Replicação (TRANSCRIÇÃO AULA)

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AULA DE REPLICAÇÃO
Ácidos núcleicos e proteínas são polímeros que contém informação
No DNA e RNA tem 4 tipos de unidades informacionais diferentes, que seriam as bases nitrogenadas (nucleotídeos, na verdade), e dependendo da forma que elas se ligam vão definir diferentes tipos de informação, que é usada para a síntese de um transcrito (RNAm) que vai definir a sequencia de aa em uma cadeia polipeptídica. A estrutura primaria da ptn vai definir a posição de cada aminoácido nesse polimero, e as cadeias laterais desses aa vão fazer interações que vão definir as estruturas secundária, terciária, quaternária, que vão definir a estrutura tridimensional da ptn, que é a que define a atividade biológica. 
A informação necessária para que atividade biologica exista, ela tá lá no DNA (e vai passar para o RNA, e do RNA define então as interações que vão acontecer pelas cadeias laterais, para definir a estrutura tridimensional e a atividade biológica)
Um organismo multicelular, a complexidade aumenta muito; O CITOCROMO C, POR EXEMPLO, (FAZ PARTE DE UM PROCESSO IMPORTANTE QUE ACONTECE NA MITOCÔNDRIA, QUE É A FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA), QUE FICA SITUADA NA MBM INTERNA DA MITOCONDRIA. (PARTICIPA DA TRANSFERENCIA DE ELETRONS; ENTÃO ELE É UMA PROTEINA NO MEIO DE UM GRUPO) SE ESSA PTN NÃO ESTIVER FUNCIONANDO CORRETAMENTE O PROCESSO QUE ELA PARTICIPA FICA PREJUDICADO, SE ESSE PROCESSO FICA PREJUDICADO, A MITOCONDRIA NÃO CONSEGUE DESEMPENHAR SEU PAPEL (GERAR ATP), PREJUDICANDO O PAPEL DA MITOCONDRIA; SEM GERAÇÃO DE ATP A CELULA NÃO PODERIA FUNCIONAR, COMPROMETENDO TECIDOS, ÓRGÃOS, GERANDO UM FENÓTIPO, QUE PODE SER OBSERVADO. 
EXPERIMENTOS PARA DEMONSTRAR A FUNÇÃO DO DNA
Experimento de Griffiti: uma determinada sepa de pneumococos quando inoculada no camundongo, não acontecia nada com ele, mas quando era inoculada a outra sepa, ele morria (era dita virulenta, que levava o aparecimento da doença e o camundongo morria). A diferença entre essas sepas estava na cápsula, a forma que não é virulenta não possui essa cápsula, que seria formada de glicoptns que era formada a partir da atividade de algumas enzimas, ou seja, pra que essa capsula seja produzida há necessidade de uma informação que é a info para produzir as enzimas que produzem essa cápsula. Se a gente diferencia essa forma virulenta, S, da forma não virulenta, R, a unica diferença que a gente tem em termos de genoma é que na forma S existe a informação necessaria para codificar as enzimas necessárias para a produção dessa cápsula. A contribuição que ele deu foi a seguinte: na época já se sabia que existiam essas duas sepas, e que a virulenta era sensível ao calor, ou seja, se ela fosse submetida ao calor ela perdia a atividade. O que ele fez foi misturar as sepas não virulentas com as sepas virulentas inativadas pelo calor e observou que quando ele injetava essa mistura o camundongo morria [SERÁ QUE A INFO NECESSÁRIA PARA QUE A BACTERIA SE TORNASSE VIRULENTA PODERIA SER TRANSFERIDA DA BACTERIA INATIVA PARA A BACTERIA NÃO VIRULENTA?]. Ele conseguiu propor que alguma info contida na bacteria virulenta inativada pelo calor pudesse transformar a não virulenta em virulenta. Inclusive elas era detectadas no animal depois, mostrando que elas passavam a existir. Essa capacidade ficou conhecida como fator transformante.
