Villa Nueva

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1 Amostras ósseas são cortadas em placas e reduzidas a espessura de 15º microns. Enxaguar em água destilada.
2 Corar na solução A 90 min. a 48 horas
3 Lavar em água corrente para reduzir a espessura de 75-100 microns. Esta etapa pode ser omitida se o corte for feito na espessura desejada antes da coloração.
4 Lavar na solução C e D. Enxaguar na água 3 vezes e depois água destilada.
5 diferenciar na solução B ate estar aparentemente a cor verde no osteoide. Nem todos ficam verdes, alguns ficam vermelhos.
-se ficar 90 min. na solução A deixar 3-5 min. 
-se ficar 48 horas na solução A deixar 20-30 min.
6 Diferenciação satisfatória, desidratar em:
Álcool 95% por 10 minutos
Álcool absoluto por 10 minutos
Álcool-xilol (1:1) por 5 minutos
Álcool-xilol (1:4) por 5 minutos
Alcool-xilol (1:9) por 5 minutos
7 Limpar em 2 trocas de xilol por 3 minutos cada
8 montar em meios de montagem de eukitt.
Corantes e soluções para Villa Nueva
Procedimento para fazer o corante:
Mistura 1
2,50 gramas de fast Green e 3,75 gramas de Orange g em 500 ml de água destilada. Adicionar 6 ml de acido acético glacial. Tampar
Mistura 2
Dissolver 1,50 gramas de azure II em 250 ml de água destilada. Depois dissolver 5 gramas de fucsina básica em 100 ml de álcool 95%. Em seguida adicionar 150 ml de água destilada. Agitar 1 minuto, adicionar 13,6 gramas de acetato de sódio, cristais reagente analítico (não granular). Depois adicionar o azure II para esta solução. Agitar mais 5 minutos. 
Extração de precipitado: na proveta contendo 500 ml da mistura 2, adicionar lentamente, com agitação constante 500 ml da mistura 1. Quando estiver toda adicionada deixar precipitar pó 16 a 24 horas. Filtrar o precipitado resultante com vácuo em um funil de buchner. Todo o precipitado deve ser transferido para o filtro de papel.
Descarte o filtrado e lave o precipitado com 75-80 ml de água destilada. Deixar o precipitado no filtro de papel do funil. Colocar a amostra em um forno a 60°C para secar. Quando estiver seco, pulverizar a amostra por meio de almofariz e pilão, transferir para um recipiente limpo e depois colocar em um dessecar durante a noite.
Soluções
Solução A
Pó do corante (0,25 gramas) 
Metanol 70%%, reagente analítico 100 ml.
Dissolver o pó no álcool. Deixar a solução durante a noite, depois filtrar. A solução esta pronta e deve ser mantida em temperatura ambiente.
Solução B
Acido acético 0,01% em álcool reagente 96%
Solução C
Cloreto de benzalcônio 0,1%
Solução D
Sabão neutro 0,01%