tecnicasdeanalisede dna (1)

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Faculdade de Medicina da Universidade do Porto,
Departamento de Biologia Celular e Molecular
Técnicas de análise de DNA
aplicadas a diagnóstico
Porto, 18 de Abril de 2005
Ana Carrapa, turma 3
Ana Zão, turma 3
Joana Coelho, turma 9
João Santos, turma 9
Sara Pedrosa, turma 9
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Introdução
A história da genética médica foi revolucionada pelo trabalho de Watson e Crick, em 1953, onde foi proposta a estrutura de dupla hélice de DNA. Durante os últimos 20 anos a tecnologia do DNA recombinante tem vindo a desenvolver técnicas muito poderosas e sensíveis que são usadas no estudo e na identificação de anomalias moleculares.
O objectivo deste trabalho é abordar algumas dessas técnicas de análise de DNA, nomeadamente: “Polymerase Chain Reaction” (PCR), “Denaturing Gradient Gel Electrophoresis” (DGGE), “Restriction Fragment Length Polymorfism” (RFLP), Hibridação in situ e “Variable Numbers of Tadem Repeats” (VNTR), que permitam, de certa forma, a identificação de genes relacionados com doenças genéticas específicas, abrindo a possibilidade de diagnóstico.
	As principais áreas de aplicação destas técnicas moleculares de diagnóstico reflectem-se ao nível das doenças infecciosas, do cancro, das doenças genéticas, dos transplantes e da patologia clínica.
Técnicas de análise de DNA
PCR
O que é a PCR?
A PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia) é uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial selectiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma única célula. Esta técnica revolucionou o mundo científico e as suas aplicações são imensas: é usada no diagnóstico médico, mapeamento genético, detecção de doenças hereditárias, clonagem de genes, testes de paternidade, identificação de “impressões digitais” genéticas… De facto, a PCR revolucionou várias áreas como a Biologia Molecular, Patologia, Farmácia, Botânica, Medicina Forense e valeu o prémio Nobel, em 1993, a Kary Mullis. 
Objectivo
O objectivo da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima. O DNA molde sofre uma amplificação controlada por enzimas, obtendo-se milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse. O molde pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla, como o DNA genómico: pode usar-se uma gota de sangue, um fio de cabelo, uma célula do epitélio oral, um blastómero… 
Em que consiste um ciclo de PCR?
Um ciclo de PCR (Fig.1) consiste em três fases: desnaturação do DNA molde (a 95ºC), ligação (“annealing”) dos primers (a 64ºC) e polimerização do DNA (a 72ºC). Na 1ª etapa faz-se a separação das cadeias de dupla hélice de DNA através do calor. Esta separação é essencial para que, na 2ª fase, dois primers de oligonucleótidos se liguem às sequências dos pares de bases complementares da cadeia molde. Estes primers são desenhados e sintetizados de modo a ligarem-se às extremidades opostas de cada uma das cadeias de DNA molde que se pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto de partida para a replicação de DNA e, na última etapa, faz-se a sua extensão. A enzima responsável por esta polimerização é a DNA polimerase termo-estável (Taq), tendo sido isolada a partir da bactéria termofílica Thermus aquaticus que vive em elevadas temperaturas. É essencial que a enzima usada seja estável ao calor, uma vez que os ciclos de PCR têm lugar a temperaturas situadas entre os 64ºC e 95ºC. Para executar este ciclo usa-se um termociclador, que faz variar de forma rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do ciclo. Normalmente são repetidos cerca de 30 ciclos, o que demora apenas algumas horas.
Assim, duas novas cadeias são sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo de PCR logo dá-se um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do que no início. 
Vantagens e limitações
O segredo do sucesso da PCR reside na capacidade que ela tem de amplificar uma sequência precisa de DNA aliada à sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade. Não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar (mesmo que se encontre misturado com DNA de outras espécies), uma vez que a especificidade da PCR é dada pelos primers. É uma técnica rápida, barata e segura. 
