Electroforese de proteínas plasmaticas

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Introdução
As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes nas células, perfazendo 50% ou mais do seu peso seco. Podem ser encontradas em todas as partes de todas as células, uma vez que são fundamentais sob todos os aspectos de estrutura e função celulares, sendo que cada proteína é especializada para uma determinada função biológica. Podemos então afirmar que são constituintes básicos da vida.[1]
As proteínas plasmáticas são um grupo de proteínas provenientes do plasma e que incluem as proteínas simples, conjugadas (glicoproteínas) e as lipoproteínas. São geralmente divididas em três grupos, são eles a albumina, globulinas e fibrinogénio.[5]
Pertencendo à classe dos péptidos, são formadas por aminoácidos ligados entre sí por ligações peptídicas (união do grupo amino -NH2 de um aminoácido com o grupo carboxila –COOH de outro aminoácido).[2]
Fig.1- Ligacão peptidica entre dois aminoácidos
 	Os aminoácidos são constituídos por um grupo amina (NH2) e um grupo carboxílico (COOH) ligados a um átomo de carbono central denominado carbono alfa - C. A presença destes dois grupos vai permitir aos aminoácidos comportarem-se ou como um ácido, ou como uma base, estando este comportamento dependente do pH da solução e da constituição do próprio aminoácido, podendo este existir sobre três formas; forma ácida (+NH3CHRCOOH), forma básica (NH2CHRCOO-) e ainda sob a forma de sal (+NH3CHRCOO-), onde C representa o átomo de carbono central, H o átomo de hidrogénio que se encontra a ele ligado e R um grupo que se encontra ligado ao átomo de carbono central e que difere de aminoácido para aminoácido, conferindo-lhe diversas propriedades. È com base nestas propriedades que surgiram vários métodos para separar e identificar os diferentes aminoácidos e proteínas. Um desses métodos é a electroforese.[3]
A electroforese baseia-se na migração de proteínas através de um campo eléctrico que diferem na sua carga total podendo por isso serem separadas por este método. Utilizada especialmente como método analítico, permite a visualização das diferentes proteínas que constituem uma mistura, ou ainda a determinação do grau de pureza de uma mistura proteica. Permite também a determinação de certas propriedades físicas, como o ponto isoeléctrico e o peso molecular de uma proteína. 
Neste método, as proteínas ou aminoácidos são separados a um determinado pH, quando este iguala o ponto isoeléctrico vai existir uma maior quantidade de amnoácidos sob a forma de sais que, geralmente se apresentam em pequenas quantidades, formando-se um agregado insolúvel que tem pouca tendência a desolocar-se sob a acção do campo eléctrico. Assim, a solubilidade mínima de um aminoácido dá-se ao pH do seu ponto isoeléctrico, pois como não existem tantos iões em solução, o aminoácido torna-se inerte sob a acção do campo eléctrico.[4]
Caso realizasse-mos a experiência, procederiamos da seguinte forma, utilizando os seguintes materiais e reagentes:
Parte experimental
Material
Tina de electroforese
Tiras de celulose (oxoide 12,5 x 2,0 cm)
Vasilha de plástico
Folhas de papel de filtro
Micropipetas P10
Fios eléctricos e fonte de tensão
Pinças
Placas de vidro
Estufa
Reagentes
Tampão Tris-Hipurato, pH=8,8
Solução de coloração: 0,5%(p/v) Ponceau-S em ácido tricloroacético a 5%(p/v)
Ácido acético a 5% (p/v)
Solução de transparentização(metanol:ácido acético puro:glicerol(85:14:1))
Plasma sanguíneo humano
Método experimental
Para se estudar as proteínas do soro humano, procederia-se da seguinte forma:
Enchia-se a tina de electroforese com solução tampão e colocaria-se a ponte.
“Ensopava-se” as tiras de celulose com tampão, pelo menos durante 20 minutos numa vasilha de plástico à parte; para se evitar a adesão de bolhas de ar deixando-se primeiro flutuar as tiras sobre o tampão de modo a caírem quando saturadas.
Colocaria-se as tiras entre duas folhas de papel de filtro para remover o excesso de tampão.
Colocaria-se as tiras sobre a ponte com a parte brilhante para baixo,de modo a ficarem paralelas umas às outras e aos lados da tina.As tiras a serem aplicadas correctamente tiveram de ficar com o canto cortado para o lado inferior direito.
Colocaria-se os fixadores contra os lados das pontes para assegurar o contacto entre as tiras e o tampão e para que ficassem esticadas.
Aplicaria-se cerca de 3 μL de plasma em cada tira a aproximadamente 2 cm do bordo catódico.Deslocou-se o plasma contido numa micropipeta atravessando a tira com um movimento rápido mas firme,iniciando a cerca de 0,5 cm do lado.
Colocaria-se a tampa da tina imediatamente após a aplicação dos plasmas nas tiras.
Ligava-se os fios eléctricos da tina à fonte de tensão, tendo o cuidado de assegurar a polaridade correcta das ligações.
Ligava-se a fonte de tensão,fixando a voltagem para 200 volt,e seguiu-se a intensidade da corrente.
Após 30 min desligava-se a fonte de tensão, removia-se rapidamente as tiras da tina que foram colocadas na solução corante de Ponceau-s.onde ficaram cerca de 5-10 min.
Colocava-se as tiras em ácido acético a 5%(v/v) para remover o excesso de corante.O ácido tricloroacético tinha fixado as proteínas coradas nas tiras.
Por fim, procedia-se à transparentização das tiras.Para isso, mergulhava-se as tiras em metanol puro anidro(pelo menos 30 s) e em seguida na solução de transparentização(constituída por 85 mL de metanol,14 mL de ácido acético e 1 mL de glicerol) durante 1 minuto.Em seguida colocava-se as tiras numa placa de vidro dentro da estufa a 60ºC durante 2 min.Deixava-se arrefecer a placa de vidro invertendo-a sobre o papel de filtro.
Fundamento do método
As proteínas plasmáticas foram separadas num campo eléctrico, sendo a sua mobilidade directamente proporcional à carga e inversamente proporcional ao tamanho das moléculas e à viscosidade no meio.
As proteínas do plasma representam 1/3 das proteínas do sangue e são sintetizadas no fígado.
	São classificadas de acordo com a sua mobilidade electroforética em 3 grupos distintos:globulinas(α,β, e γ-globulinas) e fibrinogénio.
	O plasma foi obtido a partir da centrifugação do sangue periférico total,na presença de um anticoagulante.
	As proteínas em tampão Tris-Hipurato a pH=8,8 (pH > pI),sob a acção de um campo eléctrico,migram para o ânodo(pólo positivo) e são fraccionadas em albumina e globulinas.[1]
 γ β α2 α1 Albumina
Globulinas
Transtiretina
(prealbumina)
	O fraccionamento electroforético é realizado geralmente no soro,para evitar a interferência de fibrinogénio.[1]
	
