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Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV Marcadores detectados pelos testes laboratoriais Os testes laboratoriais atuais podem detectar os seguintes marcadores da infecção pelo HIV: ■ ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA) proviral G ; ■ a proteína p24; e ■ anticorpos anti-HIV. Testes laboratoriais para o diagnóstico da infecção pelo HIV Os ensaios para o diagnóstico da infecção pelo HIV podem ser divididos em duas categorias: ■ Ensaios de triagem: apresentam elevada sensibilidade G e elevada especificidade G . ■ Ensaios confirmatórios ou complementares: apresentam, no mínimo, a mesma sensibilidade dos testes de triagem e necessariamente maior especificidade. Os ensaios para a detecção de anticorpos anti-HIV são baseados na reação entre antígeno e anticorpo. ■ Em 1985, surgiu a primeira geração de ensaios para o diagnóstico da infecção pelo HIV. Esses ensaios empregavam antígenos virais obtidos a partir da lise viral em cultura de células. A detecção de anticorpos era baseada na metodologia denominada ELISA indireto, detalhada na imagem abaixo: Legenda Fase sólida (Poço de uma placa de 96 poços) Antígeno de HIV (Ag) (Ligados à fase sólida – poço da placa) Anticorpo IgG anti-HIV (Ac) Conjugado (Conj) Peptídeos sintéticos ou proteínas recombinantes de HIV + enzima Substrato (S) (Cromógeno + H2O2) Incubação Incubação Lavagem Lavagem Degradação do substrato Reação de cor: presença de anticorpos Figura 1 – Representação esquemática de um ELISA indireto. ■ Em 1986, o diagnóstico laboratorial começou a ser realizado no Brasil. ■ Em 1987, surgiu a segunda geração de ensaios, que empregavam o mesmo formato indireto da primeira geração. A diferença entre essas duas gerações foi a utilização de antígenos recombinantes e peptídeos sintéticos originados de regiões específicas de proteínas do vírus. A introdução de antígenos recombinantes aumentou a sensibilidade e a especificidade dos ensaios. HIV - Estratégias para diagnóstico no Brasil Aula 04 -Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV ■ No início dos anos 90, o problema da variabilidade do HIV tornou-se evidente. Os ensaios passaram a incluir antígenos para o HIV-2, com o objetivo de possibilitar o reconhecimento de anticorpos anti-HIV-1 e anti- HIV-2. Adicionalmente, novos antígenos do HIV-1, grupos M, N e O foram incluídos. ■ Em 1994, surgiram os ensaios de terceira geração que passaram a utilizar um outro formato denominado ELISA sanduíche ou imunométrico, detalhado na imagem abaixo: Legenda Fase sólida (Poço de uma placa de 96 poços) Antígeno de HIV (Ag) (Ligados à fase sólida – poço da placa) Anticorpo IgG anti-HIV (Ac) Anticorpo IgM Anti-HIV (Ac) Conjugado (Conj) Peptídeos sintéticos ou proteínas recombinantes de HIV + enzima Substrato (S) (Cromógeno + H2O2) Incubação Incubação Lavagem Lavagem Degradação do substrato Reação de cor: presença de anticorpos Figura 2 – Representação esquemática de um ELISA sanduíche ou imunométrico. A modificação do formato dos testes para ELISA sanduíche tornou o ensaio mais sensível e específico, pois todas as classes de anticorpos anti-HIV (IgG, IgM e IGA) passaram a ser detectadas. Os ensaios de terceira geração reduziram o período de janela imunológica. A evolução tecnológica permitiu o desenvolvimento dos ensaios de quarta geração. Esses ensaios apresentam as mesmas características dos ensaios da geração anterior, mas são capazes de detectar também o antígeno p24. Atualmente, uma grande variedade de métodos manuais, semiautomatizados e automatizados baseados na reação antígeno-anticorpo está disponível para o diagnóstico da infecção pelo HIV. HIV - Estratégias para diagnóstico no Brasil Aula 04 -Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV Etapas do diagnóstico laboratorial O diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV em indivíduos com idade superior a 18 meses deve ser realizado em duas etapas: uma de triagem e, dependendo do resultado, uma segunda etapa para complementar o diagnóstico. ETAPA DE TRIAGEM – Métodos utilizados para o diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV Os métodos recomendados pelo Ministério da Saúde são: ■ Ensaio imunoenzimático – ELISA; ■ Ensaio imunoenzimático de micropartículas – MEIA; ■ Ensaio imunológico quimioluminescente – QL; ■ Ensaio imunológico com revelação eletroquimioluminescente – EQL; ■ Ensaio imunológico fluorescente ligado a enzima – ELFA; ■ Ensaio imunológico quimioluminescente magnético – CMIA; ■ Testes rápidos: imunocromatografia, aglutinação de partículas em látex ou imunoconcentração. ETAPA COMPLEMENTAR – Métodos utilizados para o diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV Os métodos que podem ser utilizados são: ■ Imunofluorescência indireta – IFI; ■ Imunoblot – IB; ■ Western Blot – WB. Atenção Além dos métodos já citados, podem ser utilizados outros, desde que estejam registrados na Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA – e validados pelo Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais. Escolha do teste laboratorial A escolha do teste laboratorial deve estar relacionada ao desempenho do método ou equipamento e envolve a exatidão, a precisão, a sensibilidade e a especificidade analíticas. A avaliação destas características requer estudos experimentais, utilizando soros padrão e amostras coletadas em populações com diferentes prevalências G da infecção. Considere também as seguintes questões técnicas: ■ É uma atualização tecnológica que auxilia na manutenção da competitividade? ■ O kit está registrado na Agência Nacional de Vigilância Sanitária? ■ O teste permite otimizar os fluxos e a carga de trabalho? ■ O teste permite a melhoria da eficiência do laboratório e rapidez no resultado? ■ Melhores níveis de desempenho técnico serão alcançados? ■ Reduzirá o volume de amostra, diminuindo o número de tubos coletados por usuário? ■ Qual o tipo de amostras e risco de manuseio, o rendimento do método, as condições de calibração, os controles, as medidas de segurança e a destinação de resíduos gerados? Atenção Não existem testes laboratoriais que apresentem 100% de sensibilidade e 100% de especificidade simultaneamente. Resultados falso-negativos, falso-positivos, indeterminados ou discrepantes entre distintos testes podem ocorrer na rotina do laboratório clínico. HIV - Estratégias para diagnóstico no Brasil Aula 04 -Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV Cálculo da sensibilidade e especificidade A sensibilidade e especificidade são calculadas a partir das fórmulas a seguir: VP = amostra verdadeiro positivo VN = amostra verdadeiro negativo FP = amostras falso-positivas FN = amostras falso-negativas Sensibilidade = VP VP + FN X 100 VN VP + FP X 100Especificidade = Veja o exemplo de aplicação dessas fórmulas ■ 200 amostras de soro foram previamente caracterizadas a partir de metodologia padrão. Destas, 150 eram amostras verdadeiro positivo e 50 verdadeiro negativo. ■ Quando submetidas a um determinado teste para verificação de sensibilidade e especificidade, apresentaram os seguintes resultados: ■ 148 amostras reagentes (verdadeiro positivo) e 2 amostras com resultado não reagente (falso-negativo); ■ 50 amostras não-reagentes (verdadeiro negativo), sem nenhum resultado falso-positivo. DADOS: Amostras verdadeiro positivo – VP = 148 Amostras verdadeiro negativo – VN = 50 Amostras falso-positivas - FP = zero Amostras falso-negativas – FN = 2 Sensibilidade = 148 148 + 2 X 100 50 50 + 0 X 100Especificidade = SENSIBILIDADE = 98,66% ESPECIFICIDADE = 100% Atenção Não existem testes laboratoriais que apresentem 100% desensibilidade e 100% de especificidade simultaneamente. Resultados falso-negativos, falso-positivos, indeterminados ou discrepantes entre distintos testes podem ocorrer na rotina do laboratório clínico. O resultado laboratorial indica o estado sorológico do indivíduo e deve obrigatoriamente ser associado à sua história clínica e/ou epidemiológica. HIV - Estratégias para diagnóstico no Brasil Aula 04 -Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV
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