-dipolo e ligação de hidrogênio entre ambos.
 Figura 1 – Alaranjado de metila
 Figura 2 - Etanol
Diferente do alaranjado de metila, o azul de metileno (Figura 3), de coloração azul, teve sua eluição inibida pelo etanol (fase móvel), pelo fato do azul de metileno apresentar uma interação maior pela sílica gel (fase estacionária). De tal modo, foi necessária a utilização de outra fase móvel, o ácido acético. A escolha desta fase móvel é devida a ocorrência do ácido acético (Figura 4), em solução aquosa, formar íons positivos e negativos (CH3COO- e H+) que o seu ânion interage com os cátions presentes no azul de metileno (S+), apresentando ligações de íon-dipolo e ligação de hidrogênio. Além do ácido acético ser um ácido fraco sua interação com o azul de metileno é desfavorecida em níveis energéticos se comparada a sílica gel, assim foi necessária uma concentração alta de ácido acético para que o azul de metileno pudesse se desprender da fase estacionária, ocorrendo de forma bem lenta. 
 Figura 3 – Azul de metileno
 Figura 4 – Ácido acético
Referências 
[1]. Skoog, A.; West, D.; Holler, F.; Fundamentals of Analytical Chemistry, 7ªed; Saunders College Publishing 1996.
[2]. Krull, I.; Analytical chemeswtry, Ed. Intech, 2012.
[3]. ANA, L. G.; DEGANI, Q. B.; CASS, P.C. Vieira.Cromatografia um breve ensaio. Química Nova, Nº 7, 1998.
 
[4]. RIBEIRO, N. M.; NUNES, C. R. Análise de pigmentos de pimentões por cromatografia em papel. Quimica Nova na Escola, v. 29, p.34-37, 2008.
[5]. FONSECA, S.F.; GONÇALVES, C. C. S. Extração de pigmentos do espinafre e separação em coluna de açúcar comercial. Química Nova na Escola, v.20, p.55-58, 2004.