Contudo, a PCR também tem limitações, como a necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos. Outras desvantagens são a relativa facilidade com que ocorre contaminação da amostra por DNA estranho (uma vez que se trata de uma técnica muito sensível) e a limitada extensão da sequência que é possível amplificar (é difícil aplicar a PCR a sequências maiores do que 5kb). Pode também ocorrer incorporação errónea de bases durante a replicação.
Aplicações
Os resultados da PCR são úteis no diagnóstico, prognóstico, determinação da terapia a ser utilizada, e até mesmo na avaliação da susceptibilidade a doenças. A PCR é frequentemente utilizada na detecção de polimorfismos, mutações pontuais e infecção por microorganismos bacterianos ou virais antes da exteriorização patológica da sua presença. É particularmente importante na detecção do SIDA, pois consegue detectar o vírus HIV nas primeiras semanas após a infecção e mais rapidamente do que o método normalmente utilizado, o teste ELISA. A PCR procura directamente pelo DNA do vírus enquanto que o teste ELISA é mais indirecto, pois procura anticorpos que o organismo possa ter produzido contra o vírus.
Outro exemplo de aplicação da PCR é no DPI (diagnóstico pré-implantatório) e no DPN (diagnóstico pré-natal). A PCR pode ser usada em DPN em idades gestacionais tão precoces como as 9 semanas, permitindo, por exemplo, a detecção de células de um feto masculino em circulação no sangue materno, ainda que exista em quantidades muito reduzidas, e averiguar a compatibilidade entre o grupo sanguíneo da mãe e do feto. Permite ainda a detecção de várias anormalidades cromossómicas como a trissomia 21. Este exame ao diagnosticar previamente certas doenças, possibilita que os pais e equipa de saúde decidam antecipadamente a melhor atitude a tomar em relação a cada caso. 
DGGE
O que é a DGGE?
A electroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) é um método de separação electroforético baseado em diferenças no comportamento de desnaturação de fragmentos de DNA de cadeia dupla. 
Importância da DGGE
A DGGE é uma poderosa técnica de análise genética que pode ser usada para detectar directamente modificações de uma única base e polimorfismos em DNA genómico, DNA clonal e DNA amplificado por PCR.
Como se processa?
As moléculas do DNA desnaturam em segmentos específicos designados domínios de desnaturação, quando a temperatura ou a concentração do desnaturante se elevam (Fig. 2). A temperatura de fusão de uma cadeia dupla de DNA é influenciada simultaneamente pelas pontes de hidrogénio que se estabelecem entre pares de bases complementares e pela atracção entre bases adjacentes da mesma cadeia. Inicialmente, envolve a mistura de uma sonda de DNA de cadeia simples marcada radioactivamente com a cadeia dupla de DNA a ser examinado, sendo a última previamente aquecida de modo a tornar-se de cadeia simples. O DNA que é idêntico com a sonda de DNA formará um homoduplex, o qual, sob as condições desnaturantes do gel, permanecerá hibridizado. Utilizando um gel de poliacrilamida, que contém um gradiente linear de desnaturante (ureia ou formamida) é possível distinguir os homoduplex mutantes dos normais devido às diferentes propriedades de fusão das moléculas de DNA. Assim, qualquer má combinação do DNA em estudo com a sonda de DNA resultará no aparecimento de um heteroduplex, o qual, à medida que atravessa o gradiente desnaturante do gel, se desagregará, tornando-se de cadeia simples num dado ponto. Daqui resulta uma estrutura ramificada que apresenta menor mobilidade quando comparada com a do homoduplex, o que pode ser detectado por coloração ou por autorradiografia. A separação completa da cadeia é impedidapela presença de um domínio de fusão elevado, que geralmente é criado artificialmente numa extremidade da molécula pela incorporação de uma braçadeira-GC, que nunca desnatura nas circunstâncias escolhidas para a experiência. Isto é realizado durante a amplificação de PCR usando um primer de PCR com uma extremidade 5' que consiste numa sequência de GC-40.
