Histologia e Métodos de Estudos

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Histologia e Seus Métodos de Histologia e Seus Métodos de 
Estudo
Profa. Sandra Moura
- Cronograma
- Referências bibliográficas
Aspectos Gerais
Histologia: estudo dos tecidos do corpo e de sua organização para compor os órgãos
Tipos de Tecido: epitelial, conjuntivo, muscular e nervoso
� Constituídos por células e matriz extracelular (MEC)
Apoio mecânico às células e meio de transporte de nutrientes à célula
Produzidas pelas células: são controladas e influenciadas pela MEC
A HISTOLOGIA é a base para o estudo de outras ciências (parasitologia, patologia)
A pequena dimensão das células e dos componentes da matriz tornam 
fundamental a utilização do microscópio como ferramenta para a histologia
Preparação de Tecidos para Exame Microscópico
Preparação do tecido em cortes histológicos para avaliação em microscópio de
luz ou óptico:
� Tecidos são fatiados em cortes histológicos muito finos
3 PRINCÍPIOS FUNDAMENTAIS:
� Tecidos são fatiados em cortes histológicos muito finos
� Posteriormente são montados em lâminas de vidro para serem examinados
� Devem ser preservados para manter a composição molecular e estrutural
Fixação do Tecido
Objetivo: evitar autólise ou alteração por enzimas
bacterianas para preservar o tecido
� Fixação química: imersão em agentes que estabilizam as moléculas do tecido fazendo
pontes com as moléculas vizinhas - FIXADORES
� Tratamento (FIXAÇÃO) imediato a retirada do tecido
� Tecido deve ser cortado em fragmentos pequenos para favorecer a difusão do fixador,
garantindo boa preservação
Etapas do Processamento Histológico
� Reagem com grupo amina (NH2) das proteínas teciduais
� Formaldeído tamponado a 4%: excelente fixador para microscopia óptica
� Microscopia eletrônica: necessita de maior cuidado durante a fixação devido a alta
resolução
� Fixação dupla com glutaraldeído tamponado e posteriormente com tetróxido de
ósmio (preserva e garante o contraste aos lipídeos e proteínas)
� Perfusão intravascular do fixador
Histotécnico Etapas do Processamento Histológico
Inclusão do Tecido
Objetivo: facilitar o processo de corte no micrótomo – aumenta a rigidez tecidual
� Impregnação tecidual com parafina: INCLUSÃO
� Parafina (MO) e Resinas (ME)
Inclusão é precedida pelas etapas de desidratação e clareamento (diafanização)
Etapas do Processamento Histológico
� Desidratação: bateria de etanol crescente (70%-100%)
� Clareamento em XILOL
� Embebição pela parafina (58-60°C) – solvente evapora e os espaços são
preenchidos pela parafina
� Tecido se torna rígido pronto para ser cortado no micrótomo
Micrótomo Etapas do Processamento Histológico
� Cortes são seccionados com espessura de 1-10µm
� 1µm = 0,001mm
� 1nm = 0,001µm
Etapas do Processamento Histológico
Inclusão do Tecido
� Tecido é submetido a congelamento rápido (método físico) – tecido fica rígido
� Aplicação de Resinas (ME/MO)
Etapas do Processamento Histológico
� Vantagens: preparação rápida – usado em hospitais para rápido diagnóstico
durante procedimento cirúrgico
� Permite estudo imuno-histoquímico
� Identificação de células tumorais, fenótipo celular, citocinas intracitoplasmáticas
� Mínima interferência nas proteínas e enzimas teciduais
� Cortes realizados em equipamento especial – criostato
Criostato Etapas do Processamento Histológico
Coloração
� Diferentes métodos de coloração para diferenciar componentes celulares e teciduais
� Corantes se comportam como compostos ácidos ou básicos
� Estruturas teciduais que se coram com corantes básicos (basófilas) e ácidos
(acidófilas)
Corantes Ácidos Corantes Básicos
Etapas do Processamento Histológico
Azul de Toluidina
Azul de Metileno
Hematoxilina
Orange G
Fucsina Ácida
Eosina
Ligam-se as estruturas 
