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1 1. INTRODUÇÃO Os amidos são polímeros de α -D-glicose e são encontrados em células vegetais como grânulos no citosol. Pode-se distinguir os tipos de amido por seus graus de ramificação na cadeia. A amilose é um polímero linear da glicose e possui todos os resíduos unidos por ligações α(1→4) enquanto a amilopectina é um polímero de cadeia ramificada e suas ramificações se iniciam nas ligações α(1→6) ao longo da cadeia de ligações α(1→4) (CAMPBELL, 2008; NELSON; COX, 2014 ). Figura 1 - Segmento curto de amilose, polímero linear de resíduos de D-glicose em ligações α(1→4). Fonte – NELSON; COX, 2014. Figura 2 - Ponto de ramificação α(1→6) no glicogênio ou na amilopectina. Fonte – Internet. 2 Os amidos são moléculas de armazenamento, existe então um mecanismo para a liberação de glicose do amido quando o organismo precisa de energia. Os vegetais e os animais possuem enzimas que hidrolisam o amido (CAMPBELL, 2008). Enzimas são proteínas, polímeros de cadeia longa com aminoácidos sucessivamente ligados uns aos outros através de ligações peptídicas em uma sequencia e apresentam atividade catalítica. As enzimas são catalizadoras de reações que ocorrem no sistema biológico, apresentam grande eficiência catalítica. Elas têm um alto grau de especificidade por seus substratos, aceleram reações químicas e funcionam em soluções aquosas sob condições muito suaves de temperatura e pH (NELSON; COX, 2011). Um dos estudos realizados para avaliar a catálise biológica das enzimas foi o estudo da conversão do amido em açucares simples pela saliva e por vários extratos vegetais em 1800 (NELSON; COX, 2011). A maioria das enzimas são proteínas, com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA, que apresentam propriedades catalíticas. A sua atividade catalítica depende da integridade de sua conformação protéica nativa pois se uma enzima é quebrada em seus aminoácidos constituintes, a sua atividade catalítica é sempre destruída. As estruturas protéicas primária, secundária, terciária e quaternária das enzimas são essenciais para a sua atividade catalítica (NELSON; COX, 2011). A maioria das enzimas apresentam melhor desempenho em temperaturas que variam de 30 °C a 70 °C e com valores de pH próximos a neutralidade. Nas reações enzimáticas, a velocidade aumenta com a temperatura, até atingir uma velocidade máxima, a partir da qual começa a decrescer, com isso, as enzimas possuem uma temperatura ótima. Cada reação possui também um pH ótimo, valores baixos ou altos de pH podem causar desnaturação proteica considerável e consequente inativação enzimática. 3 O amido ingeridos na dieta são hidrolisados por α e β -amilases e, enzimas presentes na saliva e no intestino que rompem ligações glicosídicas α(1→4) entre as unidades de glicose (NELSON; COX, 2014). As α-amilases (endoglicosidades) existem na saliva, na secreção pancreática e também em plantas. As α-amilases cindem a cadeia no meio e não a partir das extremidades e produz glicose e maltose. As β-amilases (exoglicosidases) estão presentes amplamente no reino vegetal e atacam as cadeias poliglicosídicas dos amidos a partir do terminal não-redutor e o produto da reação é a maltose (MOTTA, 2009). 2. OBJETIVO Realizar a hidrólise química e enzimática do amido, utilizando a enzima amilase em diferentes valores de temperatura. 3. MATERIAIS E REAGENTES MATERIAIS REAGENTES Erlenmeyer Solução de amido 1% Proveta de 50mL Solução de Lugol Pipeta de 3 e 5 mL Solução de HCl 1:2 Tubos de ensaio Solução salina (NaCl) a 0,95% Conta-gotas Gelo Bécker Saliva (Michael) 4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 4.1. Procedimento da hidrólise química Rotulou-se um Erlenmeyer da seguinte forma: amido + HCl. Posteriormente foram adicionados 30 mL da solução de amido a 1% e 3mL da solução de HCl 1:2 e foi reservado. Em seguida, foram numerados 3 tubos de ensaio. O Tubo 1 (AA1), Tubo 2 (AA2) e Tubo 3 (AA3). 4 Ao tubo AA1, foram adicionados 5mL de água destilada e 5mL da solução do erlenmeyer (amido+HCl) e imediatamente o tubo foi colocado em um bécker com gelo. Ao tubo AA2, foram adicionados 5mL de água destilada e com auxílio de uma pipeta, foram adicionados 5mL da solução do erlenmeyer (amido+HCl) e posteriormente foi levado ao banho em água fervendo por um período de 10’ e posteriormente levado ao banho de gelo. Ao tubo AA3, foram adicionados os mesmos volumes dos tubos anteriores e posteriormente o tubo ficou no banho em água fervendo por 20’ e posteriormente ao banho de gelo. Os tubos foram retirados do banho de gelo ao mesmo tempo e esperou- se que atingissem a temperatura ambiente. Em seguida foram adicionadas 10 gotas da solução de lugol em cada um dos tubos. 