Vantagens
1) Taxa e sensibilidade de detecção elevadas. 2) A metodologia é simples e usa-se um método de detecção não radioactivo. 3) Os fragmentos de PCR podem ser isolados a partir do gel e ser usados em reacções de sequenciação.
Limitações
1) Ao elaborar a DGGE desde o zero exige-se a análise por computador bem como experiências prévias. 2) É requerida a compra de equipamento específico. 3) Os primers são mais caros devido ao GC-40. Primers adicionais podem ser úteis na sequenciação. 4) A análise de fragmentos PCR com mais de 400pb é menos bem sucedida. 5) Os genes excepcionalmente ricos em GC não são analisados fàcilmente por DGGE. 6) O método envolve o uso do formamida.
Aplicações
Algumas das mais valiosas utilidades da DGGE na genética humana são a detecção directa de mutações numa única base causadoras de doença, a detecção de polimorfismos com sondas de DNA e a descoberta dos pontos de desnaturação de fragmentos de DNA. 
São conhecidos casos em que a DGGE, associada a outras técnicas como a PCR, foi o tipo de análise mutacional directa utilizado na avaliação de fetos em risco de apresentarem deficiência na enzima reductase da dihidropteridina (DHPR). Esta é uma doença hereditária autossómica recessiva causada por mutações no gene QDRP e resulta em hiperfenilalaninémia e deficiência em diversos neurotransmissores no SNC, sendo imprescindível o diagnóstico pré-natal nas famílias afectadas.
A DGGE é também um dos métodos de pesquisa genética de mutações responsáveis pela síndrome de neoplasia endócrina múltipla tipo1 (MEN1), uma doença autossómica dominante, caracterizada por tumores endócrinos da glândula pituitária anterior, glândulas para-tiroides e pâncreas. Esta doença é provocada por mutações do gene MEN1, um gene supressor tumoral.
Uma mutação de células germinativas já conhecida no gene da proteína precursora amilóide bem como mutações novas no gene PS-1 foram detectadas por DGGE em pacientes com doença de Alzheimer.
RFLP
O que é o RFLP?
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) é uma técnica em que os organismos podem ser diferenciados pela análise de padrões derivados da clivagem do seu DNA. Se dois organismos diferirem na distância entre os sítios de clivagem de uma endonuclease de restrição, o comprimento dos fragmentos produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima de restrição.
Metodologia
Para a detecção de RFLP’s, pode ser usada a metodologia de “Shouthern Blotting”, descrita em 1975 por Edmund Southern. Após restrição enzimática os fragmentos de DNA genómico são sujeitos a electroforese em gel e posteriormente transferidos para um suporte sólido de nitrocelulose através do arrastamento por capilaridade. Após hibridização com sondas radioactivas este processo possibilita a identificação, entre milhares de fragmentos de restrição obtidos, de sequências bem determinadas.
Aplicações
Com o aumento da informação da sequência genética um grande número de doenças genéticas podem ser determinadas através da análise do RFLP:
1) A anemia falciforme é uma doença genética em que ambos os genes no paciente substituem um T por um A na posição do meio do codão 6. Isto converte o codão GAG (para o glutamato) ao codão GTG (para a valina) e elimina e sequência reconhecida (CTGAGG que é comum aos codões 5, 6 e 7) e é cortada por uma das enzimas de restrição. Quando o gene normal (beta a) é digerido com uma enzima de restrição e os fragmentos são separados por electroforese a sonda liga-se a um pequeno fragmento (entre as setas vermelhas). Quando é o gene doente (beta s) a enzima não pode cortá-lo neste sítio, então a sonda liga-se a um fragmento muito maior (Fig. 3). Neste exemplo, uma mudança de um único nucleotídio produz o RFLP. Isto é uma causa comum de RFLP’s e estes polimorfismos são actualmente referidos como SNP’s (Single Nucleotide Polymorphisms).