DÉC 40: DISCUSSÕES: FULANO X defendia que as proteinas que continham a info genetica para transformar uma bacteria nao virulenta em virulenta, e outros defendiam o dna. A gente sabe que a proteina é a forma que a info genetica que ta la no dna se expressa. [A GENTE HOJE SABE QUE O DNA DA BACTERIA VIRULENTA É QUE TRANSFORMA A BACTERIA NAO VIRULENTA EM PATOGÊNICA,E ISSO QUE LEVA A MORTE]. Os que defendiam que eram as proteinas diziam que como elas tem 20 unidades diferentes, eles acreditavam que a quantidade de info que elas podem armazenar seria muito maior do que o dna/rna, que so possuem 4 unds diferentes. No final da decada de 40, grupo de paul mccartney mostrou a natureza do fator transformante do griffthi era o dna --> ele pegou só o dna da bacteria inativada pelo calor e misturou com a bacteria nao virulenta, e aí ele percebeu que o camundongo morria, e aí ele demonstrou que somente o dna dessa bacteria nao virulenta que podia matar o camundongo. Podemos ver também que a informação contida no dna é resistente ao calor, embora a bacteria seja inativada pelo calor, ela perde a virulencia, a info não é perdida, é preservada. Só que eles foram os pioneiros em descrever um metodo de isolamento de dna (SERÁ QUE NÃO TEVE CONTAMINANTE PROTEICO? OS METODOS NAO ERAM MUITO CONHECIDOS); Então eles fizeram outros experimentos, pegaram as bacterias inativadas pelo calor e tratavam com dnase e protease, e eles perceberam que esse fator transformante, que eles isolaram da bacteria como dna não deveria ter como contaminante,q ue seriam os responsaveis pela ação porque era sensivel a dnase e insensivel a protease, então se houvesse um contaminante não seria ele o responsável pois era sensivel a protease, mostrando que o dna é o principio transformante proposto por G.
Quandoa gente considera acido nucleico, a gente ta considerando que ele pode ser constituido de desoxirribonucleotideo ou de ribonucleotideos, dna e rna. Então nos dois casos são nucleotideos (se diferem em uma das porções; é formado por uma pentose, que pode ser ribose ou desoxirribose, e a diferença entre eles está no radical ligado ao carbono 2 - no caso do rna temos uma hidroxila e do dna, hidrogenio; vai ter ligado ao carbono 1 uma base nitrogenada)
As bases nitrogenadas podem ser de dois tipos: pirimidinas (citosina, timina, uracila) ou purinas (adenina e guanina). As purinas contem dois aneis, e as pirimidinas um só, importante para entender melhor a estrutura de dupla helice do dna. 
Carbono 3 de um nucleotideo ligado ao carbono 5 de um outro nucleotideo, ponte fosfodiester (ligação). Depois a gente vai ver na estrutura que as bases nitrogenadas ficam voltadas para o interior da helice, enquanto esse esqueleto que a gente chama de carbono fosfato fica para a parte externa da dupla helice do dna, e isso é importante porque esse fosfato tem carga negativa no ph celular facilitando a interação entre o dna e proteinas que tem carga positiva (histonas).
