Trabalho de Hormônios e Biossinalização

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Bioquímica
Hormônios e Biossinalização
Jeniffer Novais de Araujo 040746
Professores: José Carlos
Ricardo
Santo André 2017
Biossinalização – uma pequena apresentação do tema
A habilidade das células de receber e reagir a sinais vindos do outro lado da membrana plasmática é essencial para a vida. Em organismos multicelulares, células com funções diferentes trocam uma variedade de sinais, como informações sobre a concentração de íons e glicose nos fluidos extracelulares e as atividades metabólicas interdependentes que ocorrem em tecidos diferentes. Os sinais nos animais podem ser autócrino (agindo na mesma célula que o produz), parácrinos (agindo em um vizinho próximo) ou endócrinos (transportados na corrente sanguínea da célula produtora até a célula alvo distante). Em todos os três casos o sinal é detectado por um receptor específico e convertido em uma resposta celular. Embora o número de sinais biológicos seja enorme, como é a variedade de respostas biológicas a esses sinais, os organismos usam apenas alguns poucos mecanismos evolucionários para detectar sinais extracelulares e transformá-los em alterações intracelulares. Frequentemente, o resultado final de uma via de sinalização é a fosforilação de algumas poucas proteínas celulares alvo específicas que alteram suas atividades, e em consequência as atividades das células. As transduções de sinais são extraordinariamente especificas e delicadamente sensíveis. A especificidade é conseguida pela complementaridade molecular precisa entre o sinal e as moléculas receptoras mediadas pelas mesmas espécies de forças não covalentes que ocorrem nas interações enzima-substrato e antígeno-anticorpo. Nos organismos multicelulares a especificidade é mais desenvolvida porque os receptores para um dado sinal ou os alvos intracelulares de uma dada via de sinalização estão presentes em apenas certos tipos celulares. Três fatores são responsáveis pela extraordinária sensibilidade da transdução de sinal: a alta afinidade dos receptores para as moléculas do sinal, a cooperatividade na interação ligante-receptor e a amplificação do sinal pela cascata de enzimas (uma enzima associada com um sinal receptor é ativada e, por sua vez, catalisa a ativação de muitas moléculas de uma segunda enzima, cada uma das quais ativa muitas moléculas de uma terceira enzima,e assimpordiante).
	As quatro características dos sistemas de transdução de sinal
Especificidade
Amplificação
Dessensitização
Integração
Seis tipos de transdutores de sinais
Receptor associado à proteína G
Receptor tirosina-cinase
Receptor guanilil-ciclase
Receptor de adesão
Canal iônico com portão
Receptor nuclear
Biossinalização ou sinalização Celular.
As células recebem constantemente informação do meio extracelular, a qual tem de ser transmitida para o seu interior. As bactérias, por exemplo, recebem informação constante - através de receptores membranares - sobre o pH; nutrientes; força osmótica; oxigênio; luz; produtos tóxicos; entre outros fatores. Estes sinais são reconhecidos pelas células que desencadeiam uma resposta adequada ao estímulo que recebem. No caso de organismos multicelulares, a transmissão de informação ocorre igualmente entre as células com diferentes funções. Os sinais celulares nos animais podem classificar-se, consoante o local onde são produzidos e onde desempenham a sua função, em: autócinos (desempenham funções na mesma célula que os produzem), parácrinos (atuam numa célula vizinha) ou endócrinos (produzidos numa célula, transportados pela corrente sanguínea e atuando numa célula distante). Em qualquer dos casos, o sinal é reconhecido por um receptor que o converte num sinal celular.
A natureza do sinal recebido é diversa - podendo ser antígenos, fatores de crescimento, hormonais, neurotransmissores, entre outros - bem como a variedade de respostas a esses sinais. No entanto, os organismos possuem apenas um pequeno conjunto de mecanismos evolucionariamente conservados para detectar os sinais extracelulares e traduzi-los em mudanças intracelulares.
Transdução de sinal
As transduções de sinal são extremamente específicas e profundamente sensitivas. A especificidade é obtida através de uma perfeita complementaridade ao nível molecular entre o sinal e a molécula receptora. No que concerne à ligação química, esta complementaridade é mediada pelo mesmo tipo de forças que ocorrem na ligação entre a enzima e o seu substraro ou o anticorpo e antigénio.
Vias de Transdução de Sinal: Quando há um ligante ligando-se a um receptor, a ligação ligante-receptor não é suficiente. Muitas vezes, há uma proteína dentro da célula. É a proteína G, que ativar uma enzima efetora (adeniliciclase ou fosfolipase C), que vai produzir segundos mensageiros, que vão desencadear a resposta celular. 
O sinal representa a informação, que é detectada por receptores específicos. O sinal pode ser uma substância química, luz, hormônio, toque mecânico. Sempre vai haver conversão em uma resposta celular (contração, relaxamento, divisão, proliferação celular). Vários processos químicos estão envolvidos, principalmente na formação de segundos mensageiros.
A conversão da informação, a partir de uma mudança química, é chamada de transdução de sinal. É um processo universal, de praticamente todas as células vivas. 
Célula responde a: antígenos, sinais de desenvolvimento, fatores de crescimento, hormônios, luz, toque mecânico, neurotransmissores, odores, sabores.
Sinalização por moléculas secretadas: endócrina, parácrina, autócrina. Hormônios devem participar de processos de sinalização celular, pois antes os livros traziam o conceito de que hormônio tinha que ser uma substância produzida por glândulas.
Endócrina: o sinal é produzido por uma célula, cai na corrente sanguínea e atua num receptor de uma célula-alvo distante de onde ele foi produzido. 
Parácrina: Neurotransmissores: Uma célula pré-sináptica secreta substâncias por exocitose e vai ativar o receptor no neurônio pós-sináptico. O receptor está próximo à célula que produziu a substância.
Autócrina: A substância é secretada pela célula e o receptor pra substância está na própria célula. Ex: Prostaglandinas (autacóides). A plaqueta produz tromboxano e receptor para o tromboxano está na própria plaqueta. 
O tromboxano pode ter sinalização autócrina e parácrina, pois ele também causa vasoconstrição. Tanto aumenta a agregação de plaquetas pela ativação do receptor na célula, como vai atuar no vaso sanguíneo. A predominante é a autócrina. Podem existir substâncias com mais de um tipo de sinalização, mas uma delas será predominante.
Os receptores que transduzem o sinal transduzem a mensagem hormonal. “A mensagem é mais importante que o mensageiro.” Independente do mensageiro, a respostas é mais importante, pois se pode ter uma mesma substância ligando-se a receptores diferentes e produzindo respostas diferentes. Pode-se ter também substâncias diferentes, ligando-se em receptores diferentes e produzindo a mesma resposta. O que se altera é a via de transdução que o mensageiro está acoplado. 
Especificidade/complementaridade entre a substância e o receptor. Se não houver, a resposta não acontece.
Amplificação por cascatas intracelulares/enzimáticas. O sinal ativa uma enzima efetora, como a adeniliciclase ou a fosfolipase C, que produz segundos mensageiros(IP3 e DAG). Pode haver a ativação de outra enzima (PKC), que junto com os segundos mensageiros levam a ativação de outras enzimas, canais iônicos, proteínas.
Dessensibilização, adaptação, taquifilaxia: A substância liga-se ao receptor, mas o efeito esperado é reduzido ou nulo, pois os receptores estão “insensíveis”. Essa mudança pode ser uma mudança de conformação no próprio receptor ou o receptor internaliza-se para dentro da célula.
Receptor Beta-Adrenérgico: Se a adrenalina vem pelo sangue e se liga ao receptor Beta-1 cardíaco, vai ocorrer aumento da força e frequência cardíaca. Essa força e frequência não podem permanecer ativaso tempo todo, então o receptor muda de conformação e vai perder a sensibilidade ao ligante. 
Integração: sinais diferentes ligando-se a receptores diferentes, mas produzem a mesma resposta. Gastrina liga-se ao receptor de gastrina, acetilcolina liga-se ao receptor M3, histamina liga-se ao receptor H2 e ocorre aumento da produção de HCl no estômago. 
Fatores que contribuem para alta sensibilidade da transdução de sinal
Afinidade dos receptores
Cooperatividade na interação do ligante com o receptor. O grupo heme da hemoglobina tem a capacidade de se ligar a 4 moléculas de oxigênio. Cada oxigênio que se liga causa uma mudança na conformação da molécula de hemoglobina. Quando os quatro se ligam, a hemoglobina encontra-se no estado relaxado. A calmodulina tem quatro sítios de ligação pro cálcio, cada cálcio que se liga causa uma mudança conformacional de modo que o quarto cálcio liga-se muito mais facilmente que o primeiro.
Amplificação por cascatas enzimáticas
Canal Iônico aberto por ligante: receptor nicotínico da acetilcolina. É um tipo de receptor (canal iônico) aberto por ligante que tem dois sítios de ligação pra acetilcolina. Quando duas moléculas se ligam ao receptor, o canal se abre permitindo a entrada de sódio e consequentemente de Ca. Esse receptor possui o chamado Mecanismo de Comporta. Existe um “portão” que se abre quando a acetilcolina se liga. Esse portão não pode ficar aberto o tempo todo, então ocorre a fase de dessensibilização, fechando o canal iônico. A acetilcolina se desliga e pode ser recaptada pelo neurônio pós-sinaptico ou degradada pela acetilcolinesterase ou tenta ativar novamente o receptor.
