Extracao e precipitacao ptn.pdf

Prévia do material em texto

Métodos	
  de	
  extração	
  e	
  
precipitação	
  de	
  proteínas	
  
Biotecnologia	
  
Purificação	
  de	
  moléculas	
  
IBF-­‐020	
  
	
  
Métodos para obtenção do homogenado            
Rompimento 
mecânico 
Ø  	
  Homogenizador	
  ou	
  moinho	
  de	
  perólas	
  
Moinho	
  de	
  perolas	
  =	
  agitação	
  ou	
  maceração	
  em	
  contao	
  com	
  as	
  
perólas.	
  
Homogenizador	
  (Prensa	
  Francesa)=	
  bombemanto	
  a	
  pressão	
  
posiFva	
  por	
  um	
  oriHcio.	
  	
  
•  Sistema	
  de	
  refrigeração	
  
•  Aplicação	
  industrial	
  
	
   Cavitação,	
  turbulência	
  e	
  
cisalhamento	
  
Ø  	
  Ultra-­‐som	
  
Ondas	
  sonoras,	
  frequência	
  16-­‐20Hz	
  >>	
  ondas,	
  bolhas	
  de	
  
cavitação	
  >>>	
  colapso	
  e	
  impacto	
  
•  Escala	
  laboratorial	
  	
  
•  Requer	
  controle	
  de	
  temperatura	
  
Métodos para obtenção do homogenato            
Rompimento 
não mecânico 
Ø  	
  Choque	
  osmóCco	
  
•  Formação	
  de	
  uma	
  permeabilidade	
  seleFva	
  
•  	
  Solução	
  hipertônica	
  (sacarose	
  20%)	
  
•  	
  Bactérias	
  gram-­‐negaFvas	
  
•  	
  Técnica	
  seleFva	
  
Métodos físicos 
Métodos para obtenção do homogenado            
Ø  	
  Ciclos	
  de	
  congelamento	
  e	
  descongelamento	
  
•  Estabilidade	
  das	
  enzimas	
  aos	
  ciclos	
  
•  DiHcil	
  implantação	
  em	
  larga	
  escala	
  
Rompimento 
não mecânico 
Métodos físicos 
Ø  	
  Termólise	
  
•  Escala	
  industrial	
  
•  	
  50,	
  60	
  até	
  90oC	
  por	
  diferentes	
  períodos	
  de	
  tempo!	
  
•  Fragmentos	
  celulares	
  maiores	
  >>	
  Filtração	
  ou	
  centrifugação	
  
Métodos para obtenção do homogenado            
Ø  	
  Autólise	
  por	
  solventes	
  apolares	
  	
  ou	
  solução	
  alcalina	
  
•  Leveduras	
  tratadas	
  com	
  tolueno,	
  metanol	
  ou	
  acetona	
  (liquefaz)	
  ou	
  em	
  contato	
  
com	
  solução	
  alcalina	
  (NaOH:	
  0,5M)	
  ou	
  amônia	
  	
  
•  Necessita	
  da	
  molécula	
  estável	
  em	
  pH	
  alcalino	
  
•  Gera	
  resíduo	
  poluente!	
  	
  
Rompimento 
Quimíco 
Ø  	
  Detergentes	
  
•  CaracterísFca	
  anfipáFca	
  da	
  molécula	
  
•  	
  Auxilia	
  na	
  dissociação	
  de	
  proteínas	
  e	
  lipoproteínas	
  
•  Desvantagem:	
  Formação	
  espumas	
  -­‐-­‐à	
  desnaturação	
  proteíca	
  
Sendo	
  a	
  proteína	
  de	
  interesse	
  
uma	
  proteína	
  de	
  membrana,	
  é	
  
necessário	
  solubilizá-­‐la.	
  Para	
  esse	
  
fim	
  são	
  uFlizados	
  detergentes,	
  
que	
  dissolvem	
  a	
  membrana	
  
plasmáFca	
  e	
  formando	
  
complexos	
  solúveis	
  com	
  as	
  
proteínas.	
  
