Relatório ténica mnp e membrana filtrante

Prévia do material em texto

INTRODUÇÃO
Microrganismos indicadores vêm sendo utilizados na avaliação da qualidade microbiológica da água há um longo tempo, e mais recentemente nos alimentos. Isto se deve ao fato da dificuldade encontrada na detecção de microrganismos patogênicos. Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que, quando presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação fecal, sobre a presença de patógenos ou sobre a deterioração do alimento. Os microrganismos indicadores ainda podem indicar as condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento dos alimentos. Os critérios a seguir definem o microrganismo ou o grupo de microrganismos como indicadores: 
a) Deve ser de rápida e fácil detecção. 
b) Deve ser facilmente distinguível de outros microrganismos da microbiota do alimento. 
c) Não deve estar presente como contaminante natural do alimento. 
d) Deve estar sempre presente quando o patógeno associado estiver. 
e) Seu número deve correlacionar-se com o do patógeno. 
f) Deve apresentar necessidades de crescimento e velocidade de crescimento semelhante às do patógeno. 
g) Deve ter velocidade de morte que seja semelhante à do patógeno e, se possível, sobrevivência levemente superior à do patógeno. 
h) Deve estar ausente nos alimentos que estão livres do patógeno, ou estar presente em quantidades mínimas. A bactéria Escherichia coli é utilizada como um indicador de contaminação de origem fecal presente em água desde 1892. 
E hoje também é utilizada como indicador de contaminação fecal da qualidade higiênico-sanitária do alimento. Esta bactéria, além de preencher todos os requisitos anteriormente citados também apresenta outras características que as classifica como um bom microrganismo indicador, como:
a) Habitat exclusivo do trato intestinal do homem e de animais de sangue quente.
b) Número elevado nas fezes. 
c) Alta resistência ao ambiente extra enteral. 
d) Técnicas laboratoriais rápidas, simples e precisas para detecção e contagem. Os coliformes totais são compostos por bactérias da família das Enterobacteriaceae (bactérias bacilares gram negativas). Designa fundamentalmente a presença da E.coli, pois seu habitat preferido tem sido evidenciado como sendo o trato intestinal
De animais, já que não persiste por períodos prolongados em outros ambientes. Neste caso sua presença indica as condições sanitárias do produto e da eventual ocorrência de enteropatogênicos. A constatação do significado maior destas bactérias no aspecto sanitário fez com que os padrões microbiológicos pertinentes se tornassem mais rígidos, estipulando ou a ausência da bactéria no alimento, ou limites máximos na faixa de 10 UFC/g, com tolerâncias maiores para produtos cárneos crus e outros alimentos onde é impossível o controle dos coliformes.
As técnicas de contagem em placas permitem a visualização da formação de colônias a partir de um número "fixo" de células viáveis.
São utilizadas, portanto, para se obter a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC) presentes na amostra da análise.
Os meios de cultura usados para a obtenção do número de colônias em uma amostra podem ser de uso geral, enriquecidos e acrescidos ou não de sistemas inibidores e/ou indicadores.
A aplicação das técnicas de contagem tem por base o uso de diluições em série, obtidas a partir da homogeneização de amostras sólidas e semi-sólidas ou a partir de inoculações diretas de amostras líquidas e de suas diluições.
As técnicas básicas de contagem em placas incluem semeadura em profundidade; distribuir as diluições em placas de Petri estéreis.
Acrescentar ágar, homogeneizar imediata e adequadamente. Deixar solidificar e incubar as placas (invertidas ou não), de acordo com as exigências de tempo, temperatura, tensão de oxigênio etc., requeridas pelo microrganismo a ser enumerado.
Já a técnica de Número Mais Provável (NMP) é um método que permite estimar a densidade de microrganismos viáveis presentes na amostra a ser analisada.
Esta técnica não permite a contagem "fixa" de células viáveis ou de unidades formadoras de colônias (UFC), como acontece com a técnica de contagem em placas.
