Técnicas de estudo de DNA e genomas

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Técnicas de estudo do DNA e genomas
Purificação de DNA plasmidial pela técnica de Mini-prep
Centrifugação da cultura
Ressuspensão em Tampão
Lise bacteriana em pH alcalino (com NaOH/SDS)
Neutralização do Lisado (com acetato de potássio)
Centrifugação e descarte do DNA cromossômico
Extração com fenol ou cromatografia
Precipitação do DNA Plasmidial no sobrenadante (etanol ou isopropanol)
Purificação de DNA 
Lise  Desproteinização  Precipitação
Análise eletroforética de DNA
Análise e quantificação de DNA/RNA
. Gel de agarose: não desnaturante
(> 100 pb)
. Gel de poliacrilamida: não desnaturante
(< 1000 pb)
. Gel em campo pulsátil (PFGE, agarose)
(> 10 kb)
Quantificação por espectrofotometria:
- DNA  1 UA260nm = ~50 mg/mL
50 40 30 20 10 5ng
Análise de DNA de alto PM em eletroforese em 
campo pulsátil (PFGE)
kb
Análise de DNA por Southern blot
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_5.html
Marcação de sondas
P P P
A,C,G,T
g a
A- com DNA polimerase
DNA molde
primers
dNTPs
a 32P dCTP
B- com polinucleotídeo cinase
fragmento defosforilado
g 32P ATP
Análise de DNA por Southern blot:
localização de um gene no genoma
Fatores que influenciam a hibridação de 
sondas de DNA: 
 Tamanho e composição da sonda
 Temperatura de hibridação
 Concentração da sonda
 Concentração de sal
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
DNA
DNA Polimerase (Taq Polimerase)
Iniciadores (Primers)
dNTPs
Tampão (Mg+2)
• Reagentes necessários:
• Etapas de uma reação de PCR (~35 ciclos):
Desnaturação
Anelamento
Extensão
(Alberts - Biologia Molecular da Célula)
(Alberts - Biologia Molecular da Célula)
• Site animação - PCR: http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-
chain-reaction-PCR-3D-animation-with-no-audio.html
(Watson – DNA Recombinante)
Fatores que influenciam os resultados de PCR
Tamanho e composição dos primers
Temperatura de anelamento
Concentração do DNA molde
Concentração de MgCl2
PM C T
PCR em Tempo Real (Real-Time Quantitative PCR)
• Quantificação da amplificação da molécula-alvo a cada ciclo da reação de PCR.
• Possibilita determinar a quantidade de uma molécula particular de DNA ou RNA
em uma amostra.
• Duas técnicas principais:
SYBR Green
Sondas TaqMan
 SYBR Green:
(Bustin, 2000)
Sequenciamento de DNA
Sequenciamento de DNA: 
o método de Sanger
Polimerização do DNA a ser sequenciado (molde)
na presença de:
DNA polimerase
iniciador
dNTPs
ddNTPs
https://www.youtube.com/watch?v=nudG0r9zL2M
Sequenciamento de DNA: O método de Sanger
4 Reacões contendo: 
- DNA molde
- Iniciador
- dNTPs
- dd NTPs
- DNA polimerase
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO 
primer polimerase
dNTPs
template
labelled 
ddNTPs
primer polimerase
dNTPs
template
labelled 
ddNTPs
Cada ddNTP emite uma fluorescência diferente: todas as 4 reacões em um único tubo
O sequenciador de 96 capilares (MegaBace) 
Sequenciamento em capilar
Programas 
“base calling” Programas 
“phred”
https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM
https://www.youtube.com/watch?v=WYBzbxIfuKs
Tecnologias de sequenciamento
• Sanger (Capilaridade)
• Uma das inovações tecnológicas de maior influência na pesquisa 
biológica, desde que foi lançada em 1977
• Abordagem “sequencing-by-synthesis” surgiu após 20 anos, no final 
dos anos 90:
• Pirosequenciamento: 454 Life Sciences (Roche): capaz de gerar 
500.000.000 de sequências brutas em poucas horas
• Solexa (Illumina)
• SOLiD (Applied Biosystems) Bilhões de 
bases em uma 
única corrida
Redução dos 
custos
Aplicação em 
estudos de 
transcriptoma
(Pettersson et al, 2009)