Quando ocorre bloqueio da acetilcolinesterase, há uma ativação do S.N Parassimpático, causando aumento da produção de HCl, de saliva, de secreção, miose (contração pupilar), diminuição da frequência cardíaca
Receptores com atividade de Tirosina-Quinase: também chamados de receptores enzimáticos ou catalíticos. O receptor se autofosforila ao entrar em contato com a substância e pode transferir o radical fosfato para um canal iônico, enzima, proteína. Vimos que para haver reação de fosforilação, tem que haver ativação de uma quinase, a PKC. No caso da insulina, o próprio receptor tem atividade de quinase, por isso o nome de receptor com atividade tirosina quinase. Os únicos aminoácidos que podem ser fosforilados são serina, tirosina e treonina. Receptor de insulina é um dímero, tem duas alfa-hélices transmembrana(visto na aula passada)
A insulina pode atuar no metabolismo proteico promovendo síntese de novas proteínas. Quando ela se liga, o receptor se autofosforila e vai transferindo o fosfato para outras enzimas como a MEK, MAPK, RAFK. No fim, há a síntese de uma nova proteína. (SLIDE 20)
Ativação da glicogênio-sintase pela insulina: a liberação de insulina provoca ativação da glicogênio sintase e inativação da glicogênio fosforilase. O glucagon doa radical fosfato para a glicogênio fosforilase e esta se ativa. Ao mesmo tempo, doa o radical fosfato para a glicogênio-sintase, inativando-a. A insulina faz o contrário. Ela ativa a fosfatase, que retira o radical fosfato, ativando a glicogênio sintase e inativando a glicogênio fosforilase. 
Os transportadores de glicose, principalmente o GLUT4 são armazenado no interior de vesículas, principalmente das células musculares. Quando a insulina se liga ao receptor, este se autofosforila, transfere radical fosfato pra canal de Ca presente na membrana. O Ca entra e promove a fusão dessas vesículas. O GLUT4 então será mais expresso na superfície celular. Quanto mais GLUT4, mais glicose captada pela célula muscular. 
Insulina tem atividade de tirosina-quinase
Receptores de Serpentina/Metabotrópicos: acoplados a proteína G. Ex: receptor para a adrenalina. Essa transdução é definida por três componentes essenciais, um receptor de membrana (metabotrópico), proteína ligadora de nucleotídeos de guanina (liga GDP ou GTP) e uma enzima efetora que vai gerar segundos mensageiros (adenililciclase ou fosfolipase C). A adrenalina se liga ao receptor beta-adrenérgico, que é metabotropico e esse receptor está acoplado a proteína G. Se ele estiver ligado a GDP, a proteína G está inativa. Quando ocorre a ligação, a proteína G (sua subunidade alfa) expulsa o GDP e encaixa no GTP. Subunidade alfa junto com o GTP chega até a adeniliciclase. Esta é uma enzima efetora transmembrana que converte o ATP em AMPc. Este ativa a PKA (proteína quinase dependente de AMPc), que vai fosforilar outras proteínas, canais iônicos.
A adrenalina liga-se ao receptor beta-1(receptor do músculo cardíaco), beta-2 e beta-3. Todos eles ativam a adenililciclase. No beta-1, a PKA fosforila canal de Ca, causando contração cardíaca. No beta-2(pulmonar), a PKA fosforila canais para K, causando relaxamento. O beta-3 é responsável pela lipólise. *Beta-bloqueadores.
Receptores Alfa: Os alfa-1 ativam a fosfolipase C. Os alfa-2 inibem a adenililciclase. Se houver inibição da adenililciclase vai haver diminuição de AMPc, levando a efluxo de K (hiperpolarização. Relaxamento). 
Agonista alfa-2: Clonidina: utilizada pro tratamento da hipertensão. Ativa o receptor, que inibe a adenililciclase, diminui AMPc, saída de K
A PKA tem quatro subunidades, duas regulatórias e duas catalíticas. Quando 4 moléculas de AMPc ligam-se a subnidade regulatória, elas liberam a subunidade catalítica. Esta pega o fosfato a partir do ATP, doa pro substrato, liberando este fosforilado. 
A proteína G tem atividade de GTPase. Enquanto o hormônio estiver ligado ao receptor, a via de transdução está ativada, mas essa ativação não pode existir o tempo todo. Por isso, deve existir alguma forma de inativação da adenililciclase. A subunidade alfa da proteína G pode quebrar o GTP em GDP, inativando a proteína G. A subunidade volta pro complexo beta-gama (complexo com a três subunidades da proteína G: alfa, beta e gama).
Existem três tipos de proteína G, Gi, Gs e Gq. Gi e Gs estão ligadas a via da adenililciclase. Gs causa ativação da adenililciclase. Gi causa inativação (diminui AMPc, efluxo de K, hiperpolarização). Gq está acoplada a via da fosfolipase C.
O hormônio chega, liga-se ao receptor, que está acoplado a proteína G. A proteína Gq ativa(isto é, ligada a da GTP) migra pela membrana e ativa a fosfolipase C. O PIP2 presente na membrana vai sofrer ação da fosfolipase C e vai ser quebrado em IP3 e DAG. IP3 migra pro R.E. e liga-se ao receptor de IP3, que é um canal para cálcio, aumentando a liberação do íon. Este vai para o citosol e junto com o DAG ativa a PKC. Esta vai fosforilar canais pra Ca na membrana, o cálcio extracelular entra na célula. O cálcio que chega ao citosol e vai se ligar a calmodulina( 4 Ca2+ se ligam), tornando-a ativa (complexo cálcio-calmodulina). Ela vai ativar outra quinase, a MLCK (quinase da cadeia leve da miosina), fosforilando a cadeila leve da miosina. Então, os filamentos de miosina deslizam pelos filamentos de actina, promovendo a contração da musculatura lisa (PROVA). 
Receptores de Hormônios Esteroides: são receptores nucleares. Atravessam livremente a membrana e o receptor deles está localizado no núcleo da célula. O receptor para o hormônio pode estar no citosol, o hormônio se liga ao receptor e os dois migram para o núcleo. Pode acontecer de o hormônio “passar direto”, ligando-se a um receptor existente no núcleo. Nos dois casos, sempre haverá regulação da expressão gênica. 
Tamoxifeno: utilizado no tratamento do câncer de mama, funciona como anatagonista de receptor de progesterona. Ela é um hormônio esteroidal, atravessa livremente a membrana, liga-se ao receptor do núcleo e aumenta a divisão celular do tecido mamário.
Mifepristona: utilizada em pílulas do dia seguinte. A implantação do zigoto depende de progesterona. A mifepristona bloqueia o receptor de progesterona, causando uma descamação da parede do útero, impedindo a nidação. O uso prolongado pode causar infertilidade e câncer. 
O potencial de membrana é mantido pela bombaNa-K. Aumento da permeabilidade ao Na causa despolarização. Despolariza-se, abre canais pra cálcio, o cálcio entra e a célula se torna excitável. Quando o K sai da célula, repolariza, fecha canal de Na e fecha canal pra Ca. Isso é chamado de potencial de ação
Receptores serotoninérgicos: de serotonina. Também podem ativar canais iônicos
Receptores ligados a Guanililciclase: dependem da produção de óxido nítrico. Este é formado a partir da arginina. Arginina na presença de oxigênio sofre ação da enzima NO-sintase, que vai formar citrulina+NO. O óxido nítrico ativa a guanililciclase, que vai ser responsável pela conversão do GTP em GMPc. 
O óxido nítrico é uma substância relaxante, promove vasodilatação. É chamado de EDRF (fator relaxante derivado do endotélio). Sozinho, provoca relaxamento, mas quando é liberado, ativa a guanililciclase. O aumento da concentração de GMPc provoca vasodilatação. O GMPc pode levar a ativação de uma quinase chamada PKG(proteína quinase dependente de GMPc). Esta fosforila canais para potássio, abrindo os canais de K, causando a saída do íon (hiperpolarização da célula). A hiperpolarização reduz a entrada de Ca, provocando relaxamento. 
Viagra (Sildenafil): bloqueia a fosfodiesterase(PDE-5). A PDE-5 degrada o GMPc. A impotência é causada pelo aumento de PDE-5(a enzima está mais ativa) e consequente diminuição do GMPc, então não ocorre relaxamento. A ereção é causada por relaxamento. Ao bloquear a PDE-5, o sildenafil promove o relaxamento. Inicialmente utilizado para tratar angina do peito. 
Contra-indicações do sildenafil: Se um indivíduo normotenso ingere o medicamento, sua PA vai diminuir e será causada uma hipertensão de rebote (o organismo libera aldosterona, adrenalina)
ANF (Fator Natriurético Atrial): Quando a PA aumenta, devido ao aumento da concentração de Na no organismo, há a liberação desse fator. Este ativa um receptor com atividade guaniliciclase. A guanililciclase vai produzir GMPc, que vai causar relaxamento, diminuindo a PA. 
Toxina Colérica (PROVA): A toxina adiciona um resíduo de ADP-ribose a proteína Gs, o que causa perda da atividade GTPase pela Gs. Ocorre uma ativação permanente da proteína Gs, e consequente ativação permanente de adenililciclase. Aumenta a produção de AMPc, e isso aumenta o transporte ativo de sódio, a partir do intestino, causando diarreia intensa e desidratação. 
PDEs, de modo geral, são enzimas que degradam nucleotídeos cíclicos. A PDE-4 degrada o AMPc. A cafeína (aumenta produção de HCl) e teofilina(usada no tratamento da asma) são inibidores de PDE-4.