Proteínas	
  
integrais	
  da	
  
membrana	
  
detergente	
   micelas	
  
Complexos	
  não	
  
micelares	
  
Dependendo	
  da	
  concentração	
  
Detergentes	
  podem	
  ser	
  iônicos	
  e	
  
não	
  iônicos	
  
Detergente não iônico 
Triton X-100 
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol) 
SDS 
Dodecil sulfato de 
sódio 
Cetab 
Cetyltrimethylammonium 
bromide 
Detergentes iônicos 
Métodos para obtenção do homogenado            
	
  
Mecanismo	
   de	
   rompimento:	
   remoção	
   parcial	
   ou	
   total	
   da	
   parede	
  
celular	
   pela	
   atuação	
   de	
   enzimas	
   possibilitando	
   o	
   rompimento	
   da	
  
membrana	
  celular	
  por	
  pressão	
  osmóFca.	
  
	
  
•  Vantagem:	
   muito	
   adequado	
   para	
   recuperação	
   de	
   biomoléculas	
  
sensíveis	
   ao	
   rompimento	
   mecânico,	
   temperatura	
   e	
   elevadas	
  
pressões.	
  	
  
•  Desvantagem:	
  alto	
  custo	
  das	
  enzimas	
  
	
  
ü  Fatores	
  a	
  ser	
  considerados:	
  	
  
•  presença	
  de	
  inibidores	
  
•  Reciclagem	
  das	
  enzima	
  (imobilização	
  p.ex)	
  	
  
Rompimento 
Enzimático Microorganismos	
  e	
  células	
  vegetais	
  
•  Adequação	
  do	
  protocolo	
  aos	
  microrganismos	
  	
  
–  Leveduras:	
  	
  glucanases,	
  proteases	
  e	
  mananases,	
  as	
  quais	
  hidrolisam	
  
componentes	
  específicos	
  da	
  parede,	
  como	
  glucanas,	
  proteínas	
  e	
  
mananas.	
  
–  Bactérias:	
  Gram-­‐negaFvas	
  =	
  desestablizar	
  a	
  membrana	
  externa	
  
(agentes	
  quelantes)	
  e	
  enzimas	
  que	
  atuam	
  sobre	
  as	
  ligações	
  covalentes	
  
da	
  estrutura	
  do	
  pepFdeoglicano.	
  Gram-­‐posiFvas=	
  hidrólise	
  das	
  
ligações	
  glicosídicas	
  do	
  pepFdioglicano	
  (lisozima	
  e	
  quiFnase).	
  	
  
	
  
Estratégias e passos da purificação 
            
CIPP-­‐	
  capture,	
  intermediate	
  purificaFon	
  and	
  polishing	
  
•  Adição	
  de	
  inibidores	
  de	
  proteases	
  (para	
  diminuir	
  o	
  efeito	
  da	
  
degradação	
  de	
  proteínas);	
  
	
  
•  Adição	
  de	
  agentes	
  redutores	
  [para	
  evitar	
  a	
  oxidação	
  dos	
  síFos	
  
aFvos	
  (-­‐SH)	
  das	
  enzimas	
  após	
  o	
  rompimento];	
  
	
  
•  Adição	
  de	
  nucleases	
  ou	
  proteases	
  podem	
  melhorar	
  as	
  
caracterísFcas	
  do	
  meio,	
  desde	
  que	
  não	
  destruam	
  a	
  molécula	
  de	
  
interesse;	
  
	
  
•  Alteração	
  de	
  pH	
  pode	
  melhorar	
  a	
  viscosidade	
  do	
  meio.	
  
Propiciar a estabilidade da molécula-alvo 
            
Inibidores	
   Observações	
  
Métodos de purificação de baixa resolução 
            
•  	
  Precipitação	
  fracionada	
  (solventes,	
  alterando	
  pH	
  e	
  [sais])	
  
•  	
  Separação	
  por	
  membranas	
  
•  	
  Extração	
  em	
  sistemas	
  de	
  duas	
  fases	
  líquidas	
  	
  
Solubilidade proteíca 
            
Região	
  
Hidrofóbica	
  
(Apolar)	
   Regiões	
  HidroNlicas	
  
(Polares)	
  
Determinantes	
  da	
  solubilidade	
  
Desnaturação 
            
Precipitação 
            
•  Desnaturação:	
  
compreende	
   a	
   destruição	
   da	
   estrutura	
   terciária	
   de	
   uma	
  molécula	
  
de	
  proteína	
  e	
  a	
  formação	
  de	
  cadeias	
  polipepkdicas	
  ao	
  acaso.	
  