A gente tem um nucleotideo ligado ao outro atraves de uma ligação fosfodiester entre carbono 5 de um nucleotideo e 3 de outro. No dna existe um carbono 3 que nao ta fazendo ligação fosfodiester com nenhum nucleotideo, esse residuo que apresenta 3 livre, a gente chama de terminal 3' livre, e na outra ponta a gente encontra um residuo de nucleotideo, geralmente com 3 fosfatos que ta ligado ao carbono 5, chamamos de terminal 5'. Se você imagina isso como um polimero, ele cresce pela adição de novas unidades (mas isso a gente vai ver depois)
PERSONAGENS IMPORTANTES: ROSALIN FRANKLIN, CHARGAFF, PAULING, 
Watson e Crick propuseram o modelo com base em dois tipos de info: difração de raio x -> estudo tridimensional de uma molecula, a gente pega uma substância PURA, e quando você pega esse dna e começa a desidratar, ele tende a formar cristais; se a substância tiver pura existe uma grande chance de formar cristais totalmente simetricos e aí você pode submeter esse cristal a um feixe de raio x [e aí a gente sabe que quando o raio x encontra uma nuvem eletronica ele sofre um processo de difração], então considerando o ponto de emissão e o angulo de difração você consegue definir a posição aproximada de cada atomo dentro dessa estrutura, e você capta em um filme (tipo de raio x, chapa normal) varios pontos que estao sofrendo difração em função da posição de atomos dentro dessa estrutura. Então a partir desses estudos eles chegaram a algumas conclusões importantes. 1º Uma molécula de DNA é constituida de dois polimeros de desoxirribonucleotideos que são unidos por pontes de hidrogenio (eles já sabiam disso, mas não sabiam quem fazia ponte de hidrogenio com quem); 2º outro ponto interessante é que eles sabiam que esses polimeros se organizavam em hélices,e que, nesses raios x, ele viram que haviam formas dessas estruturas que se repetiam recorrente a cada 0,34 e 0,4 nm do eixo; formavam duas hélices com periodicidades diferentes, uma com cerca de 10x a outra. 3º Chargaff fez um estudo purificando dna e digerindo totalmente o dna e avaliando a composição de nucleotideos; com esses estudos ele percebeu que havia uma relação muito importante em todas essas amostras de dna que ele estudava, primeiro ele percebeu que a composição do dna nao varia com a idade e nem da alimentação, essa composição é estavel e tem que ser porque contem a informação. O conteudo de purinas era sempre igual de pirimidinas em qualquer amostra de dna que ele avaliasse; que sempre havia uma purina que aparecia em concentração praticamente igual a outra pirimidina, ou seja, havia uma relação entre nucleotideos de A e T, e outra de C e G. Watson e Crick então eles “associaram a associação” à pontes de hidrogênio e aí eles chegaram a uma outra questão que se há sempre uma relação de n purina = n pirimidina, purinas tem dois aneis e pirimidinas tem um só, então se os dois polimeros fossem formados por purinas e em alguns trechos entre as pirimidinas, o diametro da helice deveria variar, por conta da diferença do numero de aneis, e eles perceberam que o diametro do dna era constante, então eles já tinham a ideia das pontes de hidrogenio entre as bases nitrogenadas. [E A GENTE CONHECE HOJE QUE A ADENINA FORMA DUAS PONTES DE HIDROGENIO COM A TIMINA, E A CITOSINA FORMA TRÊS PONTES DE HIDROGENIO COM A GUANINA] Essas ligações entre purinas e pirimidinas somente são estáveis se os polimeros forem antiparalelos, na extremidade de um lado de um dos polimeros a gente tem terminal 3' livre (e o 5' do outro lado) e o outro polímero tem que ter um terminal 5' livre, estando portanto na posição antiparalela.
No dna existem dois tamanhos de sulcos diferentes, o maior e o menor. O sulco maior é importante porque expoe mais as bases nitrogenadas e sao nesses pontos onde a gente encontra interação da estrutura de dna com proteinas, principalmente aquelas que reconhecem sequencias especificas (A REPLICAÇÃO DO DNA COMEÇA EM DETERMINADOS PONTOS DA MOLÉCULA E ESSES PONTOS NÃO SÃO ALEATÓRIOS, VAI SEMPRE ACONTECER NO MESMO PONTO, PORQUE POSSUI UMA SEQUENCIA DE NUCLEOTIDEOS)
Toda a informação da molécula de dna está preservada no interior da helice, uma vez que as bases nitrogenadas que contem a informação! 
A gente tem a molécula de dna (na figura do slide) vista de duas formas isométricas diferentes, pq a molecula de dna, se você imaginar a molecula de dna saindo de uma determinada mão ela pode ter uma curvatura -> right hand x left hand; a hélice de dna é do tipo right hand. Mas dá p fazer left hand e é isso que interfere no controle da expressão gênica.
Quantos nucleotideos a gente tem em uma volta do dna? em uma volta completa a gente encontra 10 pares de base por volta, considerando o dna como um todo. E a distancia de uma volta completa é de 3,4 nm, e a outra de 0,34 é a distância de um par de base e outro.