Receptores acoplados à Proteína G com produção de AMPc
Os receptores acoplados à proteína G (GPCR’s) são responsáveis pela grande maioria das respostas celulares a hormônios e neurotransmissores, bem como pelos sentidos da visão, olfato e paladar[1]. São membros de uma ampla família de receptores serpentina que transpassam a membrana celular 7 vezes e são alvos comuns para a formulação de fármacos pela indústria farmacêutica[2]. Cada vez mais tem sido percebido que a regulação e sinalização desses receptores são muito mais complexas do que originalmente previsto, incluindo vias independentes através da proteína G[3] [4]. Recentes análises do genoma humano demonstraram a existência de aproximadamente 800 únicos GPCRs, dentre os quais aproximadamente 460 são receptores olfatórios[5]. Baseado na similaridade dos segmentos desses receptores, eles podem ser organizados em 5 famílias: da Rodopsina (701 membros), dos receptores de adesão (24 membros), dos receptores frisados ou ligados ao paladar (24 membros), do glutamato (15 membros) e da secretina (15 membros)[6]. Os GPCRs têm uma estrutura bastante semelhante, com uma extremidade extracelular aminoterminal e uma carboxiterminal intracelular. Os segmentos transmembrana apresentam bastante homologia entre os diversos receptores. As estruturas com maior diversidade são as extremidades amino e carboxiterminal e os segmentos TM5 e TM6. A sequência com maior variabilidade estrutural é a aminoterminal, a qual é pequena (10 a 50 aminoácidos) para receptores de monoaminas e peptídeos e muito maior (350 a 600 aminoácidos) para receptores de hormônios glicoproteicos e os da família do glutamato e, principalmente, dos receptores de adesão[7]. A diversidade de ligantes naturais dos GPCRs é muito grande, variando de partículas subatômicas (fótons) a íons (H+, Ca++) e pequenas moléculas orgânicas, como peptídeos e proteínas[8]. Seus locais de ligação também são bem determinados: enquanto pequenos agonistas orgânicos se ligam aos segmentos transmembrana, hormônios peptídicos e proteínas se ligam preferencialmente à extremidade aminoterminal e às sequências extracelulares dos domínios transmembrana. No entanto, o tamanho molecular não é o critério para definição do local de ligação. Os hormônios glicoproteicos, glutamato e Ca2+ se ligam preferencialmente aos domínios aminoterminais grandes.
Ativação do receptor
Os receptores acoplados às proteínas G (GPCRs) podem ser ativados por ligantes como, por exemplo, hormônios, neurotransmissores, fatores de crescimento, odorantes e fótons de luz. Uma vez ativada, a proteína G intermedeia o processo de sinalização que é iniciado com a ativação do respectivo GPCR e termina com a resposta mediada pela ação de moléculas efetoras que incluem canais iônicos e enzimas que geram segundos mensageiros, como, por exemplo, a adenililciclase, a enzima que gera o segundo mensageiro AMP cíclico. Tais receptores compartilham uma estrutura comum caracterizada por sete domínios transmembranas, e uma característica funcional que é a ativação da proteína G dependente da ligação do agonista ao GPCR[11]. Diferentes classes de GPCRs ligam-se exclusivamente ou preferencialmente a uma proteína G específica. Diferenças na estrutura e na sequência dentre os diversos GPCRs possivelmente contribuem para diferenças no reconhecimento de um ligante e no acoplamento específico a uma determinada proteína G. Um modelo largamente divulgado a respeito do mecanismo funcional dos GPCRs sugere que os mesmos são proteínas dinâmicas, apresentando conformações diferentes que conseqüentemente podem ou não favorecer o acoplamento da respectiva proteína G. De acordo com este modelo, a ligação de um hormônio agonista estabilizaria a conformação que favorece a ligação com a proteína G, ativando, desta forma, o receptor.
Proteína G
Mecanismo de transdução
As proteínas G agem como interruptores, ou timing switches. Neste sentido, quando o GDP ligado às sub-unidades α β γ está presente, a sub-unidade α está associada com o dímero βγ, o mecanismo de transdução de sinal está "desligado" e a interação com o efetor não se concretiza. Os GPCR são as primeiras estruturas envolvidas na transdução celular. Logo após a interação do primeiro mensageiro com o GPCR, são vistas mudanças conformacionais na estrutura deste último, iniciando o ciclo de atividade da proteína G. A cascata de ativação intracelular inicia sua dinâmica graças à ação de uma proteína auxiliar chamada fator de troca de guanosina (guanosine nucleotide exchange factor - GEF) que desloca o GDP e dá lugar à ligação do GTP, configurando o estado ativo dessa proteína. Assim, a subunidade α dissocia-se do dímero βγ e inicia cascatas de sinalização intracelular. Isso resulta na ativação de efetores, tais como: adenilatociclases, pequenas GTPases, fosfolipases e cinases, em última análise podendo regular a expressão de genes envolvidos na sobrevivência, proliferação, diferenciação e outros processos celulares. Esse estado de ativação é mantido graças à ação da proteína inibidora da dissociação de guanina (guanine nucleotide dissociation inhibitor - GDI), que mantém o GTP ligado e a proteína ativa pelo tempo necessário[13] [14]. Mesmo as sub-unidades βγ também podem modular a atividade de determinados efetores. Uma atividade intrínseca da GTPase da sub-unidade α funciona como um regulador de tempo de reação, fazendo com que o GDP seja novamente formado e que a sub-unidade α reassumasua conformação "desligada". Finalizando o ciclo, o heterotrímero α β γ se associa novamente, aguardando que o receptor seja mais uma vez ativado para dar início a um novo ciclo.
Receptores Acoplados à Proteína G: 
A maioria dos hormônios polipeptídicos e mesmo o cálcio extracelular atuam em suas células-alvo através de receptores acoplados à proteína G (GPCRs). Nos últimos anos, tem sido freqüente a identificação e associação causal de mutações em proteínas G e em GPCRs com diversas endocrinopatias, como diabetes insipidus nefrogênico, hipotiroidismo familiar, puberdade precoce familiar no sexo masculino e nódulos tiroidianos hiperfuncionantes. Nesta revisão, abordamos aspectos referentes ao mecanismo de transdução do sinal acoplado à proteína G, e descrevemos como mutações em GPCRs podem levar a algumas doenças endócrinas. Finalmente, comentamos a respeito das implicações diagnósticas e terapêuticas associadas com o maior conhecimento dos GPCRs. 
Sinalização Proteína G-dependente
Existem três principais vias de sinalização da proteína G, mediadas por quatro isoformas de proteínas G distinguidas umas das outras por homologia de sequência, em relação a subunidade α, sendo as três principais: Gs, Gq e Gi. Cada isoforma de proteína G consiste de múltiplas proteínas, cada uma sendo produto de múltiplos genes e/ou variações gênicas, que podem transmitir-lhes diferenças no que diz respeito às propriedades de sinalização.
Proteína Gs
A proteína Gs (estimulatória), que ativa a adenilatociclase – enzima intracelular aderida à membrana plasmática que catalisa a formação de 3’-5’ adenosina monofosfato cíclico (AMPc) a partir do trifosfato de adenosina (ATP) – está relacionada com o aumento da resposta celular. Assim, após a formação do complexo ligante/GPCR, a subunidade α da proteína Gs, que interage com o nucleotídeo guanílico, catalisa a troca de GDP por GTP, assumindo a forma ativa dessa isoforma. A porção α da proteína desloca-se então do dímero βγ e ativa a adenilatociclase, resultando no aumento substancial da concentração de AMPc[18][19]. O aumento na concentração de AMPc intracelular (na ordem de 10 nM) culmina na ativação da proteína cinase dependente de AMPc (PKA). Essa enzima é composta por duas subunidades: uma reguladora (R), com alta afinidade pelo AMPc, e uma catalítica (C). Na ausência de AMPc, a subunidade C é inativada pela formação de um complexo tetramérico R2C2. A ligação do AMPc à subunidade R induz mudanças conformacionais que resultam na dissociação da enzima inibida e consequente ativação da PKA, que em seguida pode fosforilar diversas estruturas intracelulares, obtendo uma resposta específica ao estímulo agonista[20].
Proteína Gq
A proteína Gq está envolvida na ativação da enzima fosfolipase C, que assim como a adenilatociclase participa da formação de segundos mensageiros. Depois de ativada, ela degrada o fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2), presente na membrana, em 1,4,5 trifosfato de inositol (IP3) e 1,2 diacilglicerol (DAG). Estes são os dois segundos mensageiros envolvidos nas respostas fisiológicas mediadas pela proteína Gq[21]. O IP3, dada sua estrutura hidrossolúvel, migra pelo citosol e se liga a receptores específicos de IP3 no retículo endoplasmático e mitocôndrias, promovendo a liberação do íon Ca+2 no citosol e aumentando a concentração desse íon de forma brusca até cerca de 10-6 M. O íon cálcio funciona como um terceiro mensageiro que desencadeia respostas intracelulares, como exocitose nos neurônios e nas células endócrinas, contração muscular e rearranjos do citoesqueleto durante os movimentos amebóides. O DAG fica associado à membrana plasmática devido à sua estrutura hidrofóbica, tendo a função de ativar a proteína cinase C (PKC), uma enzima ligada à membrana plasmática que promove a fosforilação de radicais em diversas proteínas intracelulares.
Proteína Gi
A proteína Gi (inibitória) inibe a atividade da enzima adenilato ciclase. Essa isoforma, relacionada com a diminuição da resposta celular, é responsável pela mediação dos efeitos inibitórios de receptores nessa via.
Considerações Gerais Sobre a Proteína G, Receptores Acoplados à Proteína G e o Ciclo da GTPase
AS PROTEÍNAS GS INTERMEDIAM A TRANSMISSÃO do sinal entre os receptores acoplados às proteínas Gs (GPCRs) e efetores múltiplos, tais como enzimas e canais iônicos. Os genes que codificam as proteínas Gs são membros de uma superfamília de genes que codificam proteínas que se ligam a nucleotídeos guanina com alta afinidade e especificidade (1). As proteínas Gs são heterotrímeras, constituídas pelas sub-unidades a, b e g. A sub-unidade a se liga aos nucleotídeos guanina enquanto as sub-unidades b e g formam um dímero, através de uma ligação não covalente mas suficientemente forte para funcionar como uma unidade (2). Já foram descritos 16 genes para as sub-unidades a, com graus de expressão e especificidade de ligação ao receptor e ao efetor variáveis. As proteínas Gs são intermediárias essenciais para o mecanismo de transdução de sinal, ligando-se a diversos GPCRs, localizados na superfície celular (3).
Aproximadamente 2000 GPCRs já foram clonados desde a clonagem pioneira da rodopsina bovina em 1983 (4) e do receptor b adrenérgico em 1986 (5). Estes receptores são classificados em mais de 100 sub-famílias, de acordo com homologia de seqüência, estrutura dos ligantes e função do receptor. Um grau considerável de homologia de aminoácidos pode ser encontrado entre membros de uma determinada sub-família, mas comparações entre diferentes sub-famílias resultam em pouca ou nenhuma homologia (6).