Para a determinação do NMP, a amostra deverá ser diluída tantas vezes quantas necessárias para que a última diluição de 3, 5 ou 10 tubos apresente todos os resultados negativos. Quanto maior o número esperado do microrganismo pesquisado, maiores deverão ser as diluições usadas.
Quando não se pode estimar qual a diluição do alimento que oferecerá essa situação, é inoculada mais de 3 séries com diluições decimais.
Entretanto, na leitura final do NMP deverão ser consideradas somente as 3 diluições mais significativas.
O arranjo de número de tubos positivos das 3 diluições (ou as mais significativas) é transposto para tabelas estatísticas que informam o NMP para as diferentes combinações de tubos positivos e que também incluem os limites de confiança dos números mais prováveis dos microrganismos pesquisados em função da tabela em questão.
A expressão do NMP é feita somente por meio do número mais provável que corresponda ao arranjo de tubos positivos por série.
Em geral, as tabelas já estão corrigidas considerando g ou ml (e consequentemente, as diluições), para a obtenção do NMP.
A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP para 10, 1,0 e 0,1 g ou ml. Para a água, cujo resultado final deverá ser expresso em NMP por 100 ml, o número constante da tabela deverá ser multiplicado por 10.
O método da membrana filtrante é especialmente empregado para amostras com baixa contagem microbiana. Embora, relativamente grande volume de água (100 ml) pode ser passado pela membrana sem obstruí-la, somente pouca amostra de diluente homogeneizado de certos tipos de alimentos podem ser usados para uma membrana simples.
As membranas utilizadas são de celulose, com poros de tamanhos capazes de reter bactérias (geralmente 0,45μm), mas permitem que água ou diluentes passem por ela.
Provas bioquímicas importantes na confirmação dos coliformes fecais;
Produção de Indol: o teste visa a habilidade de um organismo produzir Indol à partir de triptofano. Organismos produtores de triptofanase degradam o triptofano produzindo indol mais ácido pirúvico mais amônia. O indol reage com paradimetilbenzaldeído presente no reagente de Kovacs, formando uma cor vermelha na camada de álcool. O HCl presente no reagente de Kovacs serve apenas para acelerar a reação.
Utilização do Citrato: o teste usado para determinar se o microrganismo é capaz de utilizar citrato como única fonte de carbono para o metabolismo, resultando em alcalinidade.
Um organismo que é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono, também utiliza sais de amônia presente no meio como única fonte de nitrogênio. Os sais de amônia são quebrados para dar amônia, resultando em alcalinidade.
A utilização do citrato (reação positiva) resulta numa reação alcalina e o indicador muda de verde para azul. Não havendo crescimento o citrato não é utilizado e a cor permanece verde.
Teste de Vermelho de Metila: o vermelho de metila é usado para testar a produção de ácido orgânico, formado durante a fermentação da glicose. O teste se baseia fundamentalmente na fermentação da glicose por certos organismos para produção de diferentes quantidades de ácidos: ácido acético, ácido lático, ácido, ácido fórmico, além de CO2, H2 e etanol.
Teste de Voges Proskauer: o teste de VP consiste em se detectar a presença de acetilmetilcarbinol ou acetoína, produzido pelo metabolismo de certos organismos.
Durante o processo de fermentação da glicose, determinados organismos produzem acetilmetilcarbinol ou acetoína, produto originário da condensação de moléculas de ácido pirúvico seguido de descarboxilação.
A reação de VP é atribuída à oxidação atmosférica da acetoína que é ransformada em diacetila, que reagindo com KOH e com a peptona constituinte do meio, produz coloração rósea ou vermelho. A reação de VP se processa muito lentamentee pode ser acelerada pela adição de certos catalisadores, como por exemplo o naftol.