ü  Variações	
  de	
  pH,	
  temperatura	
  e	
  adição	
  de	
  solventes	
  orgânicos.	
  
Desnaturação 
            
Precipitação 
            
•  Desnaturação:	
  
compreende	
   a	
   destruição	
   da	
   estrutura	
   terciária	
   de	
   uma	
  molécula	
  
de	
  proteína	
  e	
  a	
  formação	
  de	
  cadeias	
  polipepkdicas	
  ao	
  acaso.	
  
ü  Variações	
  de	
  pH,	
  temperatura	
  e	
  adição	
  de	
  solventes	
  orgânicos.	
  
•  Precipitação:	
  	
  
Modificações	
  da	
  estrutura	
  3D	
  das	
  proteínas	
  mas	
  não	
  com	
  perda	
  de	
  
seu	
   padrão	
   de	
   conformação,	
   conservando	
   dobramentos	
   de	
  
estrutura	
  2º	
  e	
  padrões	
  da	
  conformação	
  de	
  domínios	
  existentes.	
  	
  
	
  
A	
   precipitação	
   deve	
   permiFr	
   que	
   a	
   conformação	
   adequada	
   da	
  
proteína	
   seja	
   recuperada,	
   para	
   que	
   a	
   mesma	
   possa	
   “exercer”	
  
sua	
  função	
  bioquímica	
  após	
  o	
  processo.	
  
Precipitação 
            
Precipitante	
  	
   Princípio	
  	
   Vantagens	
  	
   Desvantagens	
  	
  
Sais	
  neutros(Sal%ng-­‐out)	
  
Interações	
  hidrofóbicas	
  pela	
  
redução	
  da	
  camada	
  de	
  hidratação	
  
da	
  proteína	
  
-­‐	
  Uso	
  universal	
  	
   -­‐	
  Corrosivo	
  	
  
-­‐	
  Baixo	
  custo	
   -­‐	
  Liberação	
  de	
  amônia	
  em	
  pH	
  alcalino	
  
Polímeros	
  não-­‐iônicos	
   Exclusão	
  da	
  proteína	
  da	
  fase	
  
aquosa	
  reduzindo	
  a	
  quanFdade	
  de	
  
água	
  disponível	
  para	
  a	
  solvatação	
  
da	
  proteína	
  
-­‐	
  Uso	
  de	
  pequenas	
  
quanFdades	
  de	
  precipitante	
  
-­‐	
  Aumento	
  da	
  viscosidade	
  
Calor	
   interações	
  hidrofóbicas	
  e	
  
interferência	
  das	
  moléculas	
  de	
  água	
  
nas	
  ligações	
  de	
  hidrogênio,	
  
-­‐	
  Baixo	
  custo	
  	
   -­‐	
  Risco	
  de	
  desnaturação	
  
-­‐	
  Simples	
  
Polieletrólitos	
  	
   Ligação	
  com	
  a	
  molécula	
  de	
  proteína	
  
atuando	
  como	
  agente	
  floculante	
  
-­‐	
  Uso	
  de	
  pequenas	
  
quanFdades	
  de	
  precipitante	
  
-­‐	
  Risco	
  de	
  desnaturação	
  
Precipitação	
  isoelétrica	
   Neutralização	
  da	
  carga	
  global	
  da	
  
proteína	
  pela	
  alteração	
  do	
  pH	
  do	
  
meio	
  
-­‐	
  Uso	
  de	
  pequenas	
  
quanFdades	
  de	
  precipitante	
  
-­‐	
  Risco	
  de	
  desnaturação	
  
Sais	
  metálicos	
   Formação	
  de	
  complexos	
   -­‐	
  Uso	
  de	
  pequenas	
  
