relatório 10 determinação de parametros cineticos de reação catalisada por enzimas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
FACULDADE DE FARMÁCIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Físico-Química Experimental
Prof. NitoAngeloDebacher
Turma 03102B
Experimento 10:
DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE REAÇÕES CATALISADAS POR ENZIMAS
Beatriz Ramos
KetlynBuss
Pâmela Soares
Florianópolis, 18/10/2016
OBJETIVO
A partir da técnica de espectrofotometria determinar os parâmetros cinéticos da reação enzimática da batata.
INTRODUÇÃO
Enzimas são, em sua grande maioria, proteínas que catalisam reações químicas e biológicas. Os catalisadores apresentam como função a redução da energia de ativação, e por consequência o aumento da velocidade da reação. Para que essa ligação ocorra, a conformação da estrutura da enzima e de seus componentes adicionais são muito importantes, além de que dependem também do pH, da temperatura, da concentração do substrato e da presença ou não de inibidores.
Quando a enzima se liga ao seu substrato formando o complexo enzima-substrato, há um grande aumento da velocidade de reação, garantindo uma eficácia de ação enzimática.
Nas reações com enzimas alguns aspectos físico-químicos são de grande relevância, como a medida da velocidade inicial (V0) da reação e sua variação de velocidade (ΔV), além da variação da concentração do substrato ([S]) ao longo do tempo (t) após a adição de uma determinada concentração de enzima (E0). Com isso pode-se analisar a velocidade máxima e a constante de Michaelis-Menten (Km) que mostram as características de cada enzima para o seu substrato. Por exemplo, enzima polifenoloxidade pode ser extraída de vegetais (como a batata), de microorganismos (como fungos), e de alguns animais. Ela é classificada no grupo das oxirredutases e contem o cobre como grupo prostético (cofator). Essa enzima tem como ação indesejável o escurecimento de vegetais, como da batata e da maçã.
MATERIAL E PROCEDIMENTO
Material
1 proveta de 10 mL, 4 cubetas para espectrofotômetro de 3 mL, 1 micropipeta, 1 pipeta paster, 1 pipeta graduada de 2 mL, 1 ralador, 1 amassador de batata, 1 faca, 1 cápsula de porcelana, água destilada, peróxido de hidrogênio (H2O2) 10%, cronômetro e espectrofotômetro UV-visivel, ½ batata crua, cubos de gelo, catecol (solução aquosa 0,05 mol/L).
Procedimentos
Primeira parte – Preparar 100 mL de catecol 0,05 mol/L. Preparar o extrato de batata, ralando e espremendo a batata. Recolher o líquido numa proveta de 10 mL. Colocar a proveta com o líquido em um banho de gelo, para impedir a oxidação. Ligar o espectrofotômetro, acertar o zero de absorbância no comprimento de onda máximo de absorção da quinona (λmax = 458 nm).
Segunda parte – Dispor 4 experimentos variando a concentração de catecol e mantendo constante os demais componentes. Na primeira cubeta colocar 0,5 mL de catecol 0,05 mol/L + 2,5 mL de água, na segunda cubeta colocar 0,75 mL de catecol 0,05 mol/L + 2,25 mL de água, na terceira cubeta colocar 1,0 mL de catecol 0,05 mol/L + 2,0 mL de água, na quarta cubeta colocar 1,5 mL de catecol 0,05 mol/L + 1,5 mL de água.
Pôr nas 4cubetas uma gota de peróxido de hidrogênio (H2O2) 10%. Com a primeira cubeta zera-se a absorbância do espectrofotômetro. Após, adiciona-se uma gota de extrato de batata e agita-se a solução. Arrumar no aparelho, fazendo a primeira leitura de absorbância disparando simultaneamente o cronômetro, fazendo leituras de 20 em 20 segundos até aproximadamente 6 minutos.