2) A fibrose cística (FC) é uma doença hereditária que faz certas glândulas produzirem secreções anormais, resultando disso vários sintomas, os mais importantes afectando o trato digestivo e os pulmões. A FC é uma doença recessiva, pelo que qualquer pessoa com FC deve ser homozigótica para os alelos da doença. Se os progenitores requererem aconselhamento genético recorre-se à análise de RFLP que é realizada ao seu DNA. Os RFLP’s para a FC são conhecidos, portanto é fácil determinar se uma pessoa é homozigótica normal, heterozigótica portadora ou homozigótica com FC (Fig. 4).
Limitações
1) As mutações que causam a maior parte das doenças genéticas humanas são mais variadas do que a única mutação associada à anemia falciforme. 2) Existem muitas doenças que resultam de vários genes mutantes trabalhando juntos para produzir o fenótipo da doença. 3) Ainda existem doenças genéticas para as quais o gene ainda não foi descoberto. Até o gene poder ser localizado, clonado e sequenciado nenhuma sonda pode ser feita para o detectar directamente. 
Hibridação in situ
O que é a hibridação in situ?
A hibridação in situ é um método que permite identificar o locus cromossómico onde se localiza uma determinada sequência de DNA previamente clonada. Este método tem como princípio a complementaridade das bases que reage a organização de DNA.
Como funciona?
O DNA de um esfregaço metafásico e o DNA de uma sonda são transformados em sequências monocatenares através da desnaturação e posteriormente são postos em contacto em condições de hibridação. Assim a sonda vai hibridar com a sequência cromossómica onde se localizam as bases complementares. Visto que a sonda é previamente marcada (com um fluorocromo), o local de ligação torna-se visível o que permite identificar especificamente o local do cromossoma onde se localiza o gene ou a sequência não codificadora em causa.
A realização desta técnica pode ser feita usando uma única sonda ou até mesmo várias sondas, cada uma marcada com um fluorocromo diferente. Esta última técnica chama-se FISH “multiplex”. 
Os padrões de bandas de um cromossoma são diversos e depende da técnica usada e do corante.
Poder de resolução
O poder de resolução de FISH é limitado a cerca de 2 a 3 Mpb, em cromossomas metafásicos. Porém, em cromossomas interfásicos, a resolução é possível para valores acima de 50 Kpb. Se os cromossomas interfásicos forem tratados de forma a libertar fibras cromossomas das moléculas proteicas associadas os limites de resolução pode aumentar até valores da ordem de 5 Kpb.
Aplicações a diagnóstico
A técnica FISH permite detectar delecções de um locus autossómico específico, em células interfásicas. É também uma técnica muito útil para detecção rápida de alterações numéricas dos cromossomas em células interfásicas, recorrendo a sondas centrométricas. Com “FISH multiplex” e cariotipagem espectral é possível detectar rearranjos cromossómicos complexos.
Hibridação genómica comparativa
A técnica assenta na hibridação competitiva de uma mistura equimolar de dois tipos de DNA marcados com fluorocromos diferentes.
Permite detectar delecções ou duplicações de regiões cromossómicas específicas. Não detecta anomalias estruturais equilibradas como translocações reciprocas, inversões ou inserções.
VNTR
O que é o VNTR?
O VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) é uma metodologia que se baseia na existência de uma sequência repetitiva específica activa em diferentes indivíduos de uma população ou nos dois homólogos diferentes do cromossoma num indivíduo diplóide.
Uma repetição em série (“tandem repeat”) é uma sequência curta do DNA que é repetido na forma de “head-to-tail” num locus cromossómico específico. As repetições em série são evidenciadasao longo de todo o genoma humano; sendo que algumas sequências são encontradas em somente um local – um único locus – e o número de unidades repetidas varia entre indivíduos. Tais loci são denominados VNTRs. Um VNTR nos seres humanos é uma sequência de 17 pb do DNA repetida entre 70 e 450 vezes no genoma. O número total de pares de bases neste locus pode variar de 1190 a 7650. 
