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CAMPUS MANAUS – SALOMÃO MARTIM
Manaus, 18 de Outubro de 2017
MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS 
METODOLOGIAS 
Determinação de proteínas 
Grupo pertencente à proteína: 
Método por Biureto;
Método por fenol: Follin Ciocalteau Lowry;
Método por espectrofotometria ultravioleta;
Métodos turbidimétricos;
Método do dye-binding. 
Análises elementares: 
Análise de carbono;
Análise de nitrogênio:
Kjeldahl;
Dumas.
ANÁLISES ELEMENTARES 
Análise de carbono 
Digestão mais fácil do que para o nitrogênio;
Menores erros nos resutados: maior quantidade em relação ao nitrogênio;
Fator de correção mais constante que para o nitrogênio;
Maior dificuldade em separar os carbonos pertencentes à proteína dos carboidratos de outros componentes.
3
ANÁLISES ELEMENTARES 
Análise de nitrogênio
Determinação mais utilizada;
Considera que as proteínas tem 16 % de N em média;
Fator geral para transformação de proteína: 6,25;
16 g N 100 g proteinas 
n g N x g proteínas 
 x= n . 100 = n. 6,25
 16 
4
ANÁLISES ELEMENTARES 
Análise de nitrogênio
Fator de 6,25: erros quando o conteúdo de N varia de 16 %: 
Fatores específicos:
5,70
6,38
5,5
5
ANÁLISES ELEMENTARES 
Método de Kjeldahl 
Dinamarquês: Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl (1883);
Metodo original: modificações;
Mais utilizado na determinação de proteínas;
Determinação do N orgânico total: N proteico e não protéico ;
Razão entre N medido e proteina estimada: 
Variedade;
Condicoes de crescimento;
Quantidade e fertilizante. 
6
ANÁLISES ELEMENTARES 
Método de Kjeldahl 
Etapas: digestão ácida, destilação e titulação;; 
Digestão da amostra com ácido sulfúrico: oxidação do C e H;
Redução do N: transformação em sulfato de amônia;
Adição de hidróxido de sódio concentrado;
Liberação de amônia: solução de ácido bórico (borato de amônia);
Doseamento do borato de amônia com uma solução de ácido clorídrico.
7
ANÁLISES ELEMENTARES 
Método de Kjeldahl 
Amostra (N orgânico)
(NH4)2SO4 
NH3
(NH4)3BO3 
NH4Cl + H3BO3
H2SO4
NaOH
H3BO3
HCl
8
ANÁLISES ELEMENTARES 
ANÁLISES ELEMENTARES 
Método de Kjeldahl 
Modificações 
Wilforth (1885): adição de catalisadores (óxidos de mercúrio, cobre, ferro);
Mercúrio, cobre e selênio;
Mercúrio:
Superior ao cobre como catalisador;
Necessaria mais uma etapa no método para separar o complexo de mercurio-amônio formado;
Separação: precipitação do mercúrio com o tiossulfato de sódio.
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ANÁLISES ELEMENTARES 
Método de Kjeldahl 
Modificações 
Cobre:
Menos eficiente, toxicidade.
Selênio:
Efeito mais rápido que o mercúrio;
Não necessita de separação após o uso;
Perda de N se for utilizado em excesso ou se a T de digestão não for cuidadosamente controlada.
Atualmente se utiliza a mistura dos três catalisadores .
11
ANÁLISES ELEMENTARES 
Método de Dumas 
 Jean Baptiste Dumas (1831);
Determina N total: após combustão da amostra (T 700 a 900 °C);
Combustão da amostra:
Redução: 
CnHmX + a O2 900°C n CO2 + H2O + x N-óxidos 
N-óxidos 650 °C N2
catalisador
cobre
Cromatografia gasosa
12
ANÁLISES ELEMENTARES 
Método de Dumas 
13
ANÁLISES ELEMENTARES 
Método de Dumas 
Vantagens: 
Análise em 10 minutos com boa precisão;
Não há manipulação de reagentes perigosos em alta T;
Praticamente não há resíduos;
Limite de detecção de 0,003 mgN; ≥ 0,1 mg N (Kjeldahl).
