Determinação de Proteínas em Alimentos

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Aminoácidos
	Unidades estruturais básicas das proteínas
Diferem entre si nas suas cadeias laterais, variando em
estrutura, tamanho e carga elétrica.
	Grupo amino	Átomo de hidrogênioGrupo carboxila
Cadeia lateral
	
	
	Aminoácidos
		20	aminoácidos	são	comumente	encontrados	nas
proteínas.
Só os aminoácidos L são constituintes de proteínas
	D-aminoácidos	(parede	de	células	bacterianas	e
antibióticos)
	Classificação dos aminoácidos
	
	Classificação dos aminoácidos
	De acordo com o tipo funcional da cadeia lateral
Alifático (Gly, Ala, Val, Leu, Ile);
Sulfurado (Cys, Met);
Hidroxilado (Ser, Thr);
Aromático (Phe, Tyr, Trp);
Cíclico (Pro);
Básico (Lys, His, Arg, Asn, Gln); Ácido (Asp, Glu).
	
	
	Essenciais
	Condicionalmente essenciais
	Não-essenciais
	Leucina
	Tirosina
	Glutamato
	Isoleucina
	Cisteína
	Alanina
	Valina
	Taurina
	Aspartato
	Triptofano
	Prolina
	Glutamina
	Fenilalanina
	Serina
	
	Metionina
	Arginina
	
	Treonina
	Glicina
	
	Lisina
	
	
	Histidina
	
	
	Classificação dos aminoácidos
	
	Peptídeos
	classificados cO
HC
3
OH
CH NH
	3	2
Leucina (Leu)
	2 Valina (Val)Leucina, Isoleucina e Valina são também 
omo aminoácidos de cadeia 
ramificada. 
O
NH
2
CH
3
HC
3
OH
Isoleucina
 (Ile)
O
NH
CH
3
HC
3
OH
	
		Cadeias	de	aminoácidos	conectados	por	ligações
peptídicas.
Oligopeptídeos: < 10 resíduos de aminoácidos.
Polipeptídeos: > 10 resíduos de aminoácidos.
	Peptídeos
	
	Introdução
	O
HN
2
CH
3
OH
O
HN
2
CH
3
OH
+
-
 H
2
O
O
HN
2
CH
3
NH
O
CH
3
OH
	O CH	O CH	O CHNH
3
NH
NH
3
NH
NH
3
HNOH
2
	CH	O CH	O CH	O
	3	3	3
	
	Proteínas
	São	polímeros	de	aminoácidos	interligados	por	ligações
peptídicas.
Ligação peptídica: união do grupo carboxílico (COOH) de um aminoácido ao grupo amino (NH2) de outro aminoácido com perda de uma molécula de água.
Constituição
C, H, O e N, podendo conter enxofre, fósforo, ferro, zinco e cobre.
	Teor de proteína nos alimentos
	Alimento
	Teor de proteínas (%)
	Leite
	3,5
	Carne
	25
	Ovo
	13
	Arroz integral
	7,5 a 9,0
	Arroz polido
	5,2 a 7,6
	Farinha de trigo
	9,8 a 13,5
	Macarrão, sêmola
	12,10
	Soja
	33 a 42
	Batata
	10 a 13
	Amendoim
	25 a 28
	Maçã
	0,3
	
	Importâncias 
das proteínas
Nutricional
Tecnológica
	Qualidade da proteína
	
	Qualidade da proteína
	Digestibilidade
Se refere ao aproveitamento biológico de uma proteína, definida como percentual do nitrogênio total ingerido que o organismo vivo absorve.
	
	Digestibilidade
	Qualidade proteica
	
	Qualidade da proteína
	Proteínas
Elevado valor biológico
Disponibilidade de aminoácidos essenciais
Digestibilidade destes aminoácidos
	
	Escore de aminoácidos corrigido pela digestibilidade da proteína (PDCAAS):
	Considera	a	quantidade	de	proteína	utilizável
biologicamente.
A proteína com PDCAAS igual ou próximo a 1 é considerada
de boa qualidade.
	Qualidade da proteína
	
	Proteínas vegetais
	Escore de aminoácidos corrigido pela digestibilidade da proteína (PDCAAS):
Exemplos:
	Alimento
	PDCCAS
	Caseína
	1
	Clara de ovo
	1
	Carne
	0,92
	Farinha de ervilha	0,69
	
		Fatores	antinutricionais:	alguns	vegetais	contêm
inibidores de tripsina e quimiotripsina, os quais prejudicam a digestão eficiente das proteínas.
Proteínas de origem animal são melhores do que as de
origem vegetal.
	Propriedades Tecnológicas
	
	Algumas aplicações de proteínas em alimentos
	Hidratação
Emulsificante
Espumante
Viscosidade
Formação de gel
	
	
	Propriedade
	Aplicação
	Fonte da proteína
	Emulsificação
	Sopas, molhos, salsicha 
	Carne, leite e ovos
	Viscosidade
	Sopas, molhos e sobremesas
	Gelatina
	Gel 
	Bolo, queijo
	Ovo, leite
	Espuma 
	Coberturas, sorvetes
	Ovo, leite
	Estrutura das proteínas
	
	Estrutura primária
	Existem quatro níveis de estrutura proteica: primária, secundária, terciária e quaternária.
	