	
	0,5 mL de catecol 0,05 molL-1 
+ 2,5 mL de água 
	0,75 mL de catecol 0,05 mol L-1 
+ 2,25 mL de água 
	1,0 mL de catecol 0,05 mol L-1 
+ 2,0 mL de água 
	1,5 mL de catecol 0,05 mol L-1 
+ 1,5 mL de água 
	Tempo, s
	Abs
	Abs
	Abs
	Abs
	0
	0,050
	0,069
	0,075
	0,093
	20
	0,169
	0,141
	0,209
	0,209
	40
	0,217
	0,192
	0,293
	0,270
	60
	0,260
	0,232
	0,355
	0,314
	80
	0,295
	0,264
	0,405
	0,345
	100
	0,325
	0,290
	0,443
	0,369
	120
	0,349
	0,310
	0,471
	0,385
	140
	0,370
	0,327
	0,490
	0,397
	160
	0,387
	0,340
	0,504
	0,405
	180
	0,401
	0,352
	0,515
	0,412
	200
	0,414
	0,359
	0,524
	0,414
	220
	0,424
	0,365
	0,530
	0,417
	240
	0,433
	0,371
	0,535
	0,419
	260
	0,439
	0,375
	0,539
	0,420
	280
	0,445
	0,379
	0,541
	0,421
	300
	0,449
	0,380
	0,544
	0,423
	320
	0,454
	0,382
	0,545
	0,423
	340
	0,457
	0,384
	0,549
	0,425
	360
	0,460
	0,385
	0,552
	0,425
4. Cálculos
4.1. Concentrações finais de catecol dentro de cada cubeta de 3ml:
Cubeta1: 
0,05x0,50 = M2x3,0
M2=0,025/3,0
M2=0,0083 mol/L
Cubeta2:
0,05x0,75 = M2x3,0
M2=0,0375/3,0
M2=0,0125 mol/L
Cubeta3:
0,05x1,00 = M2x3,0
M2= 0,05/3,0
M2=0,0167 mol/L
Cubeta4:
0,05x1,50 = M2x3,0
M2= 0,075/3,0
M2= 0,0250 mol/L
4.2. Gráfico 1.
Cubeta1:
V0= 
V0=3,21x10-3 ou 0,00321 s
Cubeta2:
V0= 
V0= 2,48X10-3 ou 0,00248 s
Cubeta3: 
V0=
V0=4,38x10-3 ou 0,00438 s
Cubeta4: 
V0= 
V0=3,13x10-3 ou 0,00313 s
4.3. Após encontrar o V0 foi possível construir um gráfico vs
	Cubeta
	y = 
	x = 
	1
	311,5
	120,5
	2
	403,2
	80
	3
	228,3
	59,9
	4
	318,5
	40
 - Gráfico 3
Utilizando o gráfico 3 foi possível determinar Km e Vmax a partir do método de Lineweaver-Burk:
 y= b + a . x
Coef. Linear (b) = 207,5
Vmax= = 4,82x10-3 s-1
Coef. Angular (a) = 
a= = = 1,41
Km= 1,41x(4,82x10-3)
Km= 6,8x10-3 mol/L
Determinando as unidades de Km e Vmax:
Vmax= = s-1
a= = = 
Km= a.Vmax = 
4.4. Gráfico com os dados obtidos no item 3.2.7, absorbância vs.comprimento de onda.
	Comprimento 
de onda
	 Absorbância 
nm
	400
	0,559
	410
	0,425
	420
	0,314
	430
	0,280
	440
	0,345
	450
	0,444
	460
	0,442
	470
	0,345
	480
	0,243
	490
	0,137
	500
	0,065
	510
	0,022
	520
	0,011
	530
	0,040
-Gráfico 2
5.QUESTIONÁRIO
5.1. Como podem ser definidas as enzimas? O que é substrato?
As enzimas são catalisadores biológicos que facilitam/aceleram reações, diminuindo a EA dos reagentes. Os reagentes são substratos enzimáticos, são eles que se ligam ao sítio ativo da enzima e sofrem sua ação.
5.2. Que fatores podem explicar a alta eficiência das enzimas como catalisadores?
Catalisadores são substâncias que aceleram a velocidade de certas reações químicas. As enzimas são altamente eficientes como catalisadores por diminuírem a energia de ativação necessária para que a reação aconteça. A interação entre substrato e enzima é mediada pelas mesmas forças que estabilizam a estrutura da proteína, incluindo ligações de hidrogênio, e interações hidrofóbicas e iônicas. A formação de cada interação fraca no complexo enzima-substrato é acompanhada pela liberação de uma pequena quantidade de energia livre que estabiliza a interação. Além disso, as enzimas são altamente específicas uma vez que no seu sítio ativo há grupos funcionais arranjados para formar interações fracas de uma forma ótima com um ou alguns determinados substrato. 
5.3. Qual a definição e o significado do Km e do Vmáxna reação. Veja as unidades.
Km, também conhecido como a constante de Michaelis Menten, equivale a concentração do substrato a qual é necessária para atingir a metade da velocidade máxima da reação (Vmáx). Dessa forma, o Km pode indicar a afinidade da enzima pelo substrato. Assim, quanto maior o valor de Km menor a afinidade da enzima pelo substrato, ou seja, maior concentração de susbtrato é necessária para atingir metade da velocidade máxima. As unidades utilizadas para representar o Km são unidades de concentração como g/L ou mol/L.
