apostila enterobacterias

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Provas bioquímicas para identificação de bacilos gram-negativos
	Esta aula tem como objetivo a identificação de enterobactérias em gêneros ou espécies, através da utilização de meios de cultura especiais que possibilitam a verificação da presença de enzimas bacterianas relacionadas ao metabolismo de vários substratos. As alterações nos meios produzidas pelo metabolismo bacteriano servirão de base para sua identificação de acordo com o esquema a seguir:
PLAQUEAMENTO SELETIVO
É a etapa de isolamento bacteriano a partir do espécime clínico, utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. A presença dos corantes eosina amarela e azul de metileno inibem as bactérias Gram positivas. Ao prepararmos este meio, a eosina e o azul de metileno reagem e formam o eosinato de azul de metileno (sal). As bactérias Gram negativas que fermentam lactose (LAC+) e, consequentemente, produzem ácidos que dissociam este sal, apresentando-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem um centro negro, devido ao azul de metileno, enquanto as não fermentadoras (LAC-) formam colônias transparentes.
CONFIRMAÇÃO BIOQUÍMICA
É um conjunto de provas bioquímicas necessárias para a identificação das colônias suspeitas. Serão utilizados os meios abaixo. Estes meios totalizam oito testes que somados ao da fermentação da lactose permitem identificar com fidelidade a grande maioria das enterobactérias isoladas em espécimens clínicos.
Meio EPM
O meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás a partir de glicose, produção de H2S, hidrólise da uréia e desaminação de triptofano.
B) Meio MILi
O Meio MILi contém os testes de motilidade, indol e descarboxilação de lisina.
C) Citrato de Simons
Este teste permite identificar espécies que utilizam citrato como única fonte de carbono.
2.1) Fundamento teórico:
Hídrólise da uréia: Este teste verifica a habilidade de um microrganismo em utilizar a uréia, formando duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease (uréia ( 2 NH3 + CO2 + H2O). 
Motilidade: O teste visa verificar se a bactéria é móvel ou imóvel. Logo pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros como por exemplo Enterobacter (usualmente +) e Klebsiella (-). A mobilidade das bactérias é proporcionada pela presença de um ou mais flagelos. As bactérias imóveis não possuem flagelos.
Produção de indol: Este teste tem como princípio determinar a habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da molécula de triptofano. Pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros de bactérias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do grupo Klebsiella-Enterobacter (-).
Citrato de Simmons: Este teste visa determinar se um microrganismo é capaz de utilizar citrato como uma única fonte de carbono para o seu metabolismo, resultando em uma alcalinidade no meio. As bactérias citrato positivas crescem usando sais de amônia como fonte de nitrogênio, liberando amônia e conseqüentemente deixando o meio alcalino. O indicador de pH é o azul de bromotimol, que em meio ácido fica amarelo e em meio básico, azul.
Produção de H2S: Este teste visa determinar a capacidade de produção de íons S-2 a partir do metabolismo bacteriano.
Produção de gás: Este teste visa determinar a capacidade de produção de gás CO2 a partir da fermentação da glicose.
Descarboxilação de lisina: Este teste visa determinar a capacidade de descarboxilar a lisina, por ação da enzima lisina descarboxilase.
2.2) Procedimento:
	Tocar a colônia com agulha bacteriológica e semear os 3 meios na seguinte ordem: Citrato, EPM e MILi. Para inocular o meio de citrato deslizar a agulha pelo centro estriando toda a superfície inclinanda. No meio EPM introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir o fundo do tubo.
2.3) Leitura e interpretação:
A) Meio EPM:
Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de cultura do fundo do tubo.
Produção de H2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade.
Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reação fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou não.
Desaminação do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na superfície do meio.
B) Meio MILi
Motilidade: 	A bactéria móvel cresce além da linha de picada. A imóvel somente nesta linha.
	Resultado
	Cor do meio
	Positivo (+)
	Crescimento fora do local da picada
	Negativo (-)
	Crescimento ao redor da picada
 
Descarboxilação da lisina: Quando a lisina é descarboxilada o meio adquire cor púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é utilizado, o meio adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores. Considerar o teste positivo sempre que o meio não estiver amarelo. 
Produção de indol: Adicionar 3 gotas a 4 gotas do reativo de Kovacs à superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não produz, o reativo mantém sua cor inalterada.
	Resultado
	Cor do reagente
	Positivo (+)
	Rosa
	Negativo (-)
	Amarelo
C) Meio Citrato de Simmons
			A utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor azul na superfície do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor do meio não sofre alteração.
	Resultado
	Cor do meio
	Positivo (+)
	Azul
	Negativo (-)
	Verde
SISTEMA NUMÉRICO PARA ENTEROKIT B
 
	As 9 reações bioquímicas do Enterokit B foram agrupadas em 3 conjuntos de provas. O resultado de cada um destes conjuntos produz um algarismo, de modo que o resultado dos 3 conjuntos produz um número de 3 dígitos, que identifica uma espécie bacteriana.
Os 3 conjuntos de provas e seus valores são:
�
	Primeiro algarismo (A)
	Segundo algarismo(B)
	Terceiro algarismo(C)
	Lactose 4
	Urease 4
	Indol 4
	Gás 2
	LTD 2
	Lisina 2
	H2S 1
	Mot 1
	Citrato 1
Observações: 
1) Para a interpretação das provas ver item Leitura e Interpretação.
2) Quando a reação da cepa investigada é positiva (+), colocamos o número correspondente. Exemplos: Urease + = 4, Lisina + = 2. Se a reação é negativa (-), colocamos para a mesma o valor 0. 3) Em seguida somamos os valores obtidos em cada série. O valor de A dá o primeiro algarismo, o valor de B dá o segundo e o valor de C dá o terceiro algarismo.
Assim por exemplo uma cepa que apresente o seguinte resultado bioquímico:
	Lactose - 0
	Urease +4
	Indol - 0
	Gás - 0
	LTD +2
	Lisina - 0
	H2S + 1
	Mot +1
	Citrato +1
	Total: 1
	Total: 7
	Total:1
terá o número 171 que corresponde na relação à bactéria Proteus mirabillis