Importância
1) Permite auxiliar no diagnóstico de determinadas doenças, nomeadamente: diabetes tipo I, fenilquetonúria, cancro, entre outras. 2) Constitui um contributo na investigação forense na análise de impressões digitais.
Aplicação
1. (Fig.5) A) Nesta análise encontram-se sequências de DNA repetidas, tal como, CACACA…, as quais se localizam em várias posições (loci) no genoma humano. O número de repetições em cada série pode ser altamente variável na população, nomeadamente, de 4 a 40 em diferentes indivíduos. A série de nucleotídeos repetidos deste tipo é geralmente denominada como sequência microsatélite hipervariável (hypervariable microsatellite sequence), também conhecido como sequência VNTR. Devido à variabilidade nesta sequência em cada locus, os indivíduos herdam diferenciadamente dos seus pais e das suas mães de tal modo que dois indivíduos diferentes nunca contêm o mesmo par de sequências. Uma análise de DNA utilizando primers que ladeiam o locus produz um par de bandas de DNA amplificado de cada indivíduo, uma banda a representar a variável materna e outra a variável paterna. A extensão do DNA amplificado e a posição das bandas que esse produz após electroforese depende do número exacto de repetições no locus. 
B) O exemplo esquemático ilustrado evidencia que os mesmos três loci VNTR são analisados (requerendo três pares diferentes de primers oligonucleotídeos seleccionados especialmente) provenientes de três sujeitos (indivíduos A, B e C) produzindo seis bandas de DNA por cada pessoa depois de realizada a electroforese em gel de poliacrilamida. Embora alguns indivíduos tenha algumas bandas em comum, a maior parte dos moldes são distintos. As bandas referidas podem servir como impressão digital para identificar minuciosamente cada indivíduo como único. O quarto caso (F) contém o produto da mesma reacção levada a cabo por uma amostra forense. O material de análise para a realização do PCR pode ser um simples fio de cabelo ou uma gota de sangue. Quando analisada a variabilidade de 5 a 10 loci VNTR diferentes, a probabilidade de dois indivíduos diferentes possuírem os mesmos moldes genéticos é, aproximadamente, 1 em 10 biliões. Deste modo, analisando os resultados evidenciados é possível concluir que os indivíduos A e C podem ser eliminados da lista de suspeitos; enquanto o indivíduo B possivelmente cometeu o crime.
Uma abordagem semelhante é, nos dias correntes, frequentemente utilizada para testes de paternidade. 
2. Para identificar alguns dos factores genéticos que contribuem para a obesidade nas crianças da Europa Central e do Norte de África foi estudada a relação entre a transmissão de alelos no locus da insulina e o início precoce da obesidade. O polimorfismo no VNTR do gene da insulina está associado a variações na expressão deste gene. Assim, crianças que receberam um alelo classe I dos seus pais (e não das suas mães) tinham um risco relativo de ser precocemente obesas de 65-70%, sendo possível concluir que a transmissão paternal do alelo VNTR classe I INS (gene da insulina) predispõe a obesidade infantil.
Conclusão
A tecnologia de análise de DNA possibilitou o diagnóstico de inúmeras doenças genéticas. Neste momento, desempenha um papel crescente na pesquisa e diagnóstico deste tipo de patologias. Muitas vezes, o diagnóstico de uma doença não requer somente o uso de uma técnica, mas sim a conjugação de várias, visto existir complementaridade entre elas. O aumento de conhecimento e o desenvolvimento da técnica têm vindo a ser explorados e rapidamente transferidos para os laboratórios clínicos. Porém, a difusão e a transferência destas formas de tecnologia necessitam do desenvolvimento de protocolos e da equação dos problemas éticos associados.
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Fig. 1 – Ciclo do PCR.
Fig. 2 – A ligação de DNA em domínios discretos.
Fig. 3 - Linhagem de uma família em que o filho é o único a possuir anemia falciforme.
Fig.4 – Análise do RFLP para a FC.
Fig. 5 – Análise de impressões digitais na investigação forense.
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