Exames bioquimicos

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TP II – Caracterização fisiológica e bioquímica de bactérias 
 
Ayerissina Inglês (21504489), Daniela Gomes (21601064), Nuno Neto (21603699) 
Docente: Elisabete Maurício 
Ciências da Nutrição, Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias, Av. Campo 
Grande, 376, 1749-024, Lisboa, Portugal 
Resumo: Este trabalho teve como objetivo a caraterização fisiológica e bioquímica de 
determinadas bactérias (E.Coli, Proteus, Pseudomonas e Bacillus). Para tal, recorreu-se a uma 
variedade de Testes Bioquímicos (Clássicos, Clássicos rápidos e Galerias API), estudando 
principalmente a atividade enzimática dos microrganismos em questão. Conclui-se que, cada 
bactéria tem características específicas que possibilitam a sua identificação. 
 
Palavras-chave: Testes Bioquímicos Clássicos e Clássicos Rápidos; Galerias API; E.Coli; 
Bacillus; Proteus; Pseudomonas; Atividade Enzimática; Identificação 
 
1. INTRODUÇÃO 
A classificação e identificação de bactérias é realizada através da análise das atividades 
fisiológicas e bioquímicas
(1)
. Estas, definem a atividade de um conjunto de enzimas (extra e 
intracelulares) que são características a determinados grupos de bactérias 
(5)
. 
Em contexto laboratorial, é possível estudar algumas das atividades bioquímicas através 
da observação da capacidade dos microorganismos produzirem determinadas enzimas para 
degradarem macromoléculas. Usualmente, a metabolização destas moléculas orgânicas origina 
produtos finais cuja deteção pode ajudar na caracterização e identificação dos microorganismos 
(1) (2)
. Deste modo, os métodos usados para esta finalidade são os Testes Bioquímicos 
(4) (5)
. 
Atualmente, existe uma panóplia de testes bioquímicos. Entretanto, os mais relevantes 
são alusivos ao metabolismo bacteriano, pois este ocorre na presença de enzimas específicas. 
 Assim, os testes utilizados no presente relatório foram: Hidrólise do amido (as moléculas de 
amido são hidrolisadas por grande parte das bactérias, que ‘utilizam’ as suas -amilases, 
originando dextrinas, glicose e maltose. Uma vez que o iodo reage com o amido formando um 
complexo azul-escuro, a presença do mesmo pode ser detectada com uma solução de iodo); 
Hidrólise de proteínas-Caseína (A caseína é a principal responsável pela turvação branca 
característica do leite. Sendo que alguns microorganismos produzem protéases que catalisam a 
hidrólise da caseína, a produção das mesmas é identificável pela perda desta característica do 
leite); Hidrólise de proteínas-Gelatina (alguns microorganismos excretam uma enzima capaz 
de degradar a gelatina – gelatinase. A gelatina é uma proteína que abaixo dos 25º C mantém as 
suas propriedades de gel e é sólida, enquanto acima dos 25ºC é líquida. Caso ocorra degradação, 
não se consegue restaurar as características de gel da gelatina, mesmo a baixas temperaturas); 
Fermentação de glícidos (a maioria das bactérias utiliza glícidos hidrolisando-os com 
consequente acidificação do pH do meio e formação de gases); Teste de IMViC (Indol, 
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vermelho de Metil, Voges-Proskauer e Citrato) – Produção de Indol (existem microrganismos 
que são capazes de degradar o aminoácido triptofano até indol, sendo esta conversão mediada 
pela enzima triptofanase. A acumulação de indol no meio pode ser depois detetada adicionando 
o reagente Kovacs que vai reagir com o mesmo originando um anel de cor vermelha); Teste de 
Citrato (algumas bactérias utilizam o citrato de sódio como única fonte de carbono, juntamente 
com sais de amônia, alcalinizando o meio); Teste da Catalase (existem bactérias que possuem 
enzimas como a catalase que decompõem o peróxido de hidrogênio (extremamente oxidante) 
em água e oxigênio, protegendo deste modo, os constituintes celulares da oxidação. Assim, 
pode detectar-se a catalase pela formação de bolhas de oxigenio); Teste citocromo oxidase (a 
capacidade das bactérias produzirem esta enzima pode ser determinada pela adição do reagente 
dihidrocloreto de tetrametil e p-fenilenodiamina. A mesma catalisa a oxidação de um citocromo 
reduzido, resultando na formação de H2O e de um citocromo oxidado. O reagente referido vai 
funcionar como um substrato artificial, tornando-se violeta na forma oxidada, e rosa na forma 
reduzida). 
Para além dos testes clássicos acima mencionados, utilizaram-se também as Galerias 
API
(3)
. Trata-se de um conjunto de mini testes bioquímicos (rápidos, práticos e fáceis de se 
realizar) disponíveis em kits comerciais, que consistem num conjunto de poços ou cavidades 
com substratos liofilizados, cujo metabolismo se pretende estudar. Entretanto, a identificação do 
microorganismo foi feita pelo método tradicional de verificar a mudança de cor nos poços, após 
o sistema indicador ter sido alterado pelos metabolitos ou pelos reagentes. A identificação da 
bactéria desconhecida consiste na determinação de um código de 7 dígitos (profile index 
number) e na consulta do manual da API. Assim sendo, este relatório teve como objetivo fazer 
a caracterização fisiológica e bioquímica das bactérias. 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
2.1. Materiais e reagentes 
No decorrer desta atividade prática utilizaram-se os seguintes materiais: quatro 
microrganismos (E.coli, Proteus, Pseudomonas, Bacillus); meios com agar de amido; meios 
suplementados com leite; estufa (Heraus instruments); meios inclinados de citrato; meios 
sólidos com agar nutritivo suplementado com gelatina; tubos durham; meios líquidos com 
hidratos de carbono; meios líquidos de triptofano a 10%; peróxido de hidrogénio; reagente 
dihidrocloreto de tetrametil e p-fenilenodiamina; disco de papel de filtro; galerias API; parafina; 
ampolas com líquido de suspensão; reagente James; reagente PDA; reagente VP (1 e 2); 
reagente Kovacs; solução de iodo; ácido sulfanílico e dimetilnaftilamina. 
 