Para padrões de potabilidade da água para consumo humano; água potável destinada à ingestão, preparação e produção de alimentos e à higiene pessoal, independentemente da sua origem; água que atenda ao padrão de potabilidade estabelecido e que não ofereça riscos à saúde; conjunto de valores permitidos como parâmetro da qualidade da água para consumo humano; conjunto de parâmetros caracterizados por provocar estímulos sensoriais que afetam a aceitação para consumo humano, mas que não necessariamente implicam risco à saúde; água submetida a processos físicos, químicos ou combinação destes, visando atender ao padrão de potabilidade.
Uma água é dita potável quando é inofensiva a saúde do homem, agradável aos sentidos e adequada aos usos domésticos. É importante para que uma água seja considerada potável, que na fase de tratamento sejam eliminadas todas as substâncias originalmente presentes que lhe confiram algum gosto ou cheiro peculiar. Paralelamente também não devem resultar alguma turbidez ou cor visual.
Em linhas gerais estes padrões são físicos (cor, turbidez, odor e sabor), químicos (presença de substâncias químicas) e bacteriológicos (presença de microrganismos vivos). Normalmente as legislações específicas de cada região ou país, regem-se pelas recomendações da Organização Mundial de Saúde (OMS).
OBJETIVO
Identificar presença de coliformes fecais na água através das técnicas: NMP (número mais provável) e membrana filtrante.
MATERIAIS E VIDRARIAS – PESQUISA PARA BACTÉRIA DO GRUPO COLIFORMES, TÉCNICA NMP (NÚMEROS MAIS PROVÁVEIS – TUBOS MÚLTIPLOS).
Tubos de ensaio (estéreis);
Tubos de Durham; 
Placas de petri (estéreis);
Pipetas bacteriológicas de 2 e 5 ml;
Laminas de vidro para microscopia; 
Caldo Lauril triptose sulfato (concentração dupla e simples);
Agar Emb (Eosina metileno blue);
Caldo BHI (brain heart infusion- com cepas controle);
Reagentes para coloração de gram;
Estufa bacteriológica- 35/37C°; 
Bico de Bunsen; 
Alça de platina; 
Agulha de platina;
Cuba para descarte de material contaminado; 
Agua.
MÉTODOS
Colocou-se 10 ml da água em 5 tubos de ensaio contendo 10 ml de caldo Lauril triptose sulfato (concentração dupla);
Colocou-se 1ml da água em 5 tubos de ensaio contendo 10ml de caldo Lauril triptose sulfato (concentração simples);
Colocou-se 0,1ml da agua em 5 tubos de ensaio contendo 10 ml de caldo Lauril triptose sulfato (concentração simples);
Encubou-se a 35°C por 48 horas.
MATERIAIS E MÉTODOS – ANALISE DE AGUA POR MEMBRANA FILTRANTE
Holder;
Kitassato; 
Membrana filtrante;
Placa de petri;
Ágar endo; 
Caldo triptona (1%);
Caldo VM e VP;
Reativo de kovacs; 
Hidróxido de potássio; 
Alfa naftol;
Reagentes para coloração de gram; 
Bico de Bunsen;
Alça de platina;
Agulha de platina;
Bomba a vácuo;
Tubos de ensaio;
Estufa bacteriológica (35/37 °C);
Frasco de vidro (estéril);
Agua destilada;
Citrato;
MÉTODOS
Coletou-se agua da cozinha dos funcionários;
Ligou-se o bico de Bunsen; 
Montou-se o holder previamente esterilizado; 
Lavou-se o holder com agua destilada (sem a membrana);
Flambou-se a pinça;
Retirou-se a proteção da membrana e colocou-se no holder;
Colocou-se 100ml da agua coletada;
Ligou-se a bomba a vácuo; 
Após a filtração dos 100ml da agua coletada, a membrana foi transferida para a superfície do meio contendo Agar endo; 
Descartou-se a agua q foi filtrada; 