A forma B, dna extraido a partir de uma solução aquosa, como um dna deve aparecer nas nossas celulas. Right hand
Se ele for extraido a partir de uma solução não aquosa a gente normalmente observa a forma A, que tem diametro maior. Right hand
O dna na forma Z, é do tipo left hand, existe no dna alguns segmentos que em vez de formar estrutura right hand, forma left hand; algumas sequencias no dna ricos em nucleotideos de guanina e citosina elas podem sofrer metilação, e quando elas estão hipermetiladas elas não permitem a interação com proteinas que são muito importantes para iniciar a transcrição de um gene, porque como vocês vão ver que na sintese de rna algumas proteinas tem que reconhecer a origem de transcrição (regiao promotora), e se essa região estiver hipermetilada, essas proteinas não vao conseguir reconhecer essa sequencia, e a consequencia disso é que a hipermetilação dessa sequencia reduz a expressão do gene nessa regiao. Então é um mecanismo importante de controle da expressão genica a formação da cromatina, não só em termos de formação de Z dna, mas em termos de compactação. Então essas regioes de heterocromatina são os primeiros niveis de controle da expressão genica, enquanto que nas regiões de eucromatina todos os genes que estao ali podem ser expressos (não significa que vão); então na região de heterocromatina, em que o material está super condensado, existe um silenciamento dessa expressão. 
WATSON E CRICK propuseram não só do modelo de estrutura como também o modelo de replicação de dna, o semi conservativo. 
Uma caracteristica interessante do dna é uma propriedade que ele tem de se desnaturar e renaturar (proteinas, algumas conseguem outras nao); Embora a informação seja estável, a estrutura do dna não é estável a altas temperaturas; Esse ponto serve como base em métodos de desenvolvimento de diagnosticos baseados em detecção de dna de microorganismos (ALGUMAS SEPAS DE HPV ESTÃO RELACIONADAS AO CANCER DO COLO DE UTERO; ENTÃO ALGUNS EXAMES COMO O DE PAPANICOLAU VOCÊ CONSEGUE SABER SE EXISTE OU NÃO HPV, MAS SABER QUAL O TIPO DE HPV, SABER SE PODE OU NAO DESENVOLVER O CANCER, TEM QUE FAZER UMA ANÁLISE DO TIPO DE MATERIAL GENÉTICO, E ESSA DETECÇÃO PODE SER FEITA PELA DETECÇÃO DO DNA DO VÍRUS, QUE SE BASEIA NESSA PROPRIEDADE DE SE DESNATURAR E RENATURAR; - LIGAÇÕES FRACAS PODEM SER ROMPIDAS COM BAIXA ENERGIA, UMA LIGAÇÃO POR PONTE DE HIDROGENIO É FRACA, NÃO É COVALENTE. ENTÃO AO FORNECER ENERGIA NA FORMA DE CALOR, ESSAS LIGAÇÕES SAO ROMPIDAS, ENTÃO AQUILO QUE UNIA OS DOIS POLIMEROS DESAPARECE E AÍ ESSA MOLÉCULA SE DESNATURA. SÓ QUE DIFERENTE DE PROTEINAS AO RETORNAR A UMA TEMPERATURA ADEQUADA, ESSE DNA SE RENATURA, ELE COMEÇA A FAZER NOVAMENTE O PAREAMENTO DE BASES E REFAZER AS PONTES DE HIDROGÊNIO) Essa desnaturação do dna pode ser medida de formas diferentes (medir o nivel de desnturação do dna através de absorção do ???) O mais importante é que quando é renaturada, a molécula fica perfeita, ou seja, a informação que ela tem é preservada, ela não é sensível ao calor. O calor desnatura, mas quando retirado, há a renaturação.
