Microdeleções em Yq como causa de defeitos na produção dos espermatozóides

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Microdeleções em Yq são causas freqüentes de alterações na produção de espermatozóides. Quais testes podem ser utilizados para demonstrar essas alterações
Uma ampla gama de defeitos na espermatogênese, indo da Síndrome de Células de Sertoli exclusivas ao bloqueio de maturação espermática ou hipoespermatogênese têm sido associadas à essas microdeleções em regiões variadas de Yq, numa área conhecida como AZF (Azoospermic Factor).
A identidade molecular de AZF ainda é desconhecida mas um dos genes-candidato mais forte para ocupar o locus responsável pela espermatogênese parece ser DAZ (deletado na azoospermia), uma sequência consistentemente faltante em aproximadamente 14% dos homens azoospérmicos e em aproximadamente 10% dos oligospérmicos severos. Outras regiões também têm sido descritas como cadidatas em potencial ao gene da espermatogênese: a RBM1 e RBM2 (RNA binding mitif) e as regiões AZFa, AZFb e AZFc. A função predita das proteínas codificadas por essas regiões é a ligação ao RNA ou ao DNA de fita simples com a finalidade de regulação pós-transcripcional da expressão gênica.
A Procura do Fator de Azoospermia – AZF: Homens com deleção em DAZ podem produzir espermatozóides, ainda que em menor número e esses espermatozóides podem ser utilizados para ICSI. Gestações provenientes desses casos têm sido referidas na literatura. Uma vez que os espermatozóides contendo o cromossomo Y portador da mesma deleção presente no sangue periférico podem ter sido utilizados para a ICSI resultando em gestação e nascimento, se a o produto for um recém-nascido do sexo masculino, ele também será portador da mesma deleção e, consequentemente, do mesmo quadro clínico de azoospermia ou oligospermia severa. Assim, é muito provável que ocorra uma transmissão da infertilidade masculina de pai para filho.
Novos Exames: Testes genéticos para rastreamento de microdeleções nas regiões do cromossomo Y possivelmente relacionadas à infertilidade masculina são no presente, recomendáveis e aconselhamento genético para todos os homens inférteis com azoos ou oligospermia antes da aplicação das técnicas de R.A. são hoje uma realidade nos países do primeiro mundo.
Acredita-se que cerca de 15 a 20% dos casais tenha algum tipo de dificuldade para engravidar, necessitando de auxílio através de técnicas de reprodução assistida. Ao contrário do que se acreditava antigamente, no entanto, em metade desse casais o fator de infertilidade é masculino. Esses homens têm um amplo espectro de problemas na função gonadal que inclui azoospermia ou oligospermia com ou sem astenospermia e/ou teratospermia associadas.
A despeito da disponibilidade de inúmeros testes andrológicos para identificação da etiologia da afecção, em cerca de 50% desses homens não se pode encontrar uma explicação causal, passando a ser classificados como homens com infertilidade idiopática.
O desconhecimento da etiologia levou a um progresso pífio no sentido do desenvolvimento de terapias de correção ou melhora de quadros de oligo/asteno e/ou teratozoospermia, com resultados desalentadores e ineficientes. Em contrapartida, as técnicas de reprodução assistida, especialmente a injeção intra-citoplasmática de espermatozóides (ICSI) revolucionaram a abordagem do homem infértil, dando a eles possibilidade concreta de transpor o problema clínico e constituir sua própria família.
Como realizar o teste para pesquisa de microdeleções no Cromossomo Y
1. Cuidados na coleta: Exame é simples. Para o paciente consiste na retirada de 15 ml de sangue que deve ser colhido em EDTA ou em tubo Vacuntainer de tampa roxa.
O sangue deverá ser encaminhado preferencialmente às segundas e terças feiras.
O sangue coletado deve ser encaminhado o mais rapidamente possível, no próprio tubo de tampa roxa, em isopor com bolsa de gelo para manter o sangue resfriado.
Na impossibilidade do sangue ser encaminhado imediatamente, ele poderá permanecer na geladeira. Essa permanência não deve ser superior à 36 horas.
Em casos imprevistos, o sangue poderá ser congelado. porém, deverá ser encaminhado também congelado porque uma vez descongelado o sangue deve ser processado imediatamente.
2. O exame
A primeira etapa do teste é a extração do DNA contido nas células presentes no sangue. Após a extração do DNA ele é quantificado em gel de quantificação (que nos dá a concentração de DNA presente na amostra de sangue coletado). Após a quantificação o DNA é submetido à espectrofotometria, que avalia sua pureza. Caso o resultado indique presença de excesso de proteínas ou sais, a amostra deverá sofrer uma purificação.
Após a purificação o DNA é diluído para a concentração adequada a ser utilizada na reação em cadeia da polimerase - PCR.
2.1. O PCR
A Reação em Cadeia da Polimerase - PCR, é uma técnica para amplificação in vitro de sequências específicas de DNA, sistematizada e denominada por Mullis e seus colaboradores em 1987, o que lhe valeu o Prêmio Nobel.
A técnica consiste na síntese simultânea de fitas complementares de DNA alvo que é localizado por um par de primers. O primer é um pequeno segmento de DNA complementar à região do DNA que se deseja investigar a presença num determinado indivíduo. A reação é montada colocando-se em um tubo plástico o DNA do paciente, os primers específicos, uma enzima especial, a Polimerase, que faz a síntese da fita complementar ao DNA alvo e os recursos para que a síntese tenha êxito, que são os nucleotídeos (cada uma das 4 unidades básicas de composição do DNA).
O tubo plástico é então colocado em uma máquina denominada Termociclador que promove ciclos de aquecimento e resfriamento ao fim dos quais um grande número de cópias de DNA alvo é produzida. Em uma reação típica de PCR, o DNA dupla-fita (do paciente no caso) é denaturado por um rápido aquecimento à 90-95ºC (30 segundos a 1 minuto) seguido por breve resfriamento a 40-60ºC que permite o anelamento dos primers ao DNA alvo ao qual são complementares, seguido de novo aquecimento a 70-75ºC para que a extensão possa ocorrer, isto é, para que a síntese da cadeia complementar ao DNA alvo possa ser realizada com auxílio da enzima Taq polimerase. O resultado é a produção de um grande número de cópias do DNA alvo, com um tamanho específico em quantidade de pares de base.
A última etapa é a vizualização do produto de amplificação, possível através de eletroforese em gel de agarose, coloração do gel, vizualização com luz de ultra violeta e registro fotográfico.
A interpretação do resultado é simples, e consiste na presença ou não de uma banda no gel, na altura correspondente ao número de pares de base esperado para o fragmento que foi amplificado: quando a banda está presente, significa que o paciente possui aquele segmento de DNA, quando a banda não está presente, significa que o paciente não possui aquele segmento de DNA (deleção), ou o segmento está alterado não permitindo que o primer encontre seu alvo (mutação) ou a reação não foi realizada em condições ideais, devendo ser repetida. Para que possamos afirmar que um paciente não amplifica uma determinada região, deve-se repetir a mesma reação 3 vezes e em todas o produto deve estar ausente.
A Reação em Cadeia da Polimerase é um exame que visa a amplificação.
	
	DAZ
sy 129
P1= sy129-
Note que na 1ª coluna não apareceu a banda branca correspondente do produto da amplificação utilizando o primer sy129.