2.2 Métodos 
Para permitir a caracterização das bactérias selecionadas, foram realizados vários testes 
bioquímicos. Começou-se por realizar dois testes em placas de Petri: hidrólise de proteínas 
(caseína) e hidrólise do amido. Em ambos dividiram-se as placas ao meio e foram inoculados 
dois microorganismos em cada, recorrendo á técnica do espalhamento. Utilizou-se meio de agar 
suplementado com amido para o teste do amido, e meio suplementado com leite para o teste da 
hidrólise de caseína. 
Posteriormente, foram realizados outros quatro testes, em tubos com meios distintos. 
Realizou-se o teste do citrato inoculando, por espalhamento, cada uma das quatro bactérias em 
meios de citrato inclinado (todas em tubos diferentes). Depois deste teste, foi realizado o de 
fermentação de glícidos (tubos de fermentação suplementados com lactose, sacarose e glucose-
meios líquidos com um tubo de Durhan inserido) em que foi implantado em cada meio uma 
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ansada de microrganismo, repetindo o processo para cada bactéria. Procedeu-se ao teste da 
hidrólise de proteínas (gelatina), introduzindo os microorganismos em cada tubo correspondente 
(com meio de agar suplementado com gelatina). Por fim, realizou-se o teste da produção de 
indol (meio liquido) onde se inseriram os microorganismos em meios contendo triptofano. 
Todos estes testes foram á estufa, uns a 30ºC durante 48 horas (hidrólise do amido, 
hidrolise de proteínas (caseína), hidrolise de proteínas (gelatina), utilização do citrato) e outros a 
37ºC durante 24 a 48 horas (fermentação dos glícidos e produção do indol). 
Foram também realizados outros testes denominados de bioquímicos clássicos rápidos. Estes 
foram: o teste da catálase e o teste do citocromo-oxidase. O primeiro consistiu na introdução de 
uma gota de peróxido de hidrogénio numa lâmina, onde posteriormente foi introduzido o 
microorganismo observando-seimediatamente o resultado. Para o segundo teste, foi necessário 
um disco de papel de filtro onde houve a introdução do microorganismo. Este disco foi dividido 
em quatro para realizar o mesmo processo com os vários microorganismos. Posteriormente á 
inserção destes, adicionou-se o reagente dihidrocloreto de tetrametil-p-fenilalanina e 
observaram-se os resultados imediatamente. 
Após a realização de todos os testes anteriormente referidos, procedeu-se á observação 
de resultados. Em alguns testes estes não se observam diretamente, por isso foi necessária a 
adição de reagentes. No teste do indol foi necessário colocar várias gotas de Kovacs em cada 
tubo, e aguardar 5 a 10 minutos para repousar. Outro teste que necessitou de um reagente para a 
sua observação foi o da hidrólise do amido, tendo sido inserido soluto de lugol (solução de 
iodo). 
Posteriormente ao registo dos resultados destes testes, procedeu-se á realização dos 
testes das Galerias API. Para a realização dos mesmos, necessitou-se de preparar uma suspensão 
com a bactéria escolhida (no caso, a E.Coli). Foi inserida, nos “poços” das Galerias, água 
esterilizada, com o objetivo de não haver desidratação. Nestes inseriu-se, posteriormente, a 
suspensão até perfazer metade do compartimento, enchendo até acima apenas aqueles cujo 
nome do teste se encontrava dentro de um quadrado. Em todos os “poços” destinados a testes 
cujos nomes se encontravam sublinhados, o restante espaço foi preenchido com parafina. 
Concluído o processo, as galerias foram incubadas a 37ºC durante 24 horas. 
Por último e para finalizar este estudo, observaram-se os resultados das Galerias API. 
No entanto, como nos testes bioquímicos clássicos, também nas Galerias API existem testes que 
não dão os resultados imediatamente. Para a obtenção do resultado ao teste do indol foi 
necessário a adição do reagente James; para a realização do teste VP foi necessário adicionar 
VP1 e VP2 e esperar cerca de 10 minutos para a possível análise. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3.RESULTADOS E DISCUSSÃO 
3.1. Microorganismos utilizados no decorrer da atividade prática 
 