Lavou-se o holder com 100ml de agua destilada; 
Incubou-se a placa à 35°C por 24 horas;
Após isso pegou-se 4 tubos de ensaio com (indol; citrato; VM; VP);
Após isso pegou-se uma placa de petri com E. coli; 
Flambou-se a alça de platina no bico de Bunsen e coletou-se uma amostra de E.coli; 
Contaminou-se o tubo de ensaio contendo citrato; 
Flambou-se a agulha de platina; 
Coletou-se uma amostra de E. coli e contaminou-se os 3 seguintes tubos de ensaio contendo (VP; VM; Indo);
Encubou-se a 35°C por 24 horas; 
RESULTADOS – PESQUISA PARA BACTÉRIAS DO GRUPO COLIFORMES TÉCNICA DO NMP – NÚMERO MAIS PROVÁVEL – TUBOS MÚLTIPLOS
LC (Lauril concentrado) - 
	Caldo Lauril Triptose Sulfato – Lauril concentrado (LC) – 10mL
	Não houve bolha de ar, não houve crescimento – não há coliformes fecais
LD (Lauril diluído) 
	Caldo Lauril Triptose Sulfato – Lauril diluído (LD) – 1mL
	Não houve bolha de ar, não houve crescimento – não há coliformes fecais
	Caldo Lauril Triptose Sulfato – Lauril diluído (LD) – 0,1mL
	Não houve bolha de ar, não houve crescimento – não há coliformes fecais
OBSERVAÇÕES: 
Incubou-se a 35ºC/48 h.
Não houve bolha de ar em nenhum dos tubos de ensaio (LC, LD) → não há crescimento de coliformes fecais.
Tabela NMP – 0 – 0 – 0 = 0 coliformes em 100mL da amostra.
RESULTADOS – MEMBRANA FILTRANTE – E. COLI
	Indol + Kovacs
	Coloração amarelada – negativo 
	Citrato
	Coloração verde – negativo 
	Vermelho de Metila (VM) + caldo VM
	Coloração avermelhada – positivo
	Voges Proskauer (VP) + alfa naftol + hidróxido de potássio (KOH)
	Coloração avermelhada ou rosada – negativo 
OBSERVAÇÕES:
Indol → triptofano (triptofanase) → indol → “relativo de Kovacs” (halo vermelho violeta)
Citrato → indol → coloração verde
Vermelho de Metila → via ácida mista: ácido lático, acético, álcool, CO2
Voges Proskauer → acetoína (acetil metil carbinol)
Com esses resultados, obteve-se presença da E. coli.
CONCLUSÃO
Realizando estas duas aulas práticas, que tinham como objetivo identificar a presença de coliformes fecais (no caso da Escherichia coli), observou-se que, na primeira aula, com água obtida em bebedouro comum, não foram encontrados coliformes, o que indica que a água está em bom estado para consumo. Já na segunda aula, com tubos contaminados propositalmente, o resultado se manteve no esperado, apresentando as características que apontam presença de E. coli.
Conclui-se então, que a Escherichia coli é de fácil identificação quando submetida a testes específicos para o seu “descobrimento” e que, por ser uma bactéria presente no intestino de animais endotérmicos, é o fator que define se um alimento está contaminado ou não.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Micro-organismos. Disponível em: http://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/22482/microorganismos-indicadores 
Acesso em: 26/08/2016
Tabela NMP. Disponível em: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABagUAE/tabela-nmp# 
Acesso em: 26/08/2016
Potabilidade de água. Acesso em:
http://www.precisionlabs.com.br/images/NOVA-PORTARIA-DEZEMBRO-2011.pdf 
Disponível em: 29/08/2016
	Saneamento de água. Disponível em:
http://www.dec.ufcg.edu.br/saneamento/Agua08.html
Acesso em: 29/08/2016 
	RODRIGUES, L. H. C.; Apostila de Apoio ao Componente Microbiologia Básica para o Curso Técnico. Página 82. 2011. 
	Acesso em: 26/08/2016