Desvantagens:
Erros: amostra pequena, não representativa;
Equipamento e interferência de N não proteico.
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ANÁLISE POR GRUPOS 
Método do Biureto
Riegler (1914);
Reativo do biureto (cobre + hidróxido de sódio + complexante ( tartarato de sódio); 
 O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica;
Substâncias que contêm duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em soluções alcalinas; 
A intensidade da cor é proporcional à quantidade de proteína contida na amostra; 
Colorímetro;
ANÁLISE POR GRUPOS 
ANÁLISE POR GRUPOS 
Método do Biureto
Vantagens: 
Específico: sem problemas de interferentes;
É simples, rápido e barato;
Ligação peptídica: determina proteína.
Desvantagens:
Curva de calibração com padrão conhecido de proteína;
A cor formada não é idêntica para todas as proteínas. 
ANÁLISE POR GRUPOS 
Método por fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
Uma das primeiras determinações colorimétricas de proteínas (1912);
Baseia-se na interação das proteínas com o reagente fenol e cobre em condições alcalinas;
Reagente Follin-Ciocalteau: molibdato, tungstato e ácido fosfórico; 
Medição em colorímetro, seguido de comparação com uma curva padrão. 
ANÁLISE POR GRUPOS 
Método por fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
ANÁLISE POR GRUPOS 
Método por fenol (Follin-Ciocalteau-Lorry)
Vantagens: 
É de 10 a 20 vezes mais sensível que a determinação por UV e 100 vezes mais sensível que o método por biureto;
Bastante específico: poucas substâncias interferem (sacarose).
Desvantagens:
Intensidade da cor varia de acordo com a composição da proteína analisada;
Lento, destrói a amostra, muita manipulação;
Período de incubação entre a adição de reagentes;
Necessita de curva padrão com proteína conhecida.
ANÁLISE POR GRUPOS 
Método por espectrofotometria ultravioleta
Maioria das proteínas possui absorção UV em 280 nm devido à presença de tirosina, triptofano e fenilalanina que são aminoácidos aromáticos, com anel benzênico (duplas ligações conjugadas).
Vantagens: 
Rápido;
Simples
Não destrutivo.
ANÁLISE POR GRUPOS 
Método por espectrofotometria ultravioleta
Desvantagens: 
Resultados não precisos: dependem da concentração de tirosina, triptofano e fenilalaninana composição da proteína;
Ácidos nucléicos interferem na análise;
Preparação da amostra para leitura espectrofotométrica é longa.
ANÁLISE POR GRUPOS 
Métodos turbidimétricos
Baseia-se na turbidez causada pela proteína precipitada por algum agente precipitante (ácido tricloroacético, ferricianeto de potássio e ácido sulfossalicílico).
Vantagens: 
Rápido;
Simples
ANÁLISE POR GRUPOS 
Métodos turbidimétricos
Desvantagens: 
Não compensa ser utilizado em amostras sólidas (proteína deve ser extraída para uma solução);
Resultados variam com o tipo de proteína;
Precipitação de outras substâncias: interferência;
Padrões com conteúdo de proteínas conhecido. 
ANÁLISE POR GRUPOS 
Método dye-binding
1944: uso em alimentos tem crescido;
A amostra é tratada com corante (indicador), o corante reage e a proteína reagem quantitativamente para formar um complexo insolúvel que pode ser separado por centrifugação ou filtração; 
O excesso de corante que não reagiu é medido colorimetricamente e, por diferença, obtem-se indiretamente a quantidade de proteína da amostra;
Utilizado para grãos de cereais, sementes oleaginosas, produtos vegetais, animais e laticínios. 
ANÁLISE POR GRUPOS 
Método dye-binding
Equipamentos comerciais:
Rápido;
Reação colorimétrica;
Filtração do complexo insolúvel; 
Medida colorimétrica da solução filtrada.
ANÁLISE POR GRUPOS 
Método dye-binding
Corantes utilizados:
Laranja G;
Laranja 12;
Vermelho A;
Preto búfalo;
Preto amino 10B.
ANÁLISE POR GRUPOS 
Métodos físicos
Índice de refração;
Densidade específica;
Viscosidade;
Tensão superficial;
Condutividade;
Polarização. 
Obrigado!