basófilas do tecido (contém 
ácidos: ácido nucléico, 
glicosaminoglicanos, 
glicoproteínas ácidas)
Coram componentes acidófilos
(mitocôndrias, grânulos de 
secreção, proteínas
citoplasmáticas e colágeno)
Coloração Etapas do Processamento Histológico
Reagentes Cor / Estrutura
Hematoxilina Azul: núcleo, matriz cartilagem, região ácida do citoplasma
Eosina Rosa: fibras colágenas, região básica do citoplasma
Tricrômico de Masson Azul Escuro: núcleos
Vermelho: músculo, queratina e citoplasma
Azul-claro: mucina, colágeno
Orceína (fibras elásticas) Castanho: fibras elásticas
Weigert (fibras elásticas) Azul: fibras elásticas
Coloração com Prata Preto: fibras reticulares
Ácido Periódico-Schiff Magenta: glicogênio e moléculas ricas em carboidratos
Corantes Wright e 
Giemsa
Contagem diferencial de células sanguíneas
Rosa: hemácias e grânulos de eosinófilos
Púrpura: núcleo dos leucócitos e grânulos de basófilos
Azul: citoplasma dos monócitos e linfócitos
Coloração
� Corante mais comumente utilizado: hematoxilina e eosina (HE)
� Hematoxilina: cora em azul ou violeta o núcleo celular e outras estruturas ácidas
� Eosina: Cora o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa
� Tricômicos (Mallory e Masson)
� Evidenciam núcleo, citoplasma e diferenciam colágeno
� Picro-Sirius
� Diferencia colágeno
Fibras colágenas inserindo-se no 
músculo. Picro-sírius em luz polarizada.
Amarelo: Células acidófilas
Azul: células basófilas
� Três sistemas de lentes: condensador, objetiva e ocular
� Condensador: concentra a luz para 
projetá-la sobre a lâmina
Microscopia de Luz
� Objetiva: projeta a imagem aumentada em 
direção a ocular
� Ocular: amplia novamente a 
imagem e a projeta em direção a 
retina
Aumento= aumento da objetiva X 
aumento da ocular
Poder de Resolução: Menor distância entre 2 objetos 
capaz de distingui-los individualmente
Microscopia de LuzRESOLUÇÃO
� Máximo em MO: 0,2 µm
� O limite de resolução determina a riqueza de detalhes da imagem e não o aumento
Célula Vegetal: ≈ 50µµµµm
Célula Animal: ≈ 10-20µµµµm
Núcleo: ≈ 3-6µµµµm
Bactéria: ≈ 1-2µµµµm
Vírus: ≈ 0,05-0,2µµµµm
Núcleo: ≈ 3-6µµµµm
Mitocôndria: ≈ 0,5µµµµm
Ribossomo: ≈ 25nm
Membrana: ≈ 10nm
Microscopia de Luz
� Vídeos-câmara acopladas ao microscópio com alto poder resolutivo
ANALISADORES DIGITAIS DE IMAGEM
� Maior sensibilidade na detecção de estruturas microscópicas
� Análise de imagens digitalizadas: ANALIZADOR DE IMAGEM
� Avaliação quantitativa computadorizada ou não
� Determinação do tamanho de estruturas
� Microscopia intravital
� Permite a visualização de objetos não corados
Microscopia de Contraste de Fase e de Contraste Diferencial de Interferência
� Objeto apresenta mesma densidade óptica => menor detalhamento
� Possibilitam a visualização de imagens de objetos “transparentes”
Microscopia de Contraste de Fase
� Avaliada pelos diferentes índices de refração da luz sobre a estrutura
� Estruturas aparecem mais claras ou mais escuras
� Importante ferramenta para observação de células vivas� Importante ferramenta para observação de células vivas
Microscopia de Contraste Diferencial => imagem aparentemente tridimensional
MO convencional Mic. Contraste de Fase Mic. Contraste Diferencial
Microscopia Confocal
� Focaliza um plano de foco muito delgado da lâmina
� Material é iluminado por feixe de luz muito estreito
� A imagem passa por pequeno orifício => apenas a imagem do plano focalizada 
alcança o detector
� Aumenta a definição do objeto focalizado
Microscopia Confocal
� Iluminação: fonte laser
� Varrido pelo material em estudo
� O material é marcado com molécula fluorescente
� A luz refletida pelo material forma a imagem
� A luz refletida é capturada por um detector e ampliada eletronicamente
� Montagem de diferentes planos focalizados permite montar uma imagem 