quanFdades	
  de	
  precipitante	
  
-­‐	
  Risco	
  de	
  desnaturação	
  
Solventes	
  orgânicos	
   Redução	
  da	
  constante	
  dielétrica	
  do	
  
meio	
  aumentando	
  as	
  interações	
  
eletrostáFcas	
  intermoleculares	
  
-­‐	
  Facilidade	
  de	
  reciclagem	
  	
   -­‐	
  Risco	
  de	
  desnaturação	
  de	
  proteínas	
  	
  
-­‐	
  Facilidade	
  na	
  remoção	
  do	
  
precipitado	
  
-­‐	
  Inflamável	
  e	
  explosivo	
  
Precipitação salina 
            
solubilidade 
Camada de 
solvatação 
Precipitação salina 
            
So
lu
bi
lid
ad
e,
 lo
g 
Fibrinogênio Pseudoglobulina 
Mioglobina Albumina 
Hemoglobina 
Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar 
 
Proteínas	
  apresentam	
  diferente	
  sensibilidade	
  para	
  a	
  
precipitação	
  salina.	
  
-­‐as	
  primeiro	
  a	
  precipitar	
  são	
  as	
  proteínas	
  
	
   	
  maiores	
  
	
  proteínas	
  mais	
  hidrofóbicas	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  possuem	
  camadas	
  de	
  solvatação	
  maiores	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  ou	
  menos	
  organizadas,	
  mais	
  fáceis	
  de	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
pertubar.	
  	
  
Precipitação	
  fracionada	
  
•  Meios/misturas	
  complexos	
  
•  2	
  ou	
  mais	
  etapa	
  =	
  corte	
  	
  
•  1o)	
  Remoção	
  das	
  proteínas	
  contaminantes	
  (+solúveis)	
  
•  2o)	
  e	
  demais	
  cortes:	
  precipitação	
  da(s)	
  molécula(s)	
  de	
  interesse	
  
•  	
  Variação	
  da	
  concentração	
  do	
  agente	
  precipitante	
  
Precipitação fracionada 
            
So
lu
bi
lid
ad
e,
 lo
g 
Fibrinogênio Pseudoglobulina 
Mioglobina Albumina 
Hemoglobina 
Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar 
 
Precipitação isoelétrica 
            
pI 
- - + + 
Grande	
  dependência	
  do	
  valor	
  de	
  pH	
  para	
  a	
  solubilidade	
  das	
  proteínas	
  
Carga	
  total	
  zero	
  leva	
  ao	
  ⇑	
  da	
  agregação	
  devido	
  à	
  ⇓	
  repulsão	
  =>	
  perfis	
  de	
  
solubilidade	
  em	
  diferentes	
  valores	
  de	
  pH	
  
	
  
	
  
O	
  ponto	
  de	
  solubilidade	
  mínima	
  é	
  igual	
  ou	
  próximo	
  ao	
  ponto	
  isoelétrico	
  (pI),	
  
que	
  corresponde	
  ao	
  valor	
  de	
  pH	
  no	
  qual	
  a	
  proteína	
  possui	
  carga	
  global	
  igual	
  
a	
  zero.	
  
Precipitação por solventes orgânicos 
            
A	
   solubilidade	
   das	
   proteínas	
   varia	
   com	
   a	
   distribuição	
   dos	
   resíduos	
  
hidroHlicos	
  e	
  hidrofóbicos	
  na	
  superHcie	
  da	
  molécula;	
  
CaracterísFcas	
  indispensáveis	
  aos	
  solventes:	
  
•  miscível	
  em	
  água	
  
•  não	
  reaFvo	
  com	
  diretamente	
  com	
  as	
  biomoléculas	
  
•  Alta	
  eficiência	
  na	
  precipitação	
  
Vantagens	
  do	
  uso	
  dos	
  solventes	
  
•  VolaFlidade	
  (secagem	
  a	
  vácuo	
  em	
  	
  	
  	
  	
  	
  temperaturas)	
  
•  	
  Propriedade	
  bactericida	
  
•  	
  Baixa	
  densidade	
  para	
  muitos	
  o	
  que	
  facilita	
  
	
  a	
  sedimentação	
  do	
  precipitado	
  (rapidez)	
  
	
  
	
   Constante	
  
dielétrica	
  do	
  
meio	
  
Precipitação por solventes orgânicos 
            
•  Variáveis	
  que	
  afetam	
  o	
  processo	
  
ü Temperatura:	
   abaixo	
   de	
   10º	
   C	
   podem	
   garanFr	
   que	
   não	
   haja	
  
desnaturação!	
  