 Fig.1 – Cultura pura de Proteus Fig. 2 – Cultura pura de Bacillus 
 
 
 Fig.3 – Cultura pura de Pseudomonas Fig. 4 – Cultura pura de E.coli 
 
Nas figuras 1, 2, 3e 4, é possível observar as culturas de microorganismos seleccionados 
para a realização de testes bioquímicos. 
 
3.2. Testes bioquímicos clássicos 
 3.2.1. Hidrólise do amido 
Após a realização deste teste registou-se resultado positivo, correspondendo ao 
microrganismo A (Bacillus). Neste caso, verificou-se que á volta da cultura prevalecia uma zona 
clara, sendo possível constatar que ocorrera a hidrólise do amido, comprovando-se assim a 
capacidade do microorganismo produzir amilases. 
Na cultura B, registou-se um resultado negativo, apresentando esta uma cor azul escura 
após inundação com uma solução de iodo, o que indica a ausência de amilases, uma vez que a 
solução assume esta cor ao reagir com o amido, que estava por isso, ainda presente na amostra. 
 
Fig.5- Resultados nas culturas A e B 
 
3.2.2. Hidrólise de proteínas (caseína) 
 Obtiveram-se dois resultados: positivo e negativo, correspondentes ás culturas de E.coli 
e Pseudomonas.Na reação positiva observou-se uma zona transparente em torno das culturas, o 
que prova a capacidade de hidrólise da caseína por parte dos microorganismos referidos. Por sua 
vez, na cultura com resultado negativo, constatou-se que o meio estava branco e opaco, 
resultante do facto de a caseína formar uma suspensão coloidal com o agar. 
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3.2.3. Utilização do citrato 
Em todas as amostras o indicador manteve a cor verde, levando a concluir que nenhuma 
das bactérias testadas produz a enzima citrase (resultado negativo), uma vez que caso contrário, 
por atividade desta enzima, haveria formação de carbonato de sódio (produto alcalino) levando 
á viragem do indicador para azul. 
Sabe-se no entanto que a amostra A deveria apresentar um resultado positivo, uma vez 
que o microrganismo lá presente (E.coli) é capaz de utilizar o citrato na ausência de glícidos 
fermentáveis. Assim sendo, crê-se que terá ocorrido algum tipo de erro no decorrer da 
realização deste teste. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Fig.6- Teste do citrato (resultado negativo) Fig.7- Teste do citrato (resultado positivo) 
 
 
 
3.2.4. Teste de fermentação dos glícidos 
 Lactose(fig.10)- Observou-se que no tubo A o indicador permaneceu vermelho, 
concluíndo que as respectivas bactérias não utilizam a lactose para fazer fermentação, uma vez 
que caso isto ocorre-se, a produção de ácidos (própria da fermentação) levaria á alteração do 
indicador para amarelo (pH mais ácido). Na amostra B, verificou-se a formação de uma bolha 
de gás e mudança de cor para alaranjado. 
Sacarose(fig.8) – O indicador permaneceu vermelho em ambos os tubos, sugerindo 
que nenhuma das bactérias utiliza a sacarose como substrato para fermentação (fig.8). 
Glucose (fig.9)– Foi possível constatar um resultado negativo no tubo A. Na amostra B 
apenas foi possível verificar a mudança de cor do indicador para amarelo, o que sugere que o 
gás produzido no processo de fermentação não foi suficiente para ficar retido no tubo Durham. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.8- Resultados teste Sacarose Fig.9- Resultados teste glucose 
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Fig.10- Resultados teste lactose 
 
3.2.5. Teste de produção de indol 
 Para as amostras A e B, registaram-se resultados negativos, concluindo-se que não 
possuem enzimas capazes de hidrolisar o triptofano, uma vez que é nesta reacção que se daria a 
produção de indol. 
 
