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Relatório Bioquímica - Bradford

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UNIVERSIDADE POSITIVO
ENGENHARIA DE ENERGIA
ANA HELENA KARPOVISCH
BEATRIZ DE OLIVEIRA KAISER
camila moscibrocki
KAREN TECHY IASTRENSKI
Larissa piasecki
WELITON DA MAIA
quantificação de proteínas pelo método de bradford
CURITIBA
2017
Data 16/10/2017 - Bioquímica Fundamental e Experimental (20716NF / NCT.0024_80)
Quantificação de Proteínas pelo Método de Bradford
Alunos: Ana Helena Karpovisch, Beatriz de Oliveira Kaiser, Camila Moscibrocki, Karen Techy Iastrenski, Larissa Piasecki e Weliton da Maia
OBJETIVO 
	O objetivo dessa aula prática é determinar a concentração de proteínas totais em uma amostra de extrato de maçã utilizando o método de Bradford.
METODOLOGIA 
Ao se trabalhar com enzimas ou outros tipos de proteínas, é comum realizar a quantificação dessas moléculas antes de etapas como o isolamento, separação ou análise por técnicas cromatográficas ou eletroforéticas. Diferentes métodos de quantificação de proteínas estão disponíveis, dependendo da precisão requerida e da quantidade e da pureza da proteína de trabalho. 
O método descrito por Bradford em 1976 é um dos mais utilizados para estimas a concentração de proteínas totais em uma amostra. Essa técnica é simples, rápida e sujeita a menos interferentes quando comparadas a outras. 
O reagente de Bradford contém como seu principal componente o corante Coomassie Brilliant Blue G-250 em solução ácida. Este, ao ligar-se às proteínas, tem a sua absorbância alterada de 465 nm para 595 nm. Esta interação entre o corante Coomassie com a proteína estabiliza a forma aniônica do corante, causando uma visível mudança de coloração: inicialmente castanho para tons de azul, de acordo com a concentração da proteína. 
Figura 1. Esquema da reação de Coomassie Blue. Fonte: http://qcbio.com/pierce/23236.htm
MATERIAIS E MÉTODOS 
Maçã
Água destilada
Solução-mãe de albumina de soro bovino (BSA) 600 mg/L para preparo da curva padrão
Reagente de Bradford
Estante e tubos de ensaio
Béqueres
Pipetas
Pipetadores
Cubetas
Vórtex
Espectrofotômetro (leitura a 595 nm)
Para a obtenção do extrato enzimático, a maçã foi lavada, descascada, batida no liquidificador e filtrada.
Os tubos de ensaio foram preparados da segundo a Tabela 1: 
	Tubo
	Concentração desejada da solução (mg/L)
	Volume de solução-mãe (mL)
	Volume de água (mL)
	Volume final (mL)
	1
	0 (branco)
	0
	1
	1
	2
	50
	0,1
	1,1
	1,2
	3
	100
	0,16
	0,84
	1
	4
	200
	0,33
	0,67
	1
	5
	400
	0,66
	0,34
	1
	6
	600
	1
	0
	1
Tabela 1. Preparo das soluções a partir da solução-mãe de albumina.
Depois de preparado os 6 tubos conforme instruções, foi adicionado 0,1 mL de cada diluição em novos tubos de ensaio. Em outro tubo de ensaio, foi adicionado 0,1 mL de amostra de extrato de maçã (tubo 7). Então foi adicionado 1 mL de reagente de Bradford em cada tubo e homogeneizado rapidamente no vórtex para então os tubos serem deixados em repouso em temperatura ambiente por 10 minutos.
Após descansadas, foi feita a leitura das absorbâncias das soluções no espectrofotômetro (595 nm) e feito um gráfico no Excel de Absorbância a 595 nm vs Concentração de proteína BSA com os dados obtidos.
Uma vez com o gráfico feito, foi traçada a regressão linear da curva para obtenção da equação da reta para poder ser feito o cálculo da concentração de proteínas totais.
RESULTADOS
O gráfico da Absorbância a 595 nm vs Concentração de proteína BSA pode ser visto na Figura 2: 
Figura 2. Gráfico de Absorbância a 595 nm vs Concentração de proteína BSA.
Também temos uma equação da curva como y = 0,001x + 0,54985, achando um x igual a 900. 
CONCLUSÃO
 
Os resultados obtidos na pratica de laboratório fez com que tivéssemos uma visão e um entendimento bem mais claro sobre o Método de Bradford, possibilitando um aprendizado melhor. 
QUESTÕES E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
Qual a curva de calibração encontrada para a solução padrão de BSA? Mostre o gráfico e a equação da reta obtida. 
y = 0,001x + 0,54985
Qual a concentração de proteína total presente na amostra? 
y= 0,001.x+ 0,54985
X = 900 
Encontre outro método utilizado para determinação de proteínas e descreva rapidamente seu fundamento.
Método Lowry: baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, (reagente Folin-Coicacalteau), a qual sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II) e produz um composto com absorção maxima em 750 nm.

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