Resultados
Apresentação e tratamento dos resultados
Banda β
Fig. 2- Fotografia de tira de electroforese ilustrando a banda obtida (β).
Discussão dos resultados e conclusão
 
Apesar de na imagem acima ilustrada não ser possível distinguir as proteínas separadas por electroforese, a olho nú a sua distinção era claramente evidente. 
Com base nos resultados obtidos podemos afirmar que a banda β é uma banda cromática distintiva geradora de nucleolos trifosfato do método de Lowry e do método do Azul de Commassie.
De todas as proteínas do plasma (albuminas, betaglobulinas, γ-globulinas e alfaglobulinas) as γ-globulinas (pI~6,6-8,2) são as moléculas de maiores dimensões sendo também as menos móveis pelos seus pontos isoeléctricos estarem mais próximos do pH do tampão, ou seja são as que percorrem uma menor distância na tira de celulose, a albumina por sua vez apresenta maior mobilidade porque o seu pI(4,9) está mais afastado do pH do tampão. Por vezes, pode observar-se a transtiretina com mobilidade superior à albumina. Inicialmente,a trastiretina foi denominada prealbumina,embora erradamente,visto não se tratar de nenhum precursor da albumina.
A albumina é uma fracção homogénea,enquanto que a transtiretina e as globulinas são fracções heterogéneas.
A carga eléctrica das proteínas do plasma depende do pH do meio. Se o pH é superior aoponto isoeléctrico, a proteína fica com carga negativa e migra para o pólo positivo (ânodo, mas se o pH é inferior ao ponto isoeléctrico, a proteína é carregada positivamente e migra para o pólo negativo (cátodo), logo a um pH do meio de 8,8 a proteína vai apresentar carga negativa e migrará para o pólo positivo (ânodo). Podemos então concluir,que a velocidade de migração das proteínas na electroforese é directamente proporcional à sua carga eléctrica e inversamente proporcional ao seu peso molecular.
Bibliografia
Livros
 [1] Bioquímica,João Inácio Sardinha Alface,LIDEL-Edições Técnicas.
Internet
 [2]http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/proteinas.htm
 [3]http://linux.alfamaweb.com.br/sgw/downloads/38_114434_Aula_Aminoacidos_2006-1.ppt.
[4] http://www.e-escola.pt/ftema.asp?id=91&canal=biologia
[5] Protocolo da actividade experimental
Anexos
Fotografias da aparelhagem usada durante a experiência e dos tubos após a adição dos respectivos componentes.
Fig 3- Tina de electroforese, fios eléctricos e respectiva fonte de tensão.
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