 Fig.11 – Resultados do teste da produção de indol 
 
3.3. Testes bioquímicos clássicos rápidos 
 
3.3.1. Teste da catalase 
Na presença de peróxido de hidrogénio, foi possível observar a formação de bolhas de 
oxigénio nas amostras A e B, com as bactérias testadas. Isto indica que possuem a enzima 
superóxido dismutase, enzima esta capaz de degradar o peróxido de hidrogénio, sendo que os 
produtos desta reacção são a água e o oxigénio. 
 
 
 Fig.12 – Teste da catalase 
 
 
 
 
 
 
 
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3.3.2. Teste da citocromo-oxidase 
Obtiveram-se resultados negativos nas amostras A e B, observando-se as amostras com 
uma cor incolor. 
 
 Fig.13 - Teste da citocromo-oxidase 
 
 
API 
 
 
 
 
Fig.14– Observações de resultados Fig.15- Poços IND e VP após 10 minutos 
 
A E.coli foi a bactéria escolhida para a realização dos testes das Galerias API. No final 
da realização dos testes, e consoante os resultados, deveria ter sido possível identificar, por 
consulta do manual API com um código de correspondência, a bactéria testada (ainda que neste 
caso, a mesma já fosse conhecida). 
Obteve-se o código 7353000, o que sugere a ocorrência de um erro, possivelmentena 
análise dos resultados dos testes, uma vez que esta foi feita fora do tempo previsto (devia-se 
verificar os resultados entre 24h e 48h) e também por falta de experiência dos operadores. 
Sendo classificada como género não identificado. No manual API a Escherichia coli é 
codificada com o número 7144552. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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4. CONCLUSÃO 
 
Ao longo da atividade experimental, foram estudadas quatro bactérias recorrendo a 
diversos testes bioquímicos, o que levou a que finalmente se concluísse que é possível 
caracterizar, e por conseguinte, identificar este tipo de microrganismos estudando a sua 
atividade enzimática. 
No entanto, uma vez que para as bactérias utilizadas, as características relativas á 
atividade bioquímica já são conhecidas, reconhece-se que alguns dos resultados não 
correspondem á realidade, indicando a ocorrência de erros. Seria conveniente repetir essas 
frações do trabalho prático para que se obtivessem resultados mais semelhantes ou mesmo 
idênticos ao que é esperado, tendo em conta os fatos conhecidos. 
A vantagem dos testes clássicos é a possibilidade de analisar tanto amostras límpidas 
como amostras turvas. Trata-se de uma técnica que pode ser realizada por operadores com 
formação básica em microbiologia, e é relativamente barata, uma vez que, não requer 
equipamento muito sofisticado. No entanto, pode tornar-se uma técnica que implica trabalho de 
laboratório intensivo, quando são necessárias fazer muitas diluições das amostras. 
Já, os testes API, são mais rápidos de se efetuar que os anteriores, porém as 
desvantagens encontradas é que é necessário uma supervisão exata de horários, pois não se pode 
ultrapassar os mesmos. Estes testes também são mais caros que os anteriores. 
 
5.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 
 
 (1)
Koneman, E. W., & Allen, S. (2008). Koneman. Diagnostico Microbiologico/Microbiological 
diagnosis: Texto Y Atlas En Color/Text and Color Atlas. Ed. Médica Panamericana. 
 
 
(2) 
Eigner, U., Schmid, A., Wild, U., Bertsch, D., & Fahr, A. M. (2005). Analysis of the 
comparative workflow and performance characteristics of the VITEK 2 and Phoenix 
systems. Journal of clinical microbiology, 43(8), 3829-3834. 
 
(3) 
Biomeriex API WEB–Disponível em: 
<http://www.biomerieux.pt/servlet/srt/bio/portugal/dynPage?open=PTG_CLN_PRD&d
oc=PTG_CLN_PRD_G_PRD_CLN_76&pubparams.sform=4>Acesso em: 29 de Abril 
de 2016. 
 
(4) 
Silva, J. O., & Candido, R. C. (2005). Avaliação do sistema API20C AUX na identificação de 
leveduras de interesse clínico. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 
38(3), 261-263. 
 
(5) 
Módulo, V. Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica. 
 
 
 
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Anexos 
 
Tabela 1 – Resultados gerais dos testes clássicos 
 
 
Figura 16- Resultados dos testes nas Galerias API 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Hidratos de Carbono 
 
Citrato 
Glucose Sacarose Lactose 
Índol Gelatina 
Caseí
na 
 Amido Catalase Oxidase 
Gás Cor Gás Cor Gás Cor 
A -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- +/+ + + +/+ -/- 
B +/- +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ +/+ -/+ - - +/+ -/- 
C -/ -/- -/- -/ -/ -/ -/ -/- -/- + + +/ +/- 
D +/- -/- +/+ -/ -/ -/ -/ -/- -/- + + +/ -/-