Durante o processo de replicação e de transcriçao, o dna sofre alterações topologicas, e p entende-las a gente precisa considerar isso aqui que a gente vai começar a discutir: dna circular (encontrado em procariotos, em geral, uma unica molecula) [EM EUCARIOTOS, DNA GENOMICO É LINEAR, MAS ENCONTRA-SE NA MITOCONDRIA OU CLOROPLASTO O DNA CIRCULAR]; conforme o dna for tomando uma forma mais compactada ele vai ocupando menos espaço; a molecula de dna tanto em procarioto quanto em eucarioto, se você comparar o tamanho da celula com o tamanho da molécula você vai ter uma surpresa, p ter uma ideia: se você juntar todos os cromossomos de ponta a ponta gera uma molécula de mais ou menos 2m de comprimento, mas essa molecula tem um diâmetro muito pequeno. Então ela consegue se dobrar sobre ela mesma várias vezes sendo compactada dentro do núcleo. Se existem alterações topologicas a gente vai chamar um dna quando ta com alteração topologica, quando compactado comparado a outro como isômeros topológicos, topoisomeros, cujo nivel de alteração topologica está relacionado com a atividade de enzimas que catalizam essa reação de alteração de um isomero topologico a outro. Essas enzimas são as topoisomerases. Temos basicamente dois tipos, de tipo II e de tipo I. 
	A tipo II é aquela que rompe as duas fitas de dna, e consegue alterar o numero de voltas que a molecula tem. Diminui o numero de voltas; gera uma superhelicoidização negativa
	A tipo I quebra uma permite o giro e sela de volta. Ela promove um superenrolamento; ela super enrola o dna (em procariotos), em eucariotos ambas desenrolam o dna. Aumenta o numero de voltas; Superhelicoidização positiva
	Os dois tipos de topoisomerases conseguem interferir no numero de nucleotideos por volta, mudando o grau de torção que a molécula tem. 
Dado um trecho de dna com 8 voltas, relaxado, a topoisomerase II quebraas duas fitas, gira essa molécula com gasto de energia e sela de volta e aí a gente observa a nova molécula de dna no mesmo segmento, com mesmo numero de nucleotideos, só que agora a distancia de uma volta é maior que 3,4nm tem mais de 10 pares de base por volta, e essa configuração, seria de um topoisomero instavel. Embora visualmente pareça estar mais relaxada, a molécula fica mais tensa, isso gera uma tensão na molécula; quando você aumenta o numero de pares de base por volta, ou seja, diminui o numero de voltas você gera uma tensão na molecula, e quando isso acontece ela tem duas alternativas para se estabilizar: 1- se dobrar sobre ela mesma (aumentando o grau de compactação) 2- abrir o equivalente a uma volta, porque assim todo o restante passa a ter 3,4nm de distância, ou seja, todo o resto fica como se tivesse relaxado. E aí tanto na replicação quanto na transcrição, as enzimas responsaveis por esse processo tem que ter acesso a sequencia de nucleotideos no interior da helice, que então tem que ser aberta. Então percebemos que não há como começar um desses dois processos se o dna não estiver super helicoidizado negativamente, que é quando tenta diminuir o número de voltas [Existe um outro processo que tenta aumentar o numero de voltas]
ACHO QUE VOCÊS VÃO VER ISSO NA BIOLOGIA CELULAR... o que vocês chamam de dna 1, ou seja, aquele dna que não interage com proteinas ele tem um diametro em torno de 2nm e essa molecula de dna ela vai passar por diferentes niveis de organização estrutural até chegar naquele cromossomo metafásico que a gente conhece que apresenta em torno 1400nm; INTERFASE: Pq determinadas regiões ficam mais condensadas e outras menos? isso envolve mecanismo de controle de expressão genica.
Aqui vocês percebem interação do dna com proteinas. Já ouviram falar nas histonas, que são de 5 tipos diferentes, mas desses 5, 4 formam nucleos de histonas, que são formados por 2 desses 4 tipos, ou seja 8 unidades de 4 tipos diferentes. Octâmeros de histonas formam o que conhecemos como nucleossoma, então a gente tem as 8 histonas, 2 de 4 tipos diferentes formando um nucleo onde o dna começa a se enrolar. E aí essa estrutura começa a se dobrar sobre ela mesma, que depois vai interagir com um arcabouço proteico formando laços, formando a fibra que chamamos de 300nm, depois ela novamente se dobrar sobre ela mesma chegando em 700nm, que seria o equivalente a uma cromátide. (vão ver melhor na biocel)
REPLICAÇÃO DO DNA
Dogma central: replicação, transcrição, tradução, e hoje já se sabe que tem a retrotranscrição (RNA->DNA, feito por vírus).