	Sequência linear de aminoácidos
Varia em 3 aspectos: número, sequência e natureza dos aminoácidos.
	Estrutura secundária
	
	Estrutura terciária
	Apresenta estrutura:
α – hélice: os aminoácidos interagem com aminoácidos da mesma cadeia, formando um eixo em torno de si.
Folha beta (folhas pregueadas): a interação ocorre com aminoácidos
de cadeias diferentes.
	Estabilizada por pontes de hidrogênio	
	
	Ocorre quando a proteína sofre o maior grau de
enrolamento, formando uma estrutura tridimensional da proteína.
	Surgem as	pontes	de	dissulfeto	para	ajudar	a
estabilizar este enrolamento.
	Estrutura quaternária
	
	Desnaturação Proteica
	Ocorre quando duas ou mais cadeias polipeptídicas se associam por pontes de hidrogênio, ligações
hidrofóbicas e ligações iônicas.
	
	Definida como acarretando a
funcionalidade.
		a	alteração	da	conformação	proteica,
	perda	de	sua	atividade	biológica	e
	
	
	Desnaturação
		não	envolve	alterações	da estrutura
	
	
		primária,	mas
quaternária).
		de	todas	as	outras (secundária, terciária e
	Desnaturação Vantajosa
Inativação de microrganismos, inativação de enzimas, aumento da digestibilidade proteica e biodisponibilidade de aminoácidos.
Desnaturação Desvantajosa
Coagulação do leite UHT, exposição de grupos reativos
(SH sabor de leite cozido).
	
	
	
	
	Efeitos da desnaturação proteica
Redução da solubilidade
Altera a capacidade de fixação de água
Perda da atividade biológica e funcionalidade
Aumento da susceptibilidade à ação de proteases,
Digestibilidade
Aumento da viscosidade
Alteração da textura
	
	Métodos de determinação de proteínas
	Importância da 
determinação
Conhecer o valor nutritivo; 
Características de identidade 
e qualidade; 
Estimar o rendimento 
indústria;
Rotulagem nutricional 
obrigatória.
	
	
	Determinação de nitrogênio total
	Método oficial: Kjeldahl
Determina o nitrogênio total da amostra: N proteico e N não proteico
Constituído de três etapas: digestão, destilação e titulação
Considera que proteínas tem 16% de N em média:
	16 g N	100g proteínas
	1 g N	x g proteínas
a = 6,25 g proteínas
Fatores de conversão específicos para cada alimento
	Fatores de conversão
	Método oficial: Kjeldahl
	
	Kjeldahl - Destilação
	Digestão
Fundamento: decomposição da matéria orgânica com ácido sulfúrico, em excesso, e sob aquecimento
amostra+H
2
SO
4
CO
2
SO
+
2
+
NH
3+
H
2
O
NH
2
+
H
2
SO
4
NH
(
4
)
2
SO
4
sulfatodeamônio
Mistura Digestora
K
2
SO
4
⇒
aumenta o ponto de
 ebulição do H
2
SO
4
Cu SO
4
⇒
acelera o processo de oxidação da matéria 
orgânica
	
	(
NH
4
)
2
SO
4
2
NH
+
NaOH
4
OH+Na
2
SO
4
neutralização
(
)
NH
4
OH+H
3
BO
3
NH
4
H
2
BO
3
H
+
2
tilação)
O(des
NaOH
Amostra
Erlenmeyer com 
solução de H
3
BO
3
Depois da digestão o frasco de digestão é conectado
 no destilador de nitrogênio. 
Adiciona-se hidróxido de sódio, que converte o sulf
ato de amônio em gás amônia
Aamôniaformadaéliberadadasolução.
PordestilaçãoporarrasteavaporaNH
3
é
transferidadofrascodedigestãoparaum
em
contendo
ácido
bórico
erlenmeyer
excesso.
	Kjeldahl - Titulação
	
	Método Kjeldahl
		NH4H2BO3 + HCl		NH4Cl + H3BO3
O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio com ácido clorídrico (1 mol de ácido reage com 1 mol de amônia).
O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um fator apropriado	
	
	Vantagens
Aplicável para todos os tipos de alimentos (sólidos e líquidos)
Relativamente simples e barato
Método oficial
Adaptável para pequenas quantidades de amostra
Desvantagens:
Mede nitrogênio total
Demorado, geração significativa de resíduo
Reagentes perigosos
	Teste do Biureto (Riegler, 1914)
	
	Teste do Biureto (Riegler, 1914)
	Fundamento:
	Proteína
(ligaçõespeptídicas)
	pH alcalino	Complexo
	+ Cu2+	Proteína-Cobre
⇒ Os íons cúpricos se complexam com as ligações peptídicas em condições alcalinas formando composto de cor púrpura.
⇒ A intensidade da cor é proporcional a concentração de proteínas.
	
