Ciclo do Ácido Cítrico

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Ciclo do Ácido Cítrico
O ciclo do ácido cítrico, também denominado Ciclo de Krebs ou ciclo do Ácido
Tricarboxílico (TCA) realiza a oxidação de combustíveis metabólicos. O ciclo do ácido cítrico é uma rota central para a recuperação de energia a partir de vários combustíveis metabólitos, incluindo carboidratos, ácidos graxos e aminoácidos, que são convertidos a acetil-CoA para a oxidação. O ciclo fornece uma série de reagentes para uma variedade de rotas biossintéticas.
O ciclo é uma série de oito reações que oxida os grupos acetil do acetil-CoA, formando duas moléculas de CO2, de maneira que a energia livre liberada é conservada nos compostos reduzidos NADH e FADH2. Seu nome é devido ao produto da primeira reação, o citrato. Uma volta completa produz três moléculas de NADH, uma de FADH2, um composto de alta energia (GTP ou ATP) e duas moléculas de CO2.
Sob condições aeróbicas, o piruvato entra na mitocôndria juntamente com H+ , através de uma proteína de transporte simporte (transporte de substâncias num mesmo sentido), para ser adicionalmente oxidado. O piruvato é convertido a acetil-CoA pela piruvato desidrogenase na presença de NAD+ , a qual realiza uma descarboxilação oxidativa. Os grupos acetil entram no ciclo como parte do composto de alta energia acetil-CoA (tio ésteres que possuem alta energia livre de hidrólise).
A piruvato desidrogenase é um complexo multienzimático (são grupos de enzimas associadas de modo não-covalente que catalisam duas ou mais reações sequenciais em uma rota metabólica). Complexos multienzimáticos representam aumento da velocidade de reações enzimáticas, canalização dos intermediários metabólicos entre enzimas sucessivas, minimizando reações secundárias e as reações são controladas coordenadamente.
O complexo piruvato desidrogenase catalisa cinco reações sequenciais com a seguinte estequiometria:
Cinco coenzimas são necessárias: o pirofosfato de tiamina (TPP), a lipoamida, a coenzima A, o FAD e o NAD+ . O processo pode ser acompanhado na figura abaixo:
	Etapa 01:
	
Figura 1: Processo de transformação do Piruvato ao Acetil-CoA através de um complexo multienzimático Enzima Reguladora: Citrato Sintetase
A síntese de citrato a partir de oxaloacteto e Acetil-CoA é uma condensação Aldol. Esta enzima (CS) pode formar uma ligação C-C diretamente, na ausência de íons metálicos como cofatores.
Em procariontes, CS é composta de seis subunidades idênticas. Em eucariontes, há duas isozimas (diferem na sequência de aminoácidos, mas que catalisam a mesma reação química): uma encontrada na matriz mitocondrial, e a segunda citoplasmática. Ambas parecem ser dímeros de cadeias idênticas.
Há um número de regiões similares na sequência da enzima em procariontes e eucariontes. Uma das mais bem conservadas contém uma histidina que é um dos três resíduos envolvidos no mecanismo catalítico da enzima mitocondrial de vertebrados. Esta região é a utilizada como assinatura de reconhecimento.
Produtos: Os íons citratos formam sais denominados citratos com muitos íons metálicos. O citrato de cálcio ou "sal amargo", por exemplo, é um importante citrato, que se utiliza geralmente na preservação e condimentação dos alimentos. Além disso, os citratos podem quelar íons metálicos, e utilizar como conservantes e suavizadores de água. O íon citrato é importante também na biossíntese de Ácidos Graxos e do Colesterol.
Figura 2: Íon Citrato
A ligação do oxaloacetato provoca uma mudança conformacional que forma o sítio de ligação da acetil-CoA, fechando o sítio de ligação do oxaloacetato de maneira que o solvente não pode alcançar o substrato ligado.
A His274 e His320, em suas formas neutras, e a Asp375 estão como catalisadoras gerais ácido-base.
1- A etapa limitante é a formação do enol acetil-CoA, que é estabilizado por uma ligação de hidrogênio ao ânion His274 resultante. O enol acetil-CoA ataca nucleofilicamente o carbono do grupo carbonil do oxaloacetato.
2 e 3- O intermediário resultante, a citril-CoA, é hidrolisado, produzindo citrato e CoA.
Etapa 02a: Enzima Reguladora: Aconitase (Aconitato hidratase)
A aconitase (também conhecida como Aconitato hidratase) é uma enzima metaloprotéica que catalisa a estereoisomerização reversível do citrato para o isocitrato via cis-aconitato no ciclo de Krebs. Em eucariontes duas isozimas são atualmente conhecidas: uma encontrada na matriz mitocondrial e outra no citoplasma.
A família aconitase possui outras proteínas. Como assinatura de reconhecimento utilizam-se duas regiões conservadas que contém as três cisteínas ligadoras aos íons.
Produtos: O único produto é o cis-aconitato que é o intermediário na reação de citrato para a formação do isocitrato no ciclo de Krebs.
	Etapa 02b:
	