Vmáx significa a velocidade máxima da reação, que é atingida quando praticamente todas as moléculas estão na forma do complexo enzima-substrato, e a concentração de enzima livre é insignificante. Por isto, diz-se que a enzima esta saturada e não há mais um aumento da velocidade da reação, mesmo se a concentração do substrato for aumentada.Asunidade de Vmáx são (unidade de concentração) sobre tempo.
5.4. O que é inibidor enzimático e quais os principais fatores que diminuem a atividade de uma enzima para atuar como catalisador?
São moléculas que interferem com a catálise, diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticasde maneira reversível ou irreversível por mecanismos que não envolvem a desnaturação da mesma. Os inibidores reversíveis podem ser competitivos e não-competitivos. Os inibidores competitivos na sua maioria possuem estrutura molecular semelhante à do substrato, competindo com ele pelo sítio ativo da enzima. Em geral, a reação não ocorre enquanto o inibidor estiver ligado à enzima. Os inibidores não-competitivos: ligam-se a sítios distintos do substrato, sendo possível uma ligação simultânea do inibidor e do substrato à enzima. Porém, a enzima é inativada na presença do inibidor, estando o substrato ligado ou não. 
Os inibidores irreversíveis se combinam com um grupo funcional pertencente à molécula da enzima, e que seja essencial para a atividade da mesma. Esse tipo de inibidor pode, inclusive, promover a destruição desse grupo funcional. 
As enzimas tem sua atividade diminuída quando submetidas a pHs extremos, temperaturas elevadas, agitações mecânicas, solventes orgânicas, metais pesados e radiações UV. Estes fatores alteram a conformação da enzima (desnaturando), prejudicando a sua função biológica.
5.5. O que acontece se você mudar o pH ou a temperatura do meio reacional e mantiver a concentração da enzima e substrato constantes? Explique.
Cada enzima tem um pH ótimo (ou uma faixa de pH), no qual a atividade é máxima. A atividade é reduzida em pH maior ou menor, pois as cadeias laterais de alguns aminoácidos atuam como ácidos ou bases fracos e a mudança de pH pode protoná-los ou desprotoná-los.A temperatura também afeta a atividade enzimática, com o aumento desta pode inicialmente aumentar a velocidade da reação, uma vez que a energia cinética das moléculas aumenta. No entanto, chega um determinado momento em que ocorre a desnaturação da enzimática, e esta perde sua função catalítica. 
5.6. Cite dois exemplos de enzimas que atuam em sistemas biológicos e explique a atuação.
 – Amino transferase: pega o íon amônio que foi formado pela separação do grupamento amino de um aminoácido qualquer e transfere para o alfa-cetoglutaratotransformado-o em glutamato e este vai levá-lo até o fígado onde será transformado em ureia para ser excretado.
 – Amilases e proteases: degradam moléculas como o amido e proteínas, em moléculas menores. Facilitando a absorção no intestino. Assim, as enzimas hidrolisam as cadeias de amido em moléculas menores como a maltose e glicose, sendo assim, absorvidas.
5.7. Que tipos de resíduos químicos foram gerados neste experimento, e como foram tratados? Explique.
O extrato de batata é orgânico e não tóxico, podendo ser descartado na pia. As soluções preparadas foram coletadas em um recipiente especifico para posterior tratamento e descarte.
CONCLUSÃO
A partir dos dados de absorbância e concentração das soluções foi possível plotar os gráficos de absorbância versus o tempo para cada uma das soluções com diferentes concentrações e com eles determinar os valores de V0. Após isso geramos uma reta exponencial de . Fazendo os gráficos foi possível verificar o Vmáx (valor máximo da velocidade inicial quando todos os sítios ativos estão ocupados) pelo coeficiente linear, e Km (constante de Michaelis) pelo coeficiente angular. 
Porém o que pode ser observado foi que o gráfico de absorbância vs. Tempo não ficou como esperado, a absorbância deveria ser proporcional à concentração, ou seja, quanto mais concentrado maior deveria ser a curva. Isso pode ter ocorrido devido a erros experimentais.
O estudo da catálise de enzimas é de fundamental importância para a indústria farmacêutica. Isto porque se deve haver a preocupação quanto à degradação dos medicamentos no organismo, levando em consideração as enzimas capazes de acelerar o processo de absorção do fármaco. Ao mesmo tempo, as enzimas são muito utilizadas para acelerar as reações químicas e também para auxiliar os experimentos realizados em indústrias.
6.Bibliografia
6.1. Nelson, David L. & Cox, Michael M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5ª Edição. São Paulo: Ed. Artmed, 2011.
6.2. ATKINS, P.W., Physical-Chemistry, Oxford, 5a Edição, 1994. 
6.3. FLORENCE, A.T, ATTWOOD, D., Princípios Físico-Químicos em Farmácia, São Paulo, USP, 2003