4.2. Procedimento da hidrólise enzimática Inicialmente, foram secretados 1mL de saliva (de Michael) e adicionados a um tubo de ensaio e posteriormente foram adicionados 9mL de água destilada e reservado. Rotulou-se um erlenmeyer da seguinte forma: amido + solução da saliva. A este erlenmeyer foram adicionados 30mL da solução de amido1% e 1mL da solução de saliva 10% (que estava no tubo de ensaio), também foi reservado. Três tubos de ensaio foram rotulados da seguinte forma: Tubo 1 (AE1), Tubo 2 (AE2) e Tubo 3 (AE3). Ao Tubo AE1 adicionou-se 5mL de água destilada e 5mL da solução do erlenmeyer (amido + solução da saliva) e foi imediatamente colocado no banho de gelo em um bécker. Ao Tubo AE2, adicionou-se 5mL de água destilada e após, foram adicionados 5mL da solução do erlenmeyer. Em seguida esperou-se que 5 atingisse a temperatura ambiente durante 10’ e ao atingir o tempo esperado, foi levado ao banho de gelo. Ao Tubo AE3, foram adicionados os mesmos volumes de água e solução dos tubos anteriores e esperou-se que atingisse a temperatura ambiente durante 20’ e após este tempo, o tubo foi levado ao banho de gelo. Novamente, os tubos foram retirados do banho e gelo ao mesmo tempo e ao atingirem a temperatura ambiente foram adicionadas 10 gotas de solução lugol em cada tubo. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Procedimento da hidrólise química Com a adição de HCl e posterior aquecimento, favoreceu a quebra das ligações glicosídicas constituintes do amido, convertendo-o em glicose, que representa sua menor parte. Conforme Equação 1. (C6H10O5)n + n H2O n C6H10O6 (Equação 1) Após a adição da solução de Lugol, o tubo AA1 apresentou coloração azul escuro e com formação de precipitado. O tubo AA2 formou um precipitado laranja e uma coloração laranja bem escura. No tubo AA3 também houve a formação de um precipitado, porém, de coloração menos intensa em relação ao AA2. O lugol é utilizado justamente para determinar a presença de amido na solução. Quanto mais tempo a solução ficou exposta a alta temperatura, permitiu que assim as ligações fossem quebradas, quanto menos tempo exposto às ligações quebradas não são tão efetivas e não foi possível chegar a sua menor parte que é a glicose. 6 Figura 3 – Coloração final dos tubos AA1, AA2 e AA3, após a adição de Lugol em cada um deles. 5.2. Procedimento da hidrólise enzimática Uma enzima, a α-amilase, encontrada no trato digestivo dos animais (na saliva e no suco pancreático), hidrolisa a cadeia linear da amilose, atacando ao acaso as ligações α-1,4 por toda a cadeia, produzindo uma mistura de maltosee glucose. A β-amilase, uma enzima encontrada nas plantas, ataca a extremidade não-redutora da amilose, dando sucessivas unidades de maltose. A amilopectina também pode ser atacada por α e β-amilase, mas as ligações α-1,4 próximas das ramificações da amilopectina, e as ligações α-1,6, não são hidrolisadas por essas enzimas. Desse modo, um núcleo condensado, altamente ramificado, obtido da amilopectina original, denominado dextrina limite, é o produto dessas enzimas. E em condições específicas de pH 6,8 e temperatura 37ºC, catalisa a hidrólise das ligações osídicas α-1,4 da cadeia glicosídica do polissacarídeo amido. E o efeito da temperatura sobre a velocidade das reações enzimáticas é duplo. A velocidade da reação aumenta com o aumento da temperatura até que um máximo seja atingido, num mecanismo denominado de ativação térmica. Acima da temperatura de atividade enzimática máxima, ocorre diminuição da velocidade da reação 7 devido ao processo de desnaturação protéica. A degradação das dextrinas- limite por β-amilases só é possível depois que as ligações 1-6 dos pontos de ramificação foram cindidas por glicosidades específicas. As enzimas quando estão sujeitas a baixas temperaturas ficam inativas, devido à falta de energia de ativação para provocar o choque entre as moléculas enzimáticas e as moléculas do substrato. Por isso, na solução do tubo AE1, a coloração ficou azul/verde bem escuro com a adição do iodo, pois esta estava sujeita a uma baixa temperatura, assim não foi possível ocorrer a catalise da quebra da enzima, o mesmo foi verificado nas soluções dos tubos AE2 e AE3, que ficaram em presença da temperatura ambiente (Esquecemos de tirar foto deste momento). 6. CONCLUSÕES Por meio da prática experimental pode-se verificar que a catalise enzimática não ocorre como muitas das reações químicas, onde existe a elevação da temperatura para maior rapidez das reações. Na catalise enzimática isso é válido até determinado limite, pois existindo uma grande elevação da temperatura de trabalho pode ocorrer uma desnaturação da proteína que constitui a enzima estudada. Analisou-se também, que a hidrólise química e enzimática do amido, ocorre mais rapidamente com o aumento da temperatura, favorecendo com isso, uma hidrólise eficiente. 7. REFERÊNCIAS CONN, Eric Edward e P.K. Stumpf. Introdução à bioquímica. São Paulo, Edgard Blucher, 1980. DOSE, Klaus. Bioquímica. Ed. da Universidade de São Paulo, SP: EPU, Springer 1982. NELSON, David L. COX, Michael M.; Princípios de Bioquímica de Lehninger, 6 ed., Porto Alegre: Artmed, 2014. 1273 p. 8 CAMPBELL, M. K., FARRELL, S. O., Bioquímica, 5 ed., 3 v., São Paulo: Thomson, 2008. MOTTA, V. T. Enzimas. Bioquímica clínica: princípios e interpretações, v. 9, p. 91–120, 2009.
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