Os GPCRs podem ser ativados por ligantes como, por exemplo, hormônios, neurotransmissores, fatores de crescimento, odorantes e fótons de luz. Uma vez ativada, a proteína G intermedia o processo de sinalização que é iniciado com a ativação do respectivo GPCR e termina com a resposta mediada pela ação de moléculas efetoras que incluem canais iônicos e enzimas que geram segundos mensageiros, como, por exemplo, a adenilil ciclase, a enzima que gera o segundo mensageiro AMP cíclico. Tais receptores compartilham uma estrutura comum caracterizada por sete domínios transmembranosos, e uma característica funcional que é a ativação da proteína G dependente da ligação do agonista ao GPCR (7). Estruturalmente falando, todos os GPCRs apresentam um domínio extracelular amino-terminal, sete domínios transmembranosos, três alças extracelulares e três alças intracelulares, e um domínio intracelular carboxi-terminal. Cada um dos sete domínios transmembranosos geralmente é composto por cerca de 20 a 27 aminoácidos. Por outro lado, existe uma grande variação de tamanho no que diz respeito aos outros domínios que compõem os GPCRs, o que deve estar associada a uma diversidade estrutural e funcional. Exemplificando, o domínio extracelular amino-terminal pode variar de apenas sete aminoácidos a mais de 600 aminoácidos (6). Diferentes classes de GPCRs ligam-se exclusivamente ou preferencialmente a uma proteína G específica. Diferenças na estrutura e na seqüência dentre os diversos GPCRs possivelmente contribuem para diferenças no reconhecimento de um ligante e no acoplamento específico a uma determinada proteína G.
Na realidade, as diferenças mais marcantes entre os vários GPCRs residem nos sítios de ligação e na forma de ligação e geração do sinal, o que evidencia esta diversidade e ao mesmo tempo favorece a existência de múltiplas abordagens no que diz respeito a aplicações clínicas e voltadas para a indústria farmacêutica. Exemplificando, para ligantes pequenos como as catecolaminas, o sítio de ligação situa-se num "bolso" formado por vários domínios transmembranosos. Para hormônios polipeptídicos, o domínio extra-celular e uma ou mais alças extracelulares podem estar envolvidos na ligação do agonista. Já para hormônios glicoprotéicos e para o cálcio extracelular, o domínio de ligação parece residir no longo domínio extracelular característico destes receptores, para posterior interação com as alças extracelulares ou com osdomínios transmembranosos.
Já o acoplamento à proteína G topograficamente envolve as alças intracelulares e a porção carboxi-terminal intra-celular do receptor.
Um modelo largamente divulgado a respeito do mecanismo funcional dos GPCRs sugere que os GPCRs são proteínas dinâmicas, apresentando conformações diferentes que conseqüentemente podem ou não favorecer o acoplamento da respectiva proteína G. De acordo com este modelo, a ligação de um hormônio agonista estabilizaria a conformação que favorece a ligação com a proteína G, ativando, desta forma, o receptor.
Um aspecto funcional essencial no que diz respeito às proteínas Gs é o ciclo da GTPase. As proteínas Gs agem como interruptores, ou timing switches. Neste sentido, quando a conformação GDP+sub-unidades a, b e g está presente, a sub-unidade a está associada com o dímero bg, o mecanismo de transdução de sinal está "desligado" e a interação com o efetor não se concretiza. Uma vez que o agonista se liga ao GPCR, este receptor vai agir cataliticamente no sentido de liberar o GDP que estava fortemente ligado à sub-unidade a, permitindo a ligação do GTP a esta sub-unidade. Esta ligação faz com que a sub-unidade aassuma uma conformação "ligada", o que permite que esta se dissocie do complexo bg e que possa modular a atividade do efetor. Mesmo as sub-unidades bg também podem modular a atividade de determinados efetores. Uma atividade intrínseca da GTPase da sub-unidade afunciona como um regulador de tempo de reação, fazendo com que GDP seja novamente formado e que a sub-unidade a reassuma sua conformação "desligada". Finalizando o ciclo, o heterotrímero a, b e g se associa novamente, aguardando que o receptor seja mais uma vez ativado para dar início a um novo. Vale mencionar que modificações covalentes das sub-unidades a através da ação de toxinas bacterianas como as da cólera e pertussis, assim como diversas mutações ativadoras e inativadoras das sub-unidades a, podem modificar o ciclo da GTPase e conseqüentemente levar a diversos tipos de alterações hormonais que podem ser revisados em artigos específicos.
Mutações nos GPCRs foram observadas e relacionadas a um amplo espectro de doenças hereditárias e somáticas que variam desde de diferentes tipos de câncer até problemas como infertilidade (6). Estes receptores mutantes podem ser incapazes de gerar um sinal normal ou podem constitutivamente, independente da ligação de uma agonista, gerar um sinal. Além disso, o problema pode estar na expressão inadeqüada do receptor na superfície celular ou simplesmente pode envolver o impedimento da sua ligação ao agonista (6). A seguir, descreveremos algumas mutações ativadoras e inativadoras de GPCRs diretamente relacionadas com endocrinopatias.
Doenças Endócrinas Decorrentes de Mutações de GPCRs
Teoricamente, mutações em qualquer um dos componentes envolvidos no mecanismo de transdução de sinal acoplado à proteína G podem provocar uma doença. Entretanto, atualmente a grande maioria das doenças está relacionada à presença de mutações nos GPRCs e na sub-unidade a da proteína G. Genericamente, existem três determinantes principais sobre a expressão fenotípica de mutações em proteínas Gs e em GPCRs:
1 – O grau de expressão do gene mutado: neste caso, mutações num gene expresso de maneira difusa, como o Gsa, devem causar manifestações mais generalizadas do que aquelas causadas por mutações em um gene cuja expressão seja mais restrita (como por exemplo, um determinado receptor);
2 – O tipo de mutação em questão: germinativa (herdada) ou somática (pós-zigótica). Mutações em linhagens germinativas podem causar manifestações em todas as células onde o gene é expresso. Por outro lado, no caso de mutações somáticas, mesmo aquelas que envolvem um gene ubiqüitamente expresso, serão responsáveis por manifestações que estarão relacionadas às células derivadas do progenitor onde as mutações somáticas originalmente ocorreram;
3 – Ainda quanto ao tipo ou natureza da mutação: genericamente, as mutações podem ser classificadas como causando ganho (ativadoras) ou perda (inativadoras) de função.
Muitas das doenças provocadas por mutações nos GPCRs são doenças endócrinas. A maioria das endocrinopatias pode ser classificada como decorrente de hiper ou hiposecreção de um ou mais hormônios. Seguindo esta linha de raciocínio, mutações inativadoras em GPCRs em geral ocasionam doenças caracterizadas por hiposecreção hormonal, enquanto que mutações ativadoras geralmente estão relacionadas a excesso de secreção hormonal. Mutação inativadora de determinado GPCR causará resistência hormonal com um fenótipo clínico que se assemelha ao fenótipo causado pela deficiência do hormônio que normalmente ativa o receptor correspondente ou receptores. A resistência hormonal causada por mutações inativadoras de GPCRs é caracterizada por níveis circulantes aumentados do hormônio agonista correspondente. Já as mutações ativadoras levam a uma condição que se assemelha à hipersecreção do hormônio que normalmente ativa o GPCR envolvido, mas na realidade os níveis circulantes deste hormônio estarão suprimidos, refletindo assim a hipersecreção autônoma da glândula alvo (12).
Finalmente, uma variedade de polimorfismos em genes que codificam os GPCRs foram identificados. Em alguns casos, variações de seqüência de DNA que alteram a seqüência de aminoácidos foram descritas, mas o significado funcional destas alterações ainda é objeto de estudo, especialmente em doenças complexas que muito provavelmente envolvem uma herança poligênica. Como exemplos destes estudos, citamos a associação de um polimorfismo na região codificadora do gene do receptor b3-adrenérgico em relação ao diabetes mellitus do tipo 2 e à obesidade, e o polimorfismo do gene do receptor de glucagon relacionado à susceptibilidade ao desenvolvimento de diabetes mellitus do tipo 2 (12).
A – Doenças Endócrinas Causadas por Mutações Inativadoras (tabela 1)
Diversas doenças podem ser provocadas por mutações que podem prejudicar a função dos GPCRs mediante alteração em diferentes passos do ciclo de ativação (figura 2). Mutações inativadoras germinativas nos receptores dos hormônios adrenocorticotrófico (ACTH), tireoestimulante (TSH), liberador de TSH (TRH), liberador de hormônio de crescimento (GHRH), folículo-estimulante (FSH), luteinizante (LH) e vasopressina V2 foram identificadas como causas de resistência para seus respectivos hormônios. No caso do receptor sensível ao cálcio extracelular (CaR), mutações inativadoras germinativas levam a uma diminuição da sensibilidade ao cálcio extracelular.
Mutações inativadoras de ambos os alelos do receptor de ACTH (MCR-2) causam uma resistência adrenocortical ao ACTH com conseqüentes manifestações de deficiência isolada de glicocortióide, caracterizada por hipoglicemia e infecções freqüentes, além de deficiência na produção de andrógenos adrenais (13,14). O receptor adrenocortical de ACTH (MCR-2) é um dos vários receptores que compõem a família dos receptores da melanocortina, cujos outros integrantes são o MCR-1 (cujo ligante é o MSH) e três outros receptores (MCR3-5) (15). A hiperpigmentação observada nos casos de resistência familiar ao ACTH reflete uma estimulação dos receptores de MSH localizados na pele por níveis circulantes elevados de ACTH (15). Várias mutações pontuais já foram descritas no receptor de ACTH, sendo estas responsáveis pela deficiência familiar de glicocorticóide em muitas (porém não em todas) famílias estudadas (16,17). Recentemente, foi demonstrado que diversas mutações associadas com a deficiência familiar de glicocorticóide resultam em prejuízo da resposta máxima de AMP cíclico ou perda da sensibilidade para a geração do AMP cíclico. De qualquer forma, existe uma variação considerável no que diz respeito ao fenótipo, mesmo em pacientes que possuem a mesma mutação (18).
O fenótipo esperado decorrente de mutações inativadoras do gene do receptor do TSH deve estar relacionado a uma síndrome de resistência ao TSH, assemelhando-se ao observado em pacientes com mutações nopróprio gene do TSH. Uma mutação inativadora num resíduo de prolina altamente conservado localizado no quarto domínio transmembranoso do receptor de TSH foi identificada como causa do hipotiroidismo resistente ao TSH no camundongo hyt (19). Pacientes com mutações em ambos alelos exibem um grau de hipotiroidismo proporcional à extensão da perda de função. Portadores (heterozigotos) podem ser normais ou podem apresentar um aumento discreto do TSH plasmático (20). Ilustrando este fato, uma forma de hipotiroidismo congênito de herança autossômica recessiva foi relatado em três irmãs nas quais foram encontradas mutações pontuais distintas localizadas no domínio extracelular do receptor de TSH. Cada irmã afetada herdou um alelo paterno mutado (Isoleucina167Asparagina) e um alelo materno mutado (Prolina162Alanina) que, em conjunto (heterozigosidade composta), foram suficientes para causar uma marcante alteração laboratorial (TSH bastante elevado com hormônios tiroidianos normais), mas individualmente (ou seja, no pai e na mãe) estão apenas relacionados a um TSH levemente aumentado (21). Casos familiares de mutações inativadoras do receptor de TSH foram identificadas em programas de rastreamento do hipotiroidismo congênito em Bruxelas e artigos recentes reforçam a presença de mutações que geram perda de função do receptor do TSH como uma possível causa de hipotiroidismo congênito (22-25).
Collu e cols. (26) descreveram o caso de um menino com diagnóstico de hipotiroidismo central isolado, realizado aos 9 anos de idade. O estudo do gene do receptor de TRH deste paciente revelou que o mesmo era um heterozigoto composto, tendo herdado um alelo com uma mutação paterna e o outro alelo com uma mutação proveniente da mãe.
O assim chamado "little mouse" apresenta um nanismo por deficiência de GH causado por uma mutação inativadora num resíduo altamente conservado no domínio extracelular do receptor de GHRH, caracterizada pela troca do aminoácido ácido aspártico na posição 60 por uma glicina (27). Em humanos, a deficiência isolada familiar de GH pode ser causada por uma mutação no próprio gene do GH. Entretanto, em algumas famílias, esta doença não está ligada ao locus do gene do GH. Assim como no "little mouse", numa destas famílias com importante deficiência de GH, duas crianças que não apresentavam mutações no receptor de GH e não respondiam à administração a curto prazo ou mesmo crônica de GHRH, apresentaram uma mutação pontual homozigótica (Glutamato72stop) no receptor de GHRH. Estes pacientes responderam bem à terapia convencional com GH (28). Posteriormente, outras descrições de mutações no receptor de GHRH foram identificadas (29,30), destacando-se a descrição de uma nova mutação numa família brasileira (31).
Mutações inativadoras do receptor de FSH são responsáveis pelo desenvolvimento de disgenesia ovariana hipergonadotrófica. O reconhecimento de que alguns casos de disgenesia ovariana apresentam herança autossômica recessiva e estão ligados ao cromossomo 2p (onde está o sítio do gene do receptor de FSH) levou à identificação de uma mutação pontual homozigótica (troca de alanina na posição 189 por um resíduo de valina, no domínio extra-celular) no receptor de FSH de indivíduos afetados (32). Este estudo foi iniciado através da investigação de uma população finlandesa, onde um total de 75 pacientes portadoras de falência ovariana hipergonadotrófica foram estudadas (33). Estudos posteriores reforçaram que esta mutação é mais freqüente na população finlandesa, não ocorrendo com a mesma freqüência em populações de Singapura, Suiça e Dinamarca (34). Esta mutação não foi encontrada num grupo de pacientes brasileiras portadoras de falência ovariana prematura (35). Clinicamente, mulheres que têm esta mutação na forma homozigótica apresentam um cariótipo XX normal, desenvolvimento puberal normal com genitália interna e externa normais, desenvolvimento variável dos caracteres sexuais secundários e amenorréia primária (36). A resistência ao FSH na puberdade leva a uma parada da maturação folicular, com ovários pouco desenvolvidos. Mulheres heterozigotas são clinicamente assintomáticas. Homens homozigóticos para esta mutação inativadora foram identificados em famílias afetadas, mas as conseqüências fenotípicas são variáveis no que diz respeito ao comprometimento da espermatogênese, sem casos de infertilidade observados. Esta variação fenotípica nos homens reforça observações anteriores de que o FSH não é absolutamente necessário para a espermatogênese (33,35). Recentemente, novas mutações do gene do receptor de FSH foram descritas e estudadas (37).
Uma mutação inativadora homozigótica do receptor de LH, caracterizada pela substituição de uma alanina na posição 593 por uma prolina, resíduo localizado na junção do sexto domínio transmembranoso com a terceira alça extracelular, foi identificada em 2 irmãos, filhos de um casamento consangüíneo, e portadores de pseudohermafroditismo masculino (38). Ambos apresentavam-se como fenótipo feminino e cariótipo 46 XY com hipoplasia de células de Leydig causadas por falta de responsividade ao LH. A irmã 46,XX apresentava-se amenorréica (39). Formas mais leves podem ocorrer, manifestando-se como hipogonadismo hipergonadotrófico e micropênis. Uma mutação homozigótica localizada no sétimo domínio transmembranoso do receptor de LH foi identificada num paciente do sexo masculino que apresentava micropênis e resistência ao hCG (40). Recentemente, um caso de hipogonadismo masculino, caracterizado por retardo puberal, testículos pequenos e atraso na maturação óssea foi descrito num paciente cujo estudo revelou uma deleção homozigótica do exon 10 do receptor de LH (41). Nas mulheres, o fenótipo é variável: em estudo de sete irmãs de pacientes portadores de pseudohermafroditismo masculino devido à resistência ao LH, Arnhold e cols. (42) observaram que mulheres com resistência ao LH podem apresentar desenvolvimento mamário espontâneo associado a amenorréia primária ou secundária, infertilidade e níveis elevados de LH, aumento da razão LH/FSH e ovários normais ou císticos. Gradativamente, mais mutações inativadoras do receptor de LH estão sendo descritas (43,44).
Com a clonagem do gene do receptor sensível ao cálcio extracelular por Brown e cols. em 1993 (45), rapidamente e sucessivamente foram identificadas diversas mutações neste receptor (46). Tais mutações, quando associadas com perda de função do receptor, podem ser responsáveis por dois fenótipos: quando herdados de forma autossômica dominante, a doença em questão é a hipercalcemia hipocalciúrica familiar benigna, que via de regra é assintomática. A segunda doença é extremamente grave e pode ser letal caso não diagnosticada e tratada a tempo: é o hiperparatiroidismo neonatal severo, cuja herança na maior parte das vezes é autossômica recessiva (47).
O diabetes insipidus nefrogênico (DIN) é caracterizado pela incapacidade de concentrar a urina apesar de uma secreção elevada de vasopressina. Existem pelo menos duas formas familiares, herdadas de forma autossômica recessiva (cerca de 10% dos casos) e ligada ao X (cerca de 90% dos casos) (48). A forma autossômica recessiva é explicada por mutações inativadoras no gene da aquaporina-2 (AQP2), que codifica um transportador de água de membrana em túbulo renal, sendo este o alvo distal da ação do AMP cíclico estimulada pela vasopressina. O gene do receptor humano de vasopressina V2, AVPR2, localiza-se na região cromossômica Xq28, constituindo-se num óbvio candidato para a gênese molecular de casos com DIN ligado ao X (49). Atualmente, já foram identificadas mais de 150 diferentes mutações inativadoras do receptor acoplado à proteína G AVPR2 em diversas famílias com DIN ligado ao X, sendo que a incidência estimada desta doença em Quebec é de 8,8 por milhão em nascidos vivos do sexo masculino (50). Muitas destas mutações até hoje descritas ocorreram em famílias brasileiras (51,52). Pacientes do sexo masculino que têm uma destas mutações no gene do receptor AVPR2 apresentam um fenótipocaracterizado por episódios precoces de desidratação, hipernatremia e hipertermia, já na primeira semana de vida (53).
Recentemente, Jobert e cols. (54) encontraram uma associação entre a condrodisplasia de Blomstrand (doença genética letal caracterizada por um quadro de maturação óssea endocondral avançada) e uma mutação inativadora do receptor de PTH/PTHrp (substituição de G por A no nucleotídeo 1176) que resultou na deleção dos primeiros 11 aminoácidos do exon 5, correspondendo ao quinto domínio transmembranoso deste receptor. Na realidade, esta forma de condrodisplasia nada mais é do que uma imagem em espelho da condrodisplasia de Jansen que está associada a mutações ativadoras do mesmo receptor (55).
B – Doenças Endócrinas Causadas por Mutações Ativadoras (tabela 2)
A ativação constitutiva (isto é, independente da ligação ao respectivo agonista) proveniente de mutações somáticas do gene do receptor de TSH está causalmente associada com adenomas tiroidianos hiperfuncionantes ou tóxicos (56). Mutações ativadoras germinativas deste mesmo receptor levam ao hipertiroidismo familiar não auto-imune (57,58). Num país como a Bélgica, onde a disponibilidade de iodo é moderadamente baixa, a maior causa de adenomas tóxicos únicos de tiróide é a presença de mutações ativadoras do receptor de TSH (20). Como é esperado no caso de hiperfunção autônoma tiroidiana, o TSH encontra-se suprimido. Uma revisão recente abordou todas as mutações ativadoras do receptor de TSH descritas até hoje: 15 mutações germinativas em 14 códons e 94 mutações somáticas em 15 códons já foram relatadas (59). Vale também ressaltar um caso descrito de hipertiroidismo gestacional familiar decorrente de um receptor de TSH mutado e com sensibilidade aumentada aos níveis de gonadotrofina coriônica humana (60). Recentemente, anormalidades genéticas envolvendo o receptor de TSH foram associadas com tumorigênese benigna e maligna da tiróide. Na realidade, mutação do receptor de TSH foi encontrada em poucos casos de carcinoma diferenciado de tiróide e, desta forma, o papel das alterações dos mecanismos AMP cíclico-dependentes relacionados ao receptor de TSH ainda precisam ser esclarecidos (61).
Gromoll e cols. (62) descreveram o caso de um paciente de 28 anos de idade, que havia sido hipofisectomizado há 8 anos e posteriormente tratado com sessões de radioterapia devido a um adenoma hipofisário cromófobo. Este paciente evoluiu para pan-hipopituitarismo e foi suplementado com glicocorticóide, tiroxina e testosterona. As gonadotrofinas circulantes eram indetectáveis e a concentração sérica de testosterona era normal, decorrente da reposição hormonal. Apesar destes antecedentes, o volume testicular deste paciente encontrava-se no limite superior da normalidade, com espermatogênese e fertilidade preservadas e motilidade e morfologias dos espermatozóides levemente comprometidas. Estes dados compatíveis com espermatogênese gonadotrofina-independente levaram à investigação e ao encontro de uma mutação constitutivamente ativadora do receptor de FSH (Asn567Gly) localizada na terceira alça intracelular. Este caso representa a única descrição de mutação ativadora do receptor de FSH, mas o estudo funcional é questionado em estudos posteriores.
No que diz respeito ao receptor de LH, diversas mutações ativadoras já foram descritas. Ainda quanto à freqüência de mutações, na realidade chega a ser surpreendente a marcante diferença entre os receptores de LH e FSH. Talvez as mutações em ambos os receptores até ocorram com a mesma freqüência, mas é possível que mutações ativadoras do receptor de FSH não resultem em algum fenótipo específico (63) (exceto o caso descrito anteriormente). Mutações ativadoras do receptor de LH resultam em puberdade precoce familiar masculina ou testotoxicose, que é uma doença de herança autosômica dominante onde os meninos afetados apresentam sinais de virilização geralmente em torno dos 4 anos de idade ou mesmo antes. Entretanto, esta doença pode ocorrer esporadicamente na forma de nova mutação germinativa (64). Compatível com o quadro de hiperfunção gonadal autônoma, as gonadotrofinas encontram-se suprimidas. Indíviduos portadores de testotoxicose e pertencentes a nove diferentes famílias apresentavam em comum a presença da mutação D578G localizada no sexto domínio transmembranoso do receptor de LH, capaz de ativar constitutivamente este receptor (65,66). Esta mutação é a causa mais comum de testotoxicose familiar e esporádica nos Estados Unidos (64-66). Entretanto, diversas outras mutações já foram descritas até hoje, sendo que a maioria destas concentra-se no sexto domínio transmembranoso do receptor de LH (67). O LH por si só é suficiente para desencadear a esteroidogênese na células de Leydig, mas ambos LH e FSH são necessários para ativar a esteroidogênese ovariana. Desta forma, uma inativação inapropriada apenas do LH não deveria causar puberdade precoce em mulheres. De fato, nenhuma evidência de hiperandrogenismo ovariano subclínico foi encontrada em uma mulher portadora da mutação D578G (68). O primeiro caso de tumor de células germinativas testiculares foi publicado em 1998 (69), referindo-se a um paciente com diagnóstico de puberdade precoce familiar masculina diagnosticada aos 27 meses de idade. Este mesmo paciente teve um diagnóstico de seminoma testicular realizado aos 35 anos de idade, tendo sido identificada uma mutação ativadora do gene do receptor de LH (Asp578Gly). Além deste caso, Liu e cols. (70) relataram a presença da mutação somática Asp564H no gene deste mesmo receptor, detectada no tecido de adenomas de células de Leydig de três meninos sem parentesco (esta mutação não foi encontrada no tecido adjacente normal ou mesmo em células sangüíneas). Desta forma, níveis elevados de testosterona de início na infância aparentemente predispõem ao desenvolvimento de tumores testiculares, o que indica que pacientes com puberdade precoce familiar masculina devem ser seguidos a longo prazo (71).
Muitos dos casos rotulados com o diagnóstico de hipoparatiroidismo idiopático podem, na verdade, ter como base uma mutação ativadora do receptor sensível ao cálcio extracelular. Neste contexto, a doença é chamada de hipocalcemia autossômica dominante (46,47).
Uma rara causa de nanismo, denominada condrodisplasia metafisária de Jansen, está associada com hipercalcemia independente de PTH, o que é compatível com uma ativação constitutiva do receptor de PTH, simulando o efeito de níveis aumentados de PTH. De fato, 3 mutações inativadoras do gene do receptor de PTH/PTHrp (H223R, T410P e I458R) já foram descritas em 11 pacientes não relacionados portadores desta doença, confirmando esta associação causal (55,72-74). A identificação desta associação (assim como a associação entre condrodisplasia de Blomstrand e inativação deste mesmo receptor) tem implicações para a melhor compreensão da importância biológica do receptor de PTH/PTHrp no que diz respeito ao desenvolvimento esquelético humano, além do papel que exerce na regulação homeostática mineral.
GPCRs: Perspectivas para o Diagnóstico e Tratamento de Endocrinopatias
A identificação de mutações naturais nos GPCRs e mesmo nas sub-unidades a das proteínas Gs e a associação causal destas mutações com diversas endocrinopatias sem dúvida alguma em muito contribuiu para a melhor compreensão de aspectos estruturais e funcionais destes receptores e destas proteínas sinalizadoras. Além disso, diversos aspectos da fisiologia endócrina são constantemente atualizados através de novas descobertas nesta área. Entretanto, para a grande maioria das endocrinopatias, o diagnóstico funcional ainda depende das medidas das concentrações dos hormônios considerados relevantes para determinada situação, e o tratamento ainda se baseia na reposição do(s) hormônio(s) deficiente(s) ou na correção clínica ou cirúrgica de um estado de hipersecreção hormonal.
Apesar disso, neste aspecto de diagnóstico e tratamento de doenças endócrinas, é fácil notar uma mudança cujo ritmo só tende a crescer com opassar do tempo. Exemplos não faltam: no caso do diabetes insipidus nefrogênico ligado ao X, atualmente já é possível o estudo de investigação de mutações no gene do receptor da vasopressina. Isto pode ser de extrema utilidade no caso de querermos determinar se uma mulher clinicamente assintomática é portadora desta mutação, o que implicaria na avaliação de risco de seus futuros filhos apresentarem a doença. Neste caso, estes poderiam ser testados imediatamente no período pós-natal ou até mesmo no pré-natal para determinar se são afetados. Neste caso, a reposição apropriada de fluidos pode ser iniciada imediatamente para prevenir qualquer grau de desidratação (53). Outro exemplo refere-se à identificação de mutações do gene do receptor sensível ao cálcio (cromossomo 3q) para auxiliar em caso de eventuais dúvidas no diagnóstico diferencial de hipercalcemia hipocalciúrica familiar benigna (FHH) e hiperparatiroidismo primário (HPP). No caso da FHH, paratiroidectomia não é indicada, mas nos casos de HPP, este procedimento cirúrgico muitas vezes deve ser realizado. A grande maioria das mutações identificadas até hoje em pacientes com FHH situa-se no cromossomo 3q onde está localizado o gene do receptor sensível ao cálcio extracelular (46).
Outra linha promissora de pesquisa está relacionada à associação entre mutações em GPCRs e a transformação celular e conseqüente e potencial formação de tumores, conforme tem sido descrito em alguns casos envolvendo mutações ativadoras do gene do receptor de TSH e tumores tiroidianos (56,61). Exemplificando, o papel do receptor de ACTH na formação de tumores adrenocorticais tem sido alvo de alguns estudos. O seqüenciamento direto de toda a região codificadora do gene do receptor de ACTH proveniente de adenomas e carcinomas adrenocorticais não revelou a presença de mutações constitutivas ativadoras, indicando que este mecanismo não é freqüente na tumorigênese adrenocortical humana (75). Entretanto, Reincke e cols. (76) demonstraram que uma deleção do gene do receptor de ACTH pode estar envolvida na gênese de alguns tumores adrenocorticais, contribuindo para a inadeqüada diferenciação celular (77).
Terapeuticamente falando, a partir do momento em que é identificada uma associação entre determinada doença e a presença de mutações em GPCRs, abre-se uma enorme avenida para a pesquisa de drogas que potencialmente consigam atuar neste receptor, modulando sua resposta para mais ou para menos, conforme a necessidade. Exemplificando, as drogas calcimiméticas e calciolíticas atuam diretamente no receptor sensível ao cálcio extracelular (CaR). As calcimiméticas (78) são capazes de ativar o CaR, diminuindo assim a secreção de PTH, o que implica numa droga muito atraente para o controle da secreção de PTH em alguns casos de hiperparatiroidismo primário e urêmico. Por outro lado, as calciolíticas (79) aumentam a secreção de PTH, sendo desta forma alvos atuais de estudos para o uso terapêutico para osteoporose, visto que o próprio PTH, em níveis fisiológicos, é comprovadamente anabólico para a massa óssea (80).
Em conclusão, gostaríamos de enfatizar o quanto esta área de pesquisas relacionada a diversas endocrinopatias resultantes de alterações estruturais e funcionais de GPCRs e/ou de suas respectivas proteínas Gs tem avançado rapidamente, e desta forma contribuído para a melhor compreensão de mecanismos fisiológicos e patogênicos que compõem a endocrinologia como um todo. Com o tempo e com a determinação tridimensional da estrutura destes receptores, seguindo-se o exemplo recente do receptor da rodopsina (81), tal compreensão seguramente vai atingir um nível ainda mais completo.
Transdução de sinal/AMPc
O mecanismo da transdução do sinal celular consiste de fosforilações e defosforilações sequenciais dos resíduos das proteínas intracelulares. Esses eventos ocorrem após a ligação dos hormônios aos seus receptores de membrana, que vão ativar as proteínas G e gerar um segundo mensageiro, tais como AMPc, diacilglicerol, ou íons cálcio[27][28]. A adenilil ciclase é uma glicoproteína transmembrana que catalisa ATP para formar AMPc com a ajuda de cofator Mg2+ ou Mn2+. O AMPc produzido é um segundo mensageiro no metabolismo celular e um ativador alostérico da proteína quinase A (PKA). A ativação da PKA pelo AMPc leva a fosforilação de resíduos de serina em outras proteínas na cascata de sinalização. A fosforilação consiste na transferência de um grupo fosfato, a partir do trifosfato de adenosina, para resíduos específicos de aminoácidos, usualmente serina, mas algumas vezes também treonina ou tirosina. A fosforilação é determinada pela atividade das enzimas quinases protéicas, e a desfosforilação pelas fosfoproteínas fosfatases. A proteína quinase A consiste de quatro subunidades, duas subunidades catalíticas e um dímero regulatório, o qual se liga à molécula de AMPc. Desta forma, ocorre a dissociação da proteína quinase, ou seja, separação da subunidade regulatória da catalítica. A subunidade ativa da proteína quinase catalisa a fosforilação de certas proteínas intracelulares (fatores de transcrição) que atuam na ativação e inativação gênica. O exato mecanismo pelo qual as proteínas fosforiladas ativam a transcrição gênica ainda não está bem estabelecido[29][30]. A AMPcfosfodiesterase é uma enzima que pode degradar o AMPc em 5'-AMP, o que determina o fim da sinalização.
Mecanismos que levam ao término da resposta induzida por AMPc
A regulação negativa da proteína cinase A ocorre através de um mecanismo de retroalimentação (feedback): um dos substratos que é ativado pela quinase é uma fosfodiesterase, que converte rapidamente AMPc em AMP, reduzindo assim a quantidade de AMPc disponível. Assim, a PKA é controlada pelo AMPc. Além disso, a própria subunidade catalítica pode ser regulada pela fosforilação[31]. A subunidade α Gs catalisa lentamente a hidrólise de GTP para o GDP, o que desativa a proteína Gs, fechando o caminho do AMPc. A via também pode ser desativada diretamente na cascata por inibição da adenilil ciclase. As moléculas que inibem a via de AMPc incluem: - AMPcfosfodiesterase: desfosforila AMPc em AMP, havendo a redução da concentração de AMPc. - Proteína Gi: inibe a adenilil ciclase, reduzindo a quantidade de AMPc.[32][33]Há ainda um estudo que mostra que o tratamento de longo prazo com uma baixa concentração de H2O2 conduz à ativação de vias de sinalização envolvendo cinases reguladas por sinal extracelular, proteína ribossomal S6 cinase, proteína cinase D (PKD) que aumentam o AMPc, ligando-se ao elemento de resposta às proteínas (CREB) sem a necessidade de haver a fosforilação em serina (Ser) 133, em cardiomiócitos
Princípios da Sinalização Celular ORGANISMOS UNICELULARES Células respondem a estímulos do meio: disponibilidade de oxigênio, nutrientes, etc ORGANISMOS MULTICELULARES Células enviam sinais umas às outras células mediante centenas de tipos de moléculas extracelulares.
PROTEÍNAS QUINASES E A AÇÃO HORMONAL
Nos processos metabólicos, grandes quantidades de energia são requeridas e a maior parte da energia livre é obtida pela oxidação de nutrientes e substratos disponíveis durante o catabolismo. Esta energia é conservada e transferida mediante reações acopladas à síntese de ATP a partir de ADP e fosfato inorgânico - Pi (reação de fosforilação do ADP) tornando-se, portanto, sistemas de transmissão de energia e vínculos entre as reações produtoras e reações consumidoras de energia.2 O ATP e o ADP são reagentes obrigatórios em quase todas as reações enzimáticas de transferência de grupos fosfato. O ADP serve como intermediário receptor do grupo fosfato proveniente de compostos fosfatados de alta energia e o ATP como doador do grupo fosfato para compostos de baixa energia.
As proteínas quinases (PK) são enzimas que catalisam a fosforilação de proteínas por meio da transferência de um grupo fosfato de ATP ou GTP (em raros casos), para resíduos de tirosina (Tyr), treonina (Thr) e serina (Ser). As enzimas são proteínas com capacidade catalisadora e formadaspor uma seqüência de aminoácidos em que a interação entre as cadeias laterais vai determinar a sua forma e a sua função.
As proteínas quinases compõem a maior família de proteínas nos seres eucariontes e é um componente fundamental da cascata de “comunicação” que ocorre no controle intracelular, na regulação e transdução de sinais. O mecanismo regulador inclui vários fenômenos que vão desde alterações químicas e estruturais das proteínas até ao controle transcricional. Portanto, um entendimento minucioso sobre o mecanismo de controle das proteínas quinases torna-se foco de interesse de muitos trabalhos e pesquisas para a descoberta de novos fármacos.
Os primeiros relatos sobre as proteínas quinases foram realizados por Edwin Krebs e Edmond Fisher em 1959 e desde que começaram a ser descobertas, muitas pesquisas têm sido feitas evidenciando a presença de um grande número de proteínas quinases existente estimando-se, inclusive, que o genoma humano apresente em torno de duas mil quinases.
Atividades e classificação das proteínas quinases (PK) 
A atividade catalítica das proteínas quinases possui a propriedade de favorecer cineticamente uma reação. Isso porque a reação entre ATP produz quantidades muito pequenas de éster fosfato em água, ou seja, a hidrólise espontânea de monoéster fosfato, tem cinética lenta em condições fisiológicas normais, tornando necessária a ação de fosfatases para que a reação seja acelerada.
Assim, a fosforilação de proteínas é reversível e controlada por enzimas em ambas as direções (fosforilação e desfosforilação). 
A fosforilação dos aminoácidos é responsável por estímulos extracelulares e intracelulares, que fornecem mecanismo eficiente para o controle das atividades protéicas. 
O processo de fosforilação ocorre justamente nestes aminoácidos pelo fato de que possuem o radical OH em suas cadeias laterais levando o radical hidroxi à condições ideais para a reação de hidrólise do ATP, para “soltar” o fosfato presente.
Adicionar e remover grupos fosfato é um mecanismo fisiológico importante na regulação de proteínas intracelulares, as quais podem ser enzimas, receptores ou segundos mensageiros. Uma série de respostas celulares mediadas por receptores e vias metabólicas podem ser ativadas e desativadas pelas quinases (que adicionam grupos fosfato) ou fosfatases (enzimas que removem grupos fosfato) intracelulares. As quinases e as fosfatases, por sua vez, são reguladas por sinais 2 bioquímicos extrínsecos, tais como hormônios e fatores de crescimento. As quinases celulares são divididas naquelas que fosforilam proteínas em resíduos Tyr (tirosina-quinases) e aquelas que fosforilam proteínas em resíduos Ser e Thr (serina/treonina-quinases).
 A fosforilação das proteínas Ser, Thr e Tyr, ocorre em proporções de 1000/100/1 respectivamente e introduz grupos carregados eletricamente em uma região moderadamente apolar e muda radicalmente sua natureza química provocando drásticas alterações em sua conformação e, conseqüentemente, em sua atividade catalítica acarretando em uma drástica redução da capacidade de exercer sua função original. 
Como resultado desses eventos, os resíduos de Ser, Thr e Tyr passam a ter um sequenciamento protéico repetido que é conhecido, então, por uma proteína quinase específica.
Para que o mecanismo regulatório seja efetivo, a fosforilação causada pelas proteínas quinases deve ser reversível. Felizmente, a desfosforilação também é uma reação relativamente simples e as enzimas que exercem esta função de reversão são as fosfoproteínas-fosfatases cuja função é hidrolisar ésteres específicos de fosfoserina, fosfotreonina ou fosfotirosina em proteínas específicas.
Neste contexto, a fosforilação funciona como um interruptor para a atividade enzimática e as quinases são os responsáveis por ligar e/ou desligar este interruptor, de modo a permitir o retorno ao nível anterior de estimulação quando o sinal hormonal termina.
Desta forma, não é necessário sempre degradar proteínas e transcrever/traduzir novas proteínas toda vez que a célula precisar alterar seu metabolismo: basta apenas ativar ou inibir as proteínas de acordo com a necessidade não havendo nenhuma regra para qual estado é o ligado, ou seja, uma fosforilação pode tanto ativar quanto desativar uma proteína.
A importância terapêutica das PK As proteínas quinases estão associadas a algumas doenças como a asma, o câncer, enfermidades de ordem cardiovascular, diabetes e doenças do sistema nervoso central, dentre outras. Em função de seu papel essencial no processo de proliferação celular, metabolismo do glicogênio, apoptose, neurotransmissão, oncogênese, desregulação ou superexpressão de receptores em geral, elas são motivos de estudos e pesquisas.
No processo de desenvolvimento e manutenção de tumores malignos humanos, por exemplo, o envolvimento de proteínas quinases pode ocorrer por rearranjo genômico, incluindo translocação cromossomal dos genes Bcr-Abl em leucemia mielóide crônica (LMC); mutações que conduzem à atividade quinase; desregulação da atividade quinase por ativação de oncogenes ou perda da função de supressores tumorais.
Isto ocorre, por exemplo, com o oncogene Ras (ativado em aproximadamente 30-50% dos cânceres humanos), desregulação da atividade da quinase Raf e quinases dependentes de ciclinas e desregulação da atividade quinase por superexpressão dos receptores do fator de crescimento epidérmico.
Proteínas quinases na ação hormonal As vias metabólicas são reguladas em três níveis: pela ação das enzimas alostéricas, pelo controle da expressão gênica nas células e por meio dos hormônios, os quais são mensageiros químicos que regulam o metabolismo. A regulação hormonal sobre a atividade de uma proteína quinase, ocorre independentemente do tipo de sinal transducional da ação hormonal, se por meio de adenilciclase, cálcio/calmodulina, fosfolipase C, canais iônicos ou guanilciclase.
Proteína quinase A (PKA) Com sua estrutura catalítica bem conservada, a PKA foi primeira estrutura de uma proteína quinase ativa que foi completamente determinada. Ela altera as atividades das proteínas-alvo, fosforilando grupos específicos de serina e, em menor quantidade, a treonina e é ativada por concentrações de AMP cíclico (AMPc) e, por isso, ela também é conhecida como proteína quinase dependente do AMP cíclico (PKAc).
Esta enzima é formada por duas subunidades: uma reguladora (R), com alta afinidade pelo AMPc, e uma catalítica (C). Na ausência de AMPc, a subunidade C torna-se inativa pela formação de um complexo tetramérico R2C2. A ligação do AMPc à subunidade R induz mudanças conformacionais que resultam na dissociação da haloenzima inibida.
A fosforilação destas enzimas pode resultar em alterações das atividades enzimáticas como é o caso da fosforilação do hormônio lípase sensível (HSL), colesterol esterase ou glicogênio fosforilase resultando na ativação enzimática. Mas por outro lado, a fosforilação de glicogênio sintetase causa um decréscimo na atividade enzimática. As respostas específicas de diferentes tipos celulares frente ao aumento das concentrações de AMPc e ativação da PKAc são determinadas pelo fenótipo celular e pela disponibilidade de enzimas e substratos que participam desta regulação. A exemplo, a maior resposta do fígado frente ao aumento do AMPc é a glicogenólise, uma vez que os hepatócitos expressam enzimas que sintetizam e metabolizam o glicogênio. 
Na Figura 4b está o diagrama da PKA com ATP e um peptídeo inibidor. A subunidade C possui dois domínios: um pequeno correspondente ao sítio de ligação do ATP e um domínio maior onde se liga o substrato.
Proteína quinase C (PKC) A PKC é uma das três principais quinases serina-treonina. Ela está envolvida em eventos de transdução de sinais, respondendo a estímulos específicos hormonais, neuronais e de fatores de crescimento. Sua ação é catalisando a transferência de um grupo fosfato do ATP (adenosina trifosfato) a várias proteínas substrato. Da mesma forma, a PKC também sofre fosforilações antes de ser ativada, o que ocorredurante sua translocação do citosol para a membrana da célula. Sua ativação e translocação do citosol à membrana plasmática ocorrem em resposta a aumento transitório de diacilglicerol (DAG) ou exposição a agentes exógenos, conhecidos como forbol- ésteres. Um grupo de 10 isoenzimas divididas em 03 classes compõe a família de PKC dos mamíferos sendo: a convencional (α, γ e, alternativamente, βI e βII), recente (δ, ε, η/L, θ) e atípica (ζ, ι/λ). Um quarto grupo, as PKC µ e ν são consideradas, por alguns, uma quarta classe e, por outros, como uma família distinta denominada proteínas quinases D.
Todas estas enzimas têm em comum uma região C-terminal conservada, típica de quinases, e uma região N-terminal que contém módulos regulatórios: pseudo substrato (exceto µ/D); domínios de ligação à fosfatidilserina e ésteres diacilglicerol/forbol; domínios de ligação a lipídeos aniônicos (apenas as convencionais e recentes) e Ca+2 (apenas as convencionais); e domínios de ligação a fosfoinositídeos (apenas µ/D).
Proteína quinase dependente de cálcio Ca+2/calmodulina (CaMK) Nos mamíferos, as células possuem uma grande quantia de proteínas que se ligam ao cálcio com diferentes especificidades e afinidades, podendo ser proteínas de baixa afinidade que atuam principalmente como "tampões" que limitam a difusão de Ca2+ ou outras proteínas que se ligam com alta afinidade e especificidade ao cálcio e são responsáveis por algumas atividades bioquímicas.
O cálcio é um sinalizador celular de extrema importância e por isso, sua concentração livre dentro da célula é estritamente regulada. A proteína quinase C liga-se diretamente ao cálcio, ao passo que outras quinases são reguladas indiretamente através de um sinal de transdução. É o caso da calmodulina (CaM) que possui dois sítios de ligação ao Ca2+ em cada um de seus dois domínios globulares (Figura 6a). A ligação com o Ca2+ induz uma mudança conformacional na CaM que promove a interação do complexo Ca2+/CaM com proteínas como a Ser e Thr quinases. 
Proteína quinase dependente de ciclina (CDK) O caráter versátil de ativação e da regulação de proteínas quinases foi mais estudado para o grupo de quinases dependentes de ciclina. Sua ativação ocorre a partir de dois eventos: a ligação com uma molécula reguladora positiva, a ciclina e a fosforilação de um resíduo de treonina localizado em seu segmento de ativação. 
CDK específicas operam em fases distintas do ciclo celular (Figura 6b). A CDK4 e CDK5 (cliclinas D) são responsáveis pela progressão na fase G1; CDK2 (ciclina E) é necessária para a progressão da fase G1 a fase S; CDK2 (ciclina A) para a transição em fase S e a CDK1 (ciclina B) é responsável para a transição G2/M
Os complexos CDK/ciclinas são regulados por pequenas moléculas endógenas e possui inibidores específicos para cada um dos tipos. O núcleo catalítico da CDK2 é composto de múltiplos subdomínios conservados encontrados em todas as proteínas quinases. O sítio de ligação do ATP situa-se na interface domínio-domínio. 
Proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK) As MAPK abrangem uma enorme quantidade de proteínas quinases, que podem ser reguladas por sinal extracelular, quinases c-Jun N-terminal e outras. Para se tornarem ativas, este grupo exige fosforilação de resíduo de tirosina e treonina, ambas catalisadas por quinase ativadora da MAP quinase (MEK).
Como conseqüência, essas quinases são inativadas pelos três maiores grupos de fosfatases: todas as que removem fosfato de serina/treonina ou de tirosina e as fosfatases que removem fosfato de serina, treonina e tirosina.
A cascata de fosforilação das MAPK nas células é representada pela Figura 8. O primeiro passo ocorre com a ativação de uma proteína transmembranal, o receptor do fator de crescimento, este por sua vez ativa a proteína RAS através da molécula adaptadora GRB2 e um fator de troca do nucleotídeo guanina (SOS), induzindo RAS a trocar seu GDP por um GTP. 6 O processo é seguido por uma estimulação seqüencial de proteínas quinases citoplasmáticas, como a Raf (uma quinase específica para Ser/Thr), a MEK e as MAPK. As MAPK migram então para o núcleo celular, onde fosforilam um conjunto de moléculas responsáveis pela transcrição, iniciando, deste modo, a proliferação celular.
Tirosina quinases (PTKs) As PTKs apresentam duas subdivisões: as tirosinas quinases não receptoras citoplasmáticas (como Src), que podem ser reguladas por diferentes mecanismos e as tirosina quinases receptoras, proteínas transmembrânicas, ativadas por um ligante extracelular. As quinases Src têm cinco componentes ou domínios: N-terminal, homólogo Src SH3, SH2, quinase (bilobada), além de um domínio não catalítico C-terminal.
O domínio quinase é conservado em toda a classe e é responsável pela atividade catalítica. Possui também os domínios SH3 e SH2, que fazem interação proteína-proteína e têm funções reguladoras e adaptadoras. O domínio SH3 tem aproximadamente 60 aminoácidos e contém regiões ricas em prolina. O domínio SH2 tem aproximadamente 100 aminoácidos e é responsável pelo reconhecimento e ligação à tirosina fosforilada. Abelson tirosina quinase (ABL) é um exemplo de membro da família tirosina quinases não receptoras. 
Tirosina quinases receptoras (RTKS)
A quinase receptora de insulina (IRK), uma glicoproteína transmembrânica, foi a primeira estrutura de receptores de tirosina quinases a ser determinada,. O receptor de insulina (Figura 9), ao contrário de outros receptores tirosina quinases, é um dímero na forma inativa. A insulina liga-se às subunidades α e porção intracelular da subunidade β transmembrânica contém o domínio com atividade de tirosina quinase com estrutura semelhante à PKAc. A ligação da insulina a uma ou duas subunidades α desencadeia uma alteração conformacional no domínio intracelular do receptor que consequentemente sofre autofosforilação, aumentando sua atividade e posteriormente fosforilando outras proteínas.
Os fatores de crescimento são denominados de acordo com o tipo de tecido em que seus receptores são expressos e atuam mediante a ativação de seus receptores que são, em geral, tirosina quinases. Dentre alguns exemplos, os fatores de crescimento vascular endotelial (VEGF) agem mediante ativação de receptores do tipo tirosina quinase e são expressos em células endoteliais vasculares. Estes receptores são subdivididos em três categorias e a ativação seletiva de cada um deles resulta em diferentes respostas biológicas tais como, a indução nos efeitos organizacionais na estrutura vascular; a indução da mitose das células endoteliais vasculares e a indução da linfoangiogênese (este último expresso em vasos linfáticos). 
O receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR) são importantes mediadores do crescimento celular, da diferenciação e sobrevivência destas células. Trata-se de uma glicoproteína da membrana plasmática composta de um domínio de ligação extracelular, um segmento transmembrânico lipofílico e um domínio intracelular de tirosina quinase.6 Um outro sub-grupo de RTK é composto pelos receptores de fator de crescimento derivados de plaqueta, que possuem 5 domínios imunoglobulinas na região extracelular e um domínio quinase hidrofílico na região citoplasmática.
Um outra classe é a de fatores de crescimento do fibroblasto (FGF) que é composta por 22 proteínas que estão estruturalmente relacionadas e as respostas biológicas deste grupo são mediadas por quatro distintos receptores tirosina quinase (FGFR), cada um formado por uma porção de ligação extracelular, que contém três domínios imunoglobulinas, uma hélice transmembrânica e um segmento citoplasmático com atividade tirosina quinase.
Inibidores químicos das PK A inibição da ação de proteínas quinases (PK) podem ser feitas de duas formas: por inibidores alostéricos que competem pelos sítios de ligação do ATP ou por inibidores alostéricos de quinase que se ligam em sítios de substratos protéicos (inibição cinética não competitiva).4 Quando os inibidores alostéricos se ligam ocorre uma alteração na conformação espacial destas