		Vantagens:	
⇒ Específico por não apresentar problemas de interferentes.
⇒ Simples, rápido e barato.
⇒ Determina proteína ao contrário do método Kjeldahl que determina N total.
Desvantagens: 
⇒ Necessidade de uma curva de calibração tomada com um padrão conhecido de proteína.
⇒ A cor formada não é idêntica para todas as proteínas, porém os desvios são menores quando comparada a outros métodos colorimétricos.
	Teste do Fenol / Lowry (Follin-Ciocalteau-Lowry) 
Fundamento:
⇒
Reduçãodoreagentedefenolpelosgruposaromáticosdasproteínas
Tyr,Trp),emmeioalcalino,dandoorigemaumcomplexoazul,e
(
medidaporumcolorímetro.
⇒
ReagentefenólicoFolin-Ciocalteau:ác.fosfomolíbdico-fosfotúngstico
⇒
Análisefeitaemumcolorímetro(750nm),utilizandoumacurva
padrão.
pH alcalino
Proteína
ligações 
(
peptídicas)
+
 Cu
2+
Complexo
Proteína-
Cobre
+
 Folin
-
Ciocalteu
Azul
	
	Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
	Vantagens:
⇒ Bastante sensível (100 vezes mais sensível que o método por biureto). 
⇒ Mais específico e apresenta poucos interferentes (sacarose em alta concentração).
⇒ Determinação direta da proteína.
Desvantagens: 
⇒ É lento (pode ser feito entre 1-1,5 h).
⇒ Operações múltiplas (muita manipulação).
⇒ Necessita de período de incubação entre a adição dos reagentes.
⇒ Necessita de uma curva padrão com proteína conhecida. ⇒ Intensidade da cor pode variar com a composição da proteína analisada
	Métodos Espectofotométricos (absorção UV)
	
	Métodos Espectofotométricos (absorção UV)
	Fundamento:
	⇒Proteínas	possuem	absorção	UV	em	280	nm
(aminoácidos	aromáticos:	tirosina,	triptofano	e fenilalanina).
as proteínas são solubilizadas numa solução tampão ou alcalina.
leitura da absorvância a 280nm.
	
	Vantagens:
⇒Rápido.
⇒Simples.
⇒Não destrutivo.
Desvantagens:
⇒Resultados	pouco	precisos	porque	depende composição dos aminoácidos.
⇒Ácidos nucléicos podem dar interferência na análise.
	da
	Turbidimétrico
	
	Turbidimétrico
	Fundamento: 
Medida baseada na turbidez causada pela proteína precipitada por agentes precipitantes (ác. tricloroacético, ferrocianeto de potássio e ác. sulfossalicílico)
Precipitante + proteína → turbidez
Mede-se o grau de turbidez.
Vantagens:
Rápido,
simples (proteínas líquidas, nas quais a proteína está em solução)
	
	Desvantagens:
Não indicado para amostras sólidas, pois a proteína deve ser extraída para uma solução
Os resultados variam com o tipo de proteína
Pode ocorrer precipitação de outras substâncias com as proteínas, causando interferência no método
Depende de padrões determinados por outros métodos
	Análise de aminoácidos
	
	Análise de aminoácidos
	• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC ou CLAE) :
Determina o perfil de aminoácidos na proteína.
A proteína é hidrolisada 	libera aminoácidos.
Cromatografias separam os aminoácidos
	
	Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC ou CLAE) :
Vantagens:
Preciso; 
Determina quantidades mínimas presentes no alimento: elevada sensibilidade
Desvantagem:
Custo elevado
	Métodos físicos
	
	Referências
	Não são muito utilizados:
índice de refração. densidade específica. viscosidade.
tensão superficial. condutividade. polarização.
	
	FENNEMA O. Quimica de los Alimentos. 2 ed. Editora Acribia, S.A. 2000.
CECCHI, H.M. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. 2 ed. Campinas:UNICAMP, 2003. 207 p.
SALINAS, R.D. Alimentos e Nutrição. 3 ed. Viçosa: Artmed Editora, 2000.
BOBBIO, F. O.; BOBBIO, P. A. Introdução à química de alimentos. 2 ed. São Paulo: Livraria Varela, 1992. 223 p.
MAHAN, L.K.; STUMP, S.E. Alimentos nutrição e dietoterapia. 9 ed. São Paulo: Roca, 1998.
POMERANZ, Y., MELOAN, C. Food analysis. 3rd Ed. New York: Chapman & Hall, 1994.
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