ü Adição	
  do	
  solvente	
  ⇑	
  temperatura	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  Lenta	
  e	
  sob	
  refrigeração	
  
	
  
–  pH:	
  próximo	
  ao	
  pI	
  potencializa	
  a	
  precipitação	
  com	
  solvente	
  (reduz	
  
a	
  concentração)	
  
1940:	
  Escala	
  industrial=	
  Fracionamento	
  das	
  proteínas	
  do	
  plasma	
  sanguíneo	
  por	
  etanol	
  a	
  frio.	
  	
  
II	
  Guerra	
  Mundial	
  –	
  Abastecimento	
  das	
  tropas	
  
Precipitação com polímeros 
            
PEG	
  (polieClenoglicol)	
  
polímero	
  de	
  alta	
  massa	
  molar,	
  neutro	
  e	
  miscível	
  em	
  água,	
  
encontrado	
  em	
  diversos	
  graus	
  de	
  polimerização;	
  
	
  
Baixa	
  grau	
  (15	
  a	
  30%)	
  do	
  polímero	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  maior	
  eficiência	
  
Mecanismo:	
  exclusão	
  da	
  proteína	
  do	
  meio	
  aquoso;	
  
Concentração	
   inversamente	
   proporcional	
   à	
   concentração	
   da	
  
proteína;	
  
Remoção	
   do	
   polímero:	
   ultrafiltração,	
   adição	
   de	
   etanol,	
   separação	
  
pela	
  formação	
  de	
  duas	
  fases	
  aquosas	
  pela	
  adição	
  de	
  sais.	
  
Não-­‐iônicos	
  
Precipitação com polímeros 
            
•  Polieletrólitos:	
   polímeros	
   iônicos	
   solúveis	
   em	
   água;	
   usados	
  
devido	
  ao	
  baixo	
  custo	
  e	
  pouca	
  concentração	
  residual;	
  
–  PolicáFon	
   polieFlenoimina	
   e	
   poliânion	
   ácido	
   poliacrílico,	
  
uFlizados	
  para	
  precipitar	
  ácidos	
  nucléicos	
  e	
  proteínas.	
  
–  Agregação	
   à	
   proteína	
   (floculação)	
   ou	
   eletrostáFco	
  
(neutralização	
  de	
  cargas);	
  a	
  proteína	
  e	
  o	
  polieletrólito	
  devem	
  
ter	
   cargas	
  opostas	
   ,	
   por	
   isso,	
   deve-­‐se	
  operar	
   longe	
  do	
  ponto	
  
isoelétrico	
  da	
  proteína.	
  	
  
Iônicos	
  
ácido	
  poliacrílico	
  
Precipitação por afinidade 
            
•  Baseia-­‐se	
   na	
   interação	
   específica	
   e	
   seleFva	
   da	
  molécula-­‐alvo	
   com	
  
um	
  ligante.	
  	
  
•  Polímero	
  com	
  o	
  ligante	
  solúvel	
  em	
  pH	
  X	
  >>>>>>	
  insolúvel	
  pH	
  Y.	
  	
  
	
  
Precipitação por íons metálicos polivalentes 
            
•  	
  grupos	
  –COOH	
  	
  e	
  grupos	
  nitrogenados	
  	
  
•  GruposCOOH	
  mas	
  não	
  grupos	
  aminas	
  
•  	
  	
  Grupos	
  -­‐SH	
  
	
  
(Mn+2,	
  Fe+2,	
  Co+2)	
  
(Ca+2,	
  Mg+2,	
  Ba+2)	
  
(Ag+	
  e	
  Hg+)