O ciclo celular de uma celula eucariotica, ele tem duas fases distintas, a mitose e a sintese de dna; e o tamanho desse ciclo varia em função do tipo celular. Em média uma celula eucarionte tem um ciclo, uma celula que esteja ativamente em proliferação, em torno de 24h, e entre a fase de mitose e a de sintese do dna a gente tem dois buracos (gap 1 e gap2); A fase G1 seria aquela em que a celula se prepara para se duplicar (para que a celula possa se duplicar ela tem que ter dna para duas celulas, entao essa fase g1 a celula se prepara para poder replicar o dna, porque ela só pode entrar na fase S se estiver preparada). Eventualmente algumas celulas saem do ciclo, e quando isso acontece dizemos que elas estao em G0, quando estão em estado latente e nao ficam replicando o tempo todo, mas essas celulas que ficam em g0, dependendo de algunas fatores (as vezes fatores de crescimento, hormonios) podem voltar para o ciclo. A fase g2 é entre as fases S e M, em que a célula se prepara para dividir. Depois que a celula tem seu dna replicado aí começa a se preparar pra dividir, na mitose. E agora não tem mais saída (se prepara inclusive, p ter numero correto de cromossomos nas duas celulas p evitar algumas alterações cromossomicas). 
Numa celula somática eucariotica a gente teria um conjunto de cromossomos igual a 2n onde a gente teria um cromossomo de origem paterna e outro homologo de origem materna; essas duas moléculas de dna, cada uma delas vai ser replicada, e sua replica vai ficar unida a ela pelo centrômero; depois de prontas, as duas moléculas de dna ficam unidas pelo centromero, que a gente chama de cromátides irmãs (porque elas são idêntidas, já que são uma réplica da outra) e elas vão ser separadas então durante a mitose; Então lembrando que no final da fase S e durante G2 essa célula é 4n, de 2n ela passa p 4, porque ela tem se dividir em duas 2n.
Procarioto não tem ciclo celular definido dessa forma; O procarioto, enquanto a produção for favorável, ele não pára de se replicar, mas se alguma condição/fator como nutrientes e temperatura forem desfavoráveis, aí a taxa de divisão celular começa a diminuir.
A replicação do celular em vírus, procarioto e eucarioto vai apresentar essas três características que são ditas universais (aparecem em qualquer ser vivo): semi conservativo, bidirecional e semidescontínuo; 
EXPERIMENTO DE MESELSON STAHL 
Consagrou o modelo de dupla helice de watson e crick. Imaginando que a gente tem uma molécula de dna; ao final do processo de replicação a gente passa a ter duas.. a questão que existia é: quando aparece a segunda molécula de dna a molécula é inteiramente nova ou ela tem uma parte da original? Se ela fosse totalmente nova o processo seria não conservativo, ou seja, a fita originada não é conservada em nenhuma das duas. O que esse experimento propõe é que esse processo é semi conservativo, ou seja, quando a gente observa as duas moléculas de dna geradas a partir de uma replicação a gente vai ver que ela composta de um polimero do dna original e um cópia. Isso foi comprovado atraves de um experimento simples em que foram pegas bactérias e colocadas num meio de cultura contendo isotopos pesados de nitrogenio (N15) e isso que vai alterar a densidade da molecula de dna. [SE VOCÊ COLOCA DENTRO DE UM TUBO DE ENSAIO UMA SOLUÇÃO DE CLORETO DE CÉSIO, COM CONCENTRAÇÕES DIFERENTES DESSA SUBSTANCIA, COLOCANDO MAIS CONCENTADA EMBAIXO E MENOS CONCENTRO EM CIMA. UM GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO DESSE CLORETO DE CÉSIO É FORMADO. E AÍ VOCