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toxicologia forense

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Análises Forenses
Prof.Ms.Emerson L.B.Lourenço.
Toxicologia Forense
Definição: Ciência que detecta e identifica a presença de drogas e venenos em fluídos corpóreos, tecidos e órgãos.
Toxicologia Forense
Funções diversas;
Toxicologia Forense x Toxicologia Analítica;
Várias matrizes para análises;
Métodos químicos sofisticados (derivação química, cromatografia, espectrometria de massa); 
Compostos Voláteis
Compostos da forma liquida que podem ser detectadas por técnicas de cromatografia liquida ou gasosa, quando as matrizes podem sofrerem métodos de extração apropriados.
Extrações Liquído-Liquído, head space, Micro extração em fase sólida e extração em fase sólida.
Substâncias Corrosivas
Incluem ácidos minerais e bases;
Vários agentes corrosivos são constituintes normais dos tecidos;
Modificações das concentrações químicas no plasma podem determinar as lesões;
Metais
Clássicos procedimentos de separação de matrizes orgânicas são utilizados para determinação de metais ( Ex: agentes químicos e oxidação térmica);
Técnicas analíticas empregadas ( Ex: AAS, MEV e ICP-MS);
Diferentes formas de metais ( Mercúrio, dimetilmercúrio);
Componentes orgânicos não voláteis
Drogas prescritas e ilícitas, praguicidas, produtos naturais, poluentes e compostos industriais;
Dificuldade de Separação....
A
N
Á
L
I
S
E
S
Papel da Toxicologia analítica
BIOTRANSFORMAÇÃO DO BENZENO NO FÍGADO E MEDULA ÓSSEA
FÍGADO 
	 CytP450	 CytP450
Benzeno 	 fenol 	 hidroquinona
	 [O] [O]
MEDULA ÓSSEA
		 Prostaglandina sintetase 
Hidroquinona 				 radical fenoxil
					(aplasia de medula ) 
Como determinar?
O que procurar nestas amostras?
metanfetamina
efedrina
fenilpropanolamina
anfetamina
femproporex
ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS
1-Androstenodiol
Boldenona
Clostebol
Estanozolol
Gestrinona
Nandrolona
Oxabolona
Trembolona
THG
AGENTES ANABÓLICOS
	1. Esteróides anabólicos androgênicos
Algumas dos esteróides mais utilizados:
- metandienona (Dianabol),
- cipionato de testosterona (Testosterona Depot, Sustanon)‏
- decanoato de nandrolona (Deca-durabolin, Durabolin)‏
- oxandrolona (Anavar)‏
- enantato de metenolona (Primobolan)‏
- estanozolol ( Winstrol)‏
- undecilenato de boldenona (Equipoise) - uso veterinário
Efeitos tóxicos
	
-Coletases e tumores no fígado, mais freqüentemente com o uso de derivados C-17 alquilados. Carcinomas hepáticos associados aos E.A. não produzem metástase e regridem após a descontinuação do uso.
Agentes anabólicos
	1. Esteróides anabólicos androgênicos
O ciclo letal de Andreas Munzer
0-10 semanas antes da competição:
-Efedrina, Aspirina, Valium, clembuterol, hormônio da tireóide.
6-10 semanas antes da competição:
-2 inj. Testoviron 250mg (testosterona)
-1 inj. Parabolan (Trembolona)
- 30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-30 comp. Metandienona
-20 doses GH
-20 doses insulina
3-5 semanas antes da competição:
-3 inj. Masteron (Drostanolona)
-2 inj. Parabolan(Trembolona)
-30 comp. Halotestin (Fluoximesterona)
-50 comp. Stromba (Estanozolol)
-2 inj. Stromba
-24 doses GH
-20 doses insulina
OUTROS: EPO, diuréticos
Baixas concentrações
ESTERÓIDES ANABÓLICOS ANDROGÊNICOS
DETECÇÃO
URINA
O desafio dos anabolizantes
Conteúdo da seringa
18α-homo-pregna-4,9,11-trieno-17β-ol-3-ona
4,9,11- trieno-3-one
i) Novo esteróide, nova “entidade química”.
ii) Sem registro de CAS.
iii) Nunca antes usado em humanos ou animais. 
iv) Nunca testado em screening farmacológico.
v) Propósito único – burlar o exame de dopagem.
vi) “O” esteróide de desenho.
Esteróides de desenho
Tetraidrogestrinona – Conclusões de Catlin et al.
Designer steroids
O desafio dos anabolizantes
Caracterização do THG
“CLUB DRUGS”: Freqüentadores de festas “raves”.
 MDMA: Ecstasy, pílula do amor.
 GHB: “Ecstasy líquido”.
 Cetamina: Special K, Kit kat.
 Metamfetamina: Speed, Crystal, DOB.
 LSD (Ácido, doce, ponto).
 Fenciclidina: PCP. 
 Nitritos (Poppers).
GHB
Flunitrazepam (FNZ)
Rohypnol
FNZ ilícito
Utilizadas em assaltos e estupros.
Efeitos: Incapacidade de reação e amnésia retrógrada.
WWW.DEA.GOV
 
GHB
Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL).
GHB
Definição: 
 Gama-hidroxibutirato (Ecstasy líquido, GBL.
 Natural em SNC de mamíferos.
 Estrutura similar ao neurotransmissor GABA.
 Date rape drug (Relatos de uso em assaltos e 
 estupros).
 Líquido ligeiram. Salgado, amargo e inodoro.
 Popularizado na década de 1980 - realçar o efeito do etanol .
 Uso crescente por todo o país.
 Recentemente aprovado pelo FDA como tratamento
 para narcolepsia.
 Alguns congêneres: gama-Butirolactona (GBL) e 1-4 butanediol
 (solventes industriais utilizados na limpeza de CDs, Impressoras).
 
GHB
Mecanismo de ação: 
 Receptores só no SNC, principalmente hipocampo. 
 Liga-se fracamente em receptor GABA b. 
 Depressor do SNC.
 Provoca liberação de opióides endógenos.
 
GHB
 Farmacocinética:
 Início de ação: 15-30 min e pico plasmático 
 em 25-45 min.
 Metabolizado em CO2 .
 GBL é convertido à GHB por via não enzimática.
 1-4 butanediol é convertido à GHB pela álcool
 desidrogenase.
 Efeito Bifásico. A ingestão concomitante de etanol, leva a
 uma inibição competitiva pela álcool desidrogenase,
 retardando a metabolização do 1-4 butanediol. Assim,
 pode haver uma depressão inicial do nível de consciência
 seguido por uma melhora quando o etanol é metabolizado
 e logo em seguida evolução para coma com a
 disponibilização da álcool desidrogenase. 
DOB - (Cápsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-bromoamfetamina
 www.baladacerta.com.br surforeggae.ig.com.br 
DOB - (Cápsula do vento)
(4-bromo-2,5-Dimetoxi-4-bromoamfetamina
 
Derivado anfetamínico acrescido de um átomo de bromo ( responsável por potencializar o efeito da droga e por aumentar o tempo de ação). 
Primeiramente sintetizada por Alexander Shulgin (EUA) in 1967. 
Cápsula transparente com capacidade de 500 mg que contém cerca de 1 a 1,5 mg da substância.
Cocaína
(3%)
Éster metil ecgonina 
(15-35%)
Ecgonina
(1-8%)
Norcocaína
(2-6%)
Benzoilecgonina 
(15-50%)
Amostras
PRAGUICIDAS
a) Derivados do ácido fosfórico.
b) Derivados do ácido tiofosfórico.
c) Derivados do ácido ditiofosfórico.
d) Derivados do ácido fosfônico.
Derivados do ácido fosfórico.
Ex: Diclorvos,fosfamidon,Mevinfós, Monocrotofós.
Derivados do ácido Tiofosfórico.
Ex: Cloropirifós,Diazinon,Fention,Omeotoato,Paration metílico
Derivados do ácido Ditiofosfórico.
Ex:Azinfós,etion,forato,malation,tiometon
Derivados do ácido Fosfônico.
Ex:Triclorfon
Oral, respiratória e dérmica.
Biotransformação
Oxidação
Ligação ao sitio enzimático
x
Ácido Carbâmico
Aldicarb,Carbaril,Carbofuran
INSETICIDAS ORGANOCLORADOS
 São compostos de estruturas cíclicas, bastante lipofílicos e altamente resistentes aos mecanismos de decomposição do ambiente.Os principais organoclorados com atividade inseticida são:
a) Hexaclodienos e análogos.
b) DDT e análogos.
c) Ciclodienos.
d) Dodecacloro e clordecone.
DDT
2,2-BIS(P-CLORFENIL) 1,1,1 - TRICLOETANO
DDT
Aldrin
Dieldrin
CICLODIENOS
PIRETRÓIDES
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS EM ANÁLISES TOXICOLÓGICAS
A preparação de amostras pode ser considerada como uma série de operações unitárias necessárias para que determinada substância (analito) possa ser detectada pela técnica analítica de escolha.
55
Típicas operações em preparação de amostras:
1) Liberação dos analitos da amostra
2) Remoção de interferentes endógenos
3) Técnicas de extração
4) Aumento da seletividade e sensibilidade
56
1) Liberação dos analitos da matriz
-Como se
encontra o analito na matriz?
	-conjugado/livre
	-matriz?
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BIOTRANSFORMAÇÃO
Maconha - 9THC
Delta-9-Tetraidrocanabinol (THC)
Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH
Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado
58
SUBSTÂNCIAS CONJUGADAS 
Hidrólise
	-Alcalina
	-Ácida
	-Enzimática
59
HIDRÓLISE ALCALINA 
Exemplo
Ácido 11-nor- delta -9 -THC-COOH conjugado
Ácido 11-nor-delta-9-THC-COOH
60°C
NaOH
60
HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA 
Vantagens:
	-processo mais rápido
	-custo baixo
- Desvantagens:
	-degradação de analitos não estáveis
p.ex. benzodiazepínicos
61
HIDRÓLISE ÁCIDA/ALCALINA 
Diazepam
Benzofenona
HCl
100°C 
15 min.
Benzodiazepínicos
62
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA 
Esteróides Anabólicos
conjugados
Esteróides Anabólicos
livres
Beta glucuronidase
55°C 
1 hora
63
HIDRÓLISE ENZIMÁTICA 
Vantagens:
	-não degrada os analitos
- Desvantagens:
	-custo mais alto
	-maior tempo de reação
	-controle mais rigoroso das condições
	-enzimas podem ser inibidas por substâncias presentes nas amostras
	-aconselhável o uso de controle
64
OUTRAS AMOSTRAS
P. ex: cabelo 
Matriz complexa
como retirar os analitos do cabelo?
	-digestão da matriz (solução de NaOH 1M e temperatura 70°C durante 20 minutos)
	substâncias estáveis (THC, anfetaminas)
65
OUTRAS AMOSTRAS
P. ex: cabelo 
E para substâncias não estáveis?
P.ex. cocaína
-Incubação em solução ácida ou metanol durante 18 horas a 50°C
66
2) Remoção de interferentes endógenos
	Uma matriz biológica consiste de muitos componentes, como proteínas, lipídios, carboidratos que podem interferir na análise.
67
2) Remoção de interferentes endógenos
A) Precipitação de proteínas:
A remoção de proteínas por desnaturação ou precipitação é muitas vezes necessária principalmente em amostras como sangue total ou plasma. A principal razão de remover proteínas é que elas podem precipitar em contato com a fase móvel, obstruindo a coluna de HPLC.
68
Métodos de precipitação:
a) com ácidos ( p.ex. ácido tricloroacético e ácido perclórico)
	-formam sais insolúveis com a forma catiônica das proteínas em meio ácido
b) com solventes orgânicos
-solventes que são miscíveis em água como acetona, metanol, etanol e acetonitrila podem abaixar a solubilidade de proteínas.
69
Métodos de precipitação:
c) com sais metálicos: proteínas também podem ser removidas da amostra com o uso de sais de zinco ou cobre em condições alcalinas. 
-não : analitos que complexam com metais. 
b) sulfato de amônio: O sulfato de amônio é um precipitante relativamente ineficiente: < 75% das proteínas são removidas com a adição de 1,5mL de sol. Saturada em 0,2ml de plasma. Entretanto, poderia ser possível injetar o sobrenadante diretamente no HPLC.
70
Precipitação de pigmentos e sais biliares
	Pigmentos urinários e sais biliares podem produzir altos “backgrounds”que podem interferir na quantificação de analitos. A remoção desses compostos com extensos esquemas de extração podem ser relativamente difíceis ou demorados. Sua remoção pode ser feita preferencialmente por precipitação com sais de chumbo.
71
3) Técnicas de extração
Extração líquido-líquido (LLE)
Extração em fase sólida (SPE)
Extração por head space (HS)
Micro extração em fase sólida (SPME)
72
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
urina
Solvente orgânico
urina
Drogas/ metabólitos
Agitação
Centrifugação
Separação da fase orgânica
extrato
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
INFLUÊNCIA DO pH NA HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
substâncias de caráter ácido. Ex. ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH
H+
OH-
ácido 11-nor-delta -9-THC-COOH
Forma ionizada
Forma não-ionizada
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
INFLUÊNCIA DO pH NA HIDROSSOLUBILIDADE/LIPOSSOLUBILIDADE
substâncias de caráter básico. Ex. anfetaminas
Anfetamina
H+
OH-
Forma ionizada
Forma não-ionizada
EXTRAÇÃO
(líquido-líquido)
EFEITO “SALTING OUT”
= molécula de água
+
NaCl (cloreto de sódio)
Na+
Cl-
2mL Metanol +
2mL tampão fosfato
1
2,5mL Amostra + 2,5mL água + PI + 2mL tampão fosfato
BE
PI
Interf.
COC
2
3mL água +3mL HCl (0,1M), secagem (5min) + 9mL metanol
3
2mL diclorometano/ isopropanol / NH3 (80:20:2)
4
EXTRAÇÃO
(fase sólida)
Tipos de colunas (SPE)
-INTERAÇÕES NÃO-POLARES (Van der Waals)
C8
Octil
PH
Fenil
CH
Ciclo
hexil
78
Tipos de colunas (SPE)
-INTERAÇÕES POLARES (Dipolo-dipolo, pontes de H)
CN
Cianopropil
NH2
Aminopropil
2OH
Diol
79
Tipos de colunas (SPE)
-INTERAÇÕES IÔNICAS (Eletrostática)
CBA
Ácido carboxílico
SCX
Ácido benzenosulfônico
SAX
Trimetil aminopropil
80
EXTRAÇÃO
Benzoilecgonina -metabólito da cocaína
H+
OH-
Forma ionizada
Forma ionizada
EXTRAÇÃO
(fase sólida)
EXTRAÇÃO POR HEAD SPACE 
DETERMINAÇÃO DE VOLÁTEIS
Amostra (urina, sangue ou saliva) + sulfato de sódio + PI
ESTUFA 70°C
 30 min
GC
seringa
83
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA
6
1
2
3
4
5
84
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Baseado na partição do analito entre a fibra de extração e a matriz (amostra)
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Fibras comercialmente disponíveis:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
	Fatores que afetam a eficácia de extração por SPME:
-Dimensões da fibra (comprimento, espessura);
-Tipo de fibra;
-Temperatura de extração;
-Efeito da matriz (presença de sal, pH);
-Velocidade de agitação;
-Tempo de extração.
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência do tempo de extração:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência da temperatura de extração:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência da concentração de sal:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
-Influência do pH:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
	Vantagens da SPME sobre a SPE e extração líquido-líquido:
-simplicidade
-prático
-rápido
-extração sem utilização de solventes
-pode ser automatizado.
4) Aumento da seletividade e sensibilidade
-Derivação
	Objetivo:
	-melhorar as condições cromatográficas (GC)
	-aumentar a sensibilidade 
93
-Derivação
	Ex. opiáceos
BSTFA
70°C 20 min
Aumento da volatilidade (melhora das condições cromatográficas (GC)
94
-Derivação
	Ex. benzoilecgonina
Aumento da sensibilidade para detectores ECD
PFP/PFPA
70°C 20 min
95
MATRIZES BIOLÓGICAS
URINA
SANGUE
AR EXALADO
MATRIZES ALTERNATIVAS:
SALIVA
CABELO
MECÔNIO
UNHA
SUOR 
 
 URINA
 Néfron
URINA
CARACTERÍSTICAS:
Coleta não invasiva
Disponibilidade de grandes volumes de amostra
Concentração alta
Facilidade da análise (baixo custo)
Possibilidade de adulteração da amostra
Período de detecção: alguns dias
Detecção de uso eventual
 
SANGUE
CARACTERÍSTICAS:
Coleta invasiva
Necessidade de profissional treinado 
Matriz relativamente complexa
Período de detecção: algumas horas
Correlação com estado clínico
Maior dificuldade de adulteração
 
SALIVA
SALIVA
CARACTERÍSTICAS:
Coleta não-invasiva
Facilidade na coleta
Coleta sob vigilância e em campo aberto 
Correlação com concentração sangüínea
Período de detecção: algumas horas
Pouco volume de amostra
Concentração baixa
 
CABELO
CARACTERÍSTICAS:
Coleta não-invasiva
Período de detecção: meses
Retrospectiva e cronológica
Detecção: uso intenso
Disponibilidade: ????
Adulteração: difícil
Possibilidade de contaminação
Baixa concentração
Matriz complexa -dificuldade na análise
 
CABELO
1 cm 
2 cm 
3 cm 
4 cm 
5 cm 
6 cm 
7 cm 
8 cm 
9 cm 
10 cm 
MECÔNIO
 
CARACTERÍSTICAS:
Exposição fetal
Coleta não-invasiva
Matriz complexa -dificuldade na análise
Período de detecção: meses
Disponibilidade 
Possibilidade de contaminação
UNHA
UNHA
CARACTERÍSTICAS:
Coleta não-invasiva
Baixa concentração
Dificuldade na análise
Período de detecção: meses
Uso intenso
Disponibilidade???? 
Adulteração: difícil
Possibilidade de contaminação
SUOR
CARACTERÍSTICAS:
Coleta não-invasiva
Coleta através de adesivos
“patch”
Baixa concentração
Dificuldade na análise
Não existem muitos estudos
Monitorar pacientes em tratamento 
 Aumento da seletividade e sensibilidade
-Derivação
	Objetivo:
	-melhorar as condições cromatográficas (GC)
	-aumentar a sensibilidade 
-Derivação
	Ex. opiáceos
BSTFA
70°C 20 min
Aumento da volatilidade (melhora das condições cromatográficas (GC)
-Derivação
	Ex. benzoilecgonina
Aumento da sensibilidade para detectores ECD
PFP/PFPA
70°C 20 min
Técnicas de extração e detecção em amostras biológicas de acordo com a 
estrutura química das moléculas
D
E
R
I
V
A
Ç
Ã
O
Fase estacionária e espessura do filme
Abreviação
Aplicação geral
Polidimetilsiloxano (100um)
PDMS
Compostos não-polares, voláteis
Polidimetilsiloxano (30um)
PDMS
Não-polares, voláteis e semi-voláteis
Polidimetilsiloxano (7um)
PDMS
Não-polares, semi e não voláteis
Polidimetilsiloxano-divinilbenzeno (65um)
PDMS-DVB
Polar
Poliacrilato (85um)
PA
Polar, uso geral, voláteis
Carboxeno-polidimetilsiloxano (75um, 85um)
CAR-PDMS
Voláteis
Carbowax-divinilbenzeno (65um, 75um)
CW-DVB
Polar, voláteis

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