Figura 3: Cis-Aconitato Enzima reguladora: Aconitase (Aconitato hidratase)
Produtos: O isocitrato é um intermediário no Ciclo de Krebs.
Figura 4: Isocitrato
Etapa 03a:
Enzima reguladora: Isocitrato-desidrogenase
Esta enzima é importante no metabolismo de carboidratos, e cataliza a descarboxilação oxidativa de isocitrato em a-cetoglutarato. É dependente de NAD+ .
Em eucariontes há pelo menos 3 tipos desta enzima. Duas estão localizadas na matriz mitocondrial (uma dependente de NAD+ e outra dependente do NADP+ ) enquanto a terceira é citoplasmática.
A região melhor conservada destas enzimas é uma sequência de resíduos rica em glicina, localizada na porção C-terminal. Estão relacionadas estruturalmente a esta enzima outras duas: A 3-isopropilmalato desidrogenase que cataliza o terceiro passo da biossíntese de leucina em bactérias e fungos; e a tartrado desidrogenase que cataliza a redução de tartrato a oxaloglicolato.
Produtos: O único produto formado é o Oxalosuccinato que é um intermediário no ciclo de Krebs. Também tem envolvimento no metabolismo do glioxalato e dicarboxilato ou em processo de fixação de carbono (Kyoto University).
	Etapa 03b:
	
Figura 5: Oxalosuccinato Enzima reguladora: Isocitrato-desidrogenase
Produtos: O -cetoglutarato é de fundamental importância em oxidação e biossínntese de aminoácidos, como no metabolismo do butanoato, do ascorbato e aldarato, na biossíntese da ubiquinona, degradação do triptofano e da lisina, entre outros.
Figura 6: a-cetoglutarato
	Etapa 04:
	
	Enzima reguladora:
	
Componente do complexo multienzimático 2-oxoglutaratodesidrogenase, responsável pela catálise da conversão total de a-cetoglutarato a succinil-CoA (um tioéster de alta energia) e CO2. Este complexo contém múltiplas cópias de 3 componentes enzimáticos: E1 – a-cetoglutarato desidrogenase; E2 – dihidrilipoamida succiltransferase; E3 – Lipoamida desidrogenase. A regulação acontece por feedback dos catabólitos. Se localiza na matriz mitocondrial.
Produtos: Além de ser fundamental no ciclo de Krebs, o Succinil-CoA é formado na degradação de metionina, isoleucina, valina. Tem sua importância na biossíntese da Porfirina e em processos envolvendo bases piramídicas, ácidos graxos de cadeia ímpar, no metabolismo do propanoato e na fixação de gás carbônico, entre outros.
Figura 7: Succinil-CoA
Etapa 05: GTP = Guanosina TriFosfato; GDP = Guanosina DiFosfato
Enzima reguladora: Succinil-CoA-Sintetase
Esta enzima acopla a clivagem da succinil-CoA de alta energia à sintese de um nucleosídeo trifosfato de alta energia: o GTP. ATP e GTP são rapidamente interconvertidos por meio da ação da nucleosídeo difosfatoquinase:
A reação ocorre em três etapas:
Figura 8: Ocorre a formação do Succinil-fosfato, um anidrido de alta energia.
Produtos: O Succinato se apresenta na síntese e degradação de corpos cetônicos, na síntese do aspartato, metionina, lisina e treonina, no metabolismo do propanoato, do butanoato e também na fixação de gás carbônico.
Figura 12: Succinato
Até a quinta etapa, o equivalente a um acetil foi completamente oxidado em duas moléculas de CO2, dois NADH e um GTP foram gerados. Para completar o ciclo, o succinatodeverá ser reconvertido a oxaloacetato. Esta conversão é alcançada pelas três reações restantes.
Figura 9: Formação do fosforil-His, um intermediário de alta energia, e o succinato. Figura 1: Transferência do grupo fosforil para o GDP, formando GTP. Figura 10: Transferência do grupo fosforil para o GDP, formando GTP.
Etapa 06: Enzima reguladora: Succinato desidrogenase
É centrada numa flavoproteína (FAD) contendo ferro-enxofre. Em bactérias, dois distintos complexos enzimáticos ligados à membrana são responsáveis pela interconversão de fumarato com succinato e redução do FAD a FADH2. Fumarato redutase é utilizada durante o crescimento anaeróbico. Ambos consistem de dois componentes principais: um componente extrínseco à membrana composto de uma flavoproteína que liga-se ao FAD e uma proteína ferro-sulfúrica; e um componente hidrofóbico composto de uma proteína ancorada à membrana e/ou um citocromo B.
Em eucariontes a succinato desigrongenase mitocondrial é uma enzima composta de duas subunidades: uma FAD-flovaproteína e uma proteína ferro-sulfúrica. A subunidade flavoproteína é uma proteína de 60 a 70KDa. O FAD está covalentemente ligado a um resíduo de histidina localizado na porção N-terminal da proteína. A sequência ao redor desta histidina é bem conservada de bactérias a espécies eucarióticas, e pode ser utilizada para reconhecimento.
http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/krebs.htm
A lógica química do... Ciclo de Krebs ��
Prof. Doutor Pedro Silva
Professor Associado, Universidade Fernando Pessoa
 
O piruvato produzido na glicólise ainda contém bastante poder redutor (verifique o estado de oxidação de cada um dos seus carbonos e compare-o com o estado de oxidação do carbono no CO2). Este poder redutor vai ser aproveitado pela célula no ciclo de Krebs. Em primeiro lugar, o piruvato é utilizado para produziracetil-CoA, que é uma forma activada de acetato (CH3COO-)
Nesta reacção intervém a piruvato desidrogenase. É uma enzima bastante complexa, que contém bastantes cofactores: lipoamida, FAD, coenzima A. A hidrólise da ligação tioéster (S-C=O) do acetil-CoA é bastante exergónica, pelo que a sua formação exige energia. Essa energia provém da descarboxilação do piruvato (note que o piruvato tinha três carbonos e a porção acetil do acetilCoA apenas possui dois: o grupo carboxilato migrou como CO2). A energia proveniente de descarboxilações é frequentemente usada pela célula para empurrar um equilíbrio no sentido da formação de produtos, como se verá em várias reacções do ciclo de Krebs e na gluconeogénese.
Na primeira reacção do ciclo de Krebs, o acetil-CoA é adicionado a oxaloacetato, dando origem a citrato, numa reacção de adição aldólica. A hidrólise do tioéster ajuda a deslocar o equilíbrio no sentido da formação de produtos:
O citrato é depois isomerizado a isocitrato. Este é então descarboxilado a a-cetoglutarato. Se o citrato não tivesse sido isomerizado a isocitrato antes da descarboxilação, esta produziria um composto de carbono ramificado, mais difícil de metabolizar.
Tal como o piruvato, o -cetoglutarato é um -cetoácido, i.e., possui um grupo carbonilo adjacente ao grupo ácido carboxílico. É portanto de prever que reaja exactamente como o piruvato, i.e., que a sua descarboxilação forneça energia suficiente para que se forme uma ligação tioéster com a coenzima A. E é isto que de facto ocorre... A enzima responsável por esta reacção, a -cetoglutarato desidrogenase, é aliás bastante análoga à piruvato desidrogenase na sua composição e cofactores.
A ligação tioéster do succinil-CoA é, como todas as ligações tioéster, bastante energética.A sua hidrólise vai constituir o único ponto do ciclo de Krebs onde ocorre produção directa de ATP (ou equivalente).
O succinato é, tal como o oxaloacetato, um produto com quatro carbonos. A parte final do ciclo de Krebs consiste em regenerar o oxaloacetato a partir do succinato. O succinato é primeiro oxidado a fumarato, pelo complexo succinato desidrogenase (também denominado complexo II), que se encontra na face matricial da membrana interna da mitocôndria. A oxidação de ligação simples a dupla (alcanos a alcenos) tem um potencial demasiado elevado para que os electrões possam ser aceites pelo NAD+ (E0=-320 mV). A célula utiliza portanto FAD (E0= 0 mV)como aceitador destes electrões. A hidratação do fumarato produz malato, que depois é oxidado a oxaloacetato, completando o ciclo. Uma sequência semelhante de reacções ocorre na b-oxidação dos lípidos.
O resultado do ciclo de Krebs é portanto:
Acetil-CoA + oxaloacetato + 3 NAD+ + GDP + Pi +FAD --> oxaloacetato + 2 CO2 + FADH2 + 3 NADH + 3 H+ + GTP
Bibliografia
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	Biochemistry, by Donald Voet & Judith Voet
Um excelente livro. Expõe a Bioquímica com referências constantes à química orgânica e à lógica bioquímica. A inspiração destas páginas.... Particularmente indicado a estudantes de Licenciaturas em Bioquímica, Ciências Farmacêuticas ou Química.
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	Biochemistry, Stryer
Um texto clássico, frequentemente actualizado e re-editado.
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	Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, Thomas Devlin
Aconselhado a estudantes de licenciaturas em Medicina, Enfermagem, etc. Imensos exemplos da aplicação da bioquímica a casos clínicos