tridimensional
Porção muscular de A. suum mostrando inervação(setas)
Microscopia Confocal
Neuropeptídeo 
cerebral 
ImunomarcadoImunomarcado
Fibras musculares do 
esôfago (oe) parede 
Microscopia de Fluorescência
Fluorescência: obtida quando o objeto reflete a luz com comprimento de onda mais 
longo (apresenta-se brilhante)
� Microscópio de fluorescência: fonte de luz UV
� Filtros especiais: selecionam o comprimento de onda que atingem e saem da amostra
� Reveladores: substâncias fluorescentes com afinidade celular ou pela matriz (corantes)
� Laranja de Acridina: combina-se com RNA e DNA (florescência verde-amarelada)
Complexo DNA-alaranjado de acridina => fluorescência amareladaComplexo DNA-alaranjado de acridina => fluorescência amarelada
Complexo RNA-alaranjado de acridina => fluorescência vermelho-alaranjada
Permite identificar simultaneamente os dois tipos de ácidos nucléicos
Célula de rim de hamster Cercárias de S. mansoni - FITC
DNA
RNA
Microscopia Eletrônica (ME)
Princípio: resultado da interação entre os elétrons emitidos pelo 
aparelho e os componentes do tecido
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
� Permite altíssima resolução (3 nm) => ampliação de 400.000x
Funcionamento: elétrons são liberados por filamento de tungstênio em aquecimento em vácuo (catodo)
� Elétrons são submetidos a diferença de 
voltagem entre 60-120 KV entre o catodo e 
anodo
� Atingem o anodo em alta velocidade 
formando feixe de elétronsformando feixe de elétrons
� Passam por bobinas elétricas que desviam 
semelhante ao feixe luminoso em MO (lentes 
eletromagnéticas)
� Elétrons chegam a placa fluorescente
formando a imagem
� Alguns elétrons interagem com átomos do 
tecido e outros passam direto
� Forma imagem preto-e-branco (áreas 
escuras: elétron-densas / áreas claras:
elétron-transparente ou elétron-lucente)
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
� Cortes muito finos (40-90 nm): 
garantem melhor interação com elétrons
� Inclusão em resina plástica
� Cortes coletados em grade de metal de 3 mm
Glicocálice célula 
intestinal
Plasmócito
Microscópio eletrônico de transmissão 906E
Leucócito Célula absortiva 
intestinal
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
� Fornece imagens pseudotridimensionais
� Feixe de elétrons varre a amostra
� Elétrons não atravessam a amostra mas são refletidos (camada de metal aplicada)
Capturados por um detector
Transmitido a amplificadores
Sinal é projetado => formação de imagem preto-e-branco (monitor)
� Mostra somente visão de superfície
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Mitocôndrias
Esquema: microscópio eletrônico de varredura
Cílios
Leucócitos
Métodos de Estudo da células
Microscopia óptica X eletrônica
Microscópio Eletrônico de 
Transmissão - MET
Microscópio Eletrônico de 
Varredura - MEV
Métodos de Estudo da células
Microscopia 
eletrônica de 
transmissão e MET MEVtransmissão e 
varredura
MET MEV
Radioautografia
Estudo de processos biológicos em cortes de tecidos utilizando radioatividade
� Fornecimento de moléculas radioativas às células (precursores) => ácidos nucléicos, 
proteínas, etc
� Cortes do tecido: banhados com cristais de brometo de prata => detectores de 
radioatividade
� Análise em MO ou ME
� Revelação da lâmina: cristais de brometo de prata atingidos pela radiação originam 
grânulos pretos => molécula radioativas são cobertos por este grânulo
Radioautografia
� Radioautograma de tecido de rato injetado com 3H-fucose
MO gl. salivar - grânulos => regiões radioativas MET: grânulos de prata
� Radioautograma de tecido de rato injetado com 3H-timidina
Muitas células epiteliais em divisão 
no epitélio intestinal
Linfonodo: divisão celular 
no centro germinativo
Métodos de Estudo da células
Cultura de células
Cultivo Celular & Tecidos
� Estudo in vitro de células ou tecidos cultivados / células imortalizadas
� Permite avaliar o comportamento celular fora do organismo vivo
� Isolamento celular do tecido
� Células são semeadas em placas especiais
� Incubação em estufa
Crescimento de Trypanosoma cruzi em fibroblastos de galinha
Cultivo Celular & Tecidos – Estratégias de Estudo
� Separação de diferentes estruturas celulares por centrifugação 
Histoquímica e Citoquímica
Identificação de substâncias em tecidos ou células
Íons
Demonstração de fosfato de cálcio no osso e
cartilagem calcificada (precipitado escuro)
Identificação Molecular em Cortes Histológicos
Princípio: Utilização de substâncias marcadas com afinidade para a molécula alvo 
Marcadores mais usados
Substâncias fluorescentes (microscopia de fluorescência ou laser)
Átomos radioativos (radioautografia)
Sistemas enzimáticos (peroxidase-DAB-peróxido de hidrogênio)
Esquema de marcadores moleculares com substâncias de alta afinidade
IMUNOCITOQUÍMICA
� Resultado da interação Ag-Ac
� Incuba-se o corte histológico com anticorpo marcado para possibilitar a revelação
� Análise ocorre em MO ou confocal
� É necessário se ter o anticorpo (policlonal ou monoclonal) contra a proteína alvo
Produção de Anticorpo Policlonal
Objetivo: produção de anticorpos contra proteína X 
� Injeta-se a proteína X em um animal => que vai produzir o Ac X1
� A Ac X1 é produzido por vários linfócitos (clones) => Ac contra diferentes porções
da proteína X
� Esta mistura de Ac são denominados anticorpos policlonais
Produção de Anticorpo Monoclonal
Objetivo: produção de anticorpos contra proteína X 
� Coloca-se a proteína X em cultura de linfócitos => células imortalizadas 
(hibridoma)
� Diferentes clones de linfócitos respondem produzindo Ac contra diferentes 
porções da proteína X
IMUNOCITOQUÍMICA
porções da proteína X
� Isola-se cada clone fazendo o cultivo separadamente
� Produz-se então o Ac monoclonal
� Vantagem: maior especificidade de ligação a proteína que se deseja pesquisar
Reação Direta Imunocitoquímica (ICQ)
� Ac contra proteína X é ligado direto ao marcador para possibilitar a revelação
� Avaliação microscópica: MO, confocal
IMUNOCITOQUÍMICA
� Ac primário e secundário são produzidos em espécies de animais diferentes
IMUNOCITOQUÍMICA
Reação Indireta ICQ
� Utilização de Ac primário contra proteína X
� Utilização de Ac secundário que se liga no Ac primário
� O Ac secundário é marcado (revelação)
� Avaliação microscópica: MO, confocal
� Técnica mais sensível que ICQ direta
ICQ direta
Ligação entre duas moléculas de cadeia única de ácidos nucléicos de seqüência complementar
� Hibridização in situ: aplicada em esfregaços ou cortes de tecidos
� Objetivo: pesquisa de seqüência específica de DNA; definição da localização de um gene no 
cromossomo
� Aquecimento da lâmina => separa as duas cadeias do DNA
Hibridização
� Aplicação de uma sonda => seqüência simples de DNA ou RNA
� Ligada a um revelador => isótopo radioativo ou nucleotídeo modificado (ICQ)� Ligada a um revelador => isótopo radioativo ou nucleotídeo modificado (ICQ)
Marrom: DNA vírus papiloma humano tipo 2
Problemas na Interpretação Histológica
� Etapas do processamento histológico => alteração tecidual => artefatos de técnica
� Retração tecidual: fixador, temperatura da parafina
� Pregas no tecido, precipitados (corante, fixador, sujeira)
Problemas na Interpretação Histológica
� Observar cortes de estruturas tridimensionais apresentadas em duas dimensões 
(comprimento e largura)
Diferentes cortes de esfera ou tubo oco Semelhança entre o corte de Diferentes cortes de esfera ou tubo oco Semelhança entre o corte de 
esfera e cilindro sólidos
Corte de um único tubo visto 
como corte de várias estruturas