Estudo dirigido 04 Diego Cunha

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Ministério da Saúde
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz
Disciplina: Avanços em Biologia Molecular
Discente: Diego da Silva Cunha
Estudo dirigido 03 ‐ PCR em tempo real (qPCR) (CG/LB)
Ler a metodologia do artigo de autoria de Torelli et al 2011 intitulado Diagnosis of Invasive Aspergillosis by a Commercial Real‐Time PCR assay for Aspergillus DNA in Bronchoalveolar Lavage Fluid Samples from High‐Risk Patients Compared to a Galactomannan Enzyme Immunoassay (Artigo 6, Pasta Artigos ‐ Sessão 
Considerando‐se a leitura do artigo, os parâmetros‐chave para otimização e validação dos ensaios com PCR quantitativo (figura abaixo), bem como, o MIQE Guideline (Pasta Referências), escreva um texto descritivo sobre o ensaio dos autores.
Obs: Aspergillus é um dos principais contaminantes em qualquer laboratório de pesquisa. (contamina tudo, já tive dor de cabeça com esse fungo)
Em biologia molecular a PCR quantitativo em tempo real (Real Time Quantitative PCR; curto: RTq-PCR ou qRT-PCR, também Real Time Detection PCR, curto: RTD-PCR) é uma técnica de laboratório baseada no princípio da reação em cadeia da polimerase para multiplicar ácidos nucleicos e quantificar o DNA obtido. A reação combina a metodologia de PCR convencional com um mecanismo de detecção e quantificação por fluorescência. Permite que os processos de amplificação, detecção e quantificação de DNA, sejam realizadas em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados e diminuindo o risco de contaminação da amostra e dando maior precisão.
No presente artigo, os autores abordam que as técnicas moleculares independentes da cultura, com foco os PCR em tempo real, oferecem o potencial para o diagnóstico precoce da doença aspergilose invasiva, podendo reduzir a taxa de mortalidade associada à doença. Porém, os testes baseados em PCR atualmente são excluídos da avaliação da doença, devido à falta de definição dos critérios de consenso quanto à padronização e validação clínica. Com isso realizaram um estudo prospectivo de centro único, sendo conduzido para investigar o desempenho do teste MycAssay Aspergillus comercialmente disponível para a detecção de DNA de Aspergillus em pacientes com suspeita de aspergilose invasiva. 
Como metodologia os autores examinaram 158 espécimes líquidos de lavagem broncoalveolar (BAL) que foram coletados consecutivamente de pacientes com hematologia (n. 68) e terapia intensiva (n. 90). Dezesseis de 17 (94,1%) espécimes de pacientes com aspergilose invasiva comprovada (provável) foram MycAssay positivos, e 15 desses 16 pacientes também foram positivos por um teste de PCR "interno". Tendo um total de 139 de 141 (98,6%) espécimes de pacientes sem aspergilose invasiva provada (provável) foram MycAssay negativos. E quinze dos 16 pacientes (94,1%) positivos para MycAssay também foram positivos para BAL Fluoractanífero Flutivo (GM) em um índice de corte de> 1,0 (intervalo de índice de 1,1 a 8,3), assim como 3 pacientes sem aspergilose invasiva, mas com fusariose pulmonar. Curiosamente, em sete dos espécimes BAL positivos para PCR que testaram a cultura positiva para as espécies de Aspergillus, os valores do limiar do ciclo foram anteriores aos dos espécimes com um resultado negativo da cultura. 
Os autores relatam que PCR em tempo real tem sido muito utilizada para auxiliar no diagnóstico de aspergilose invasiva em muitas abordagens baseadas em instituições, produzindo alta sensibilidade (66 a 100%) e especificidade (75 a 100%).
Resumindo, o PCR MycAssay Aspergillus aparentou ser um teste molecular sensível e específico para o diagnóstico de aspergilose invasiva, e seu desempenho é comparável ao do ensaio GM. Porém, os autores sugerem a necessidade de estudos mais aprofundados para estabelecer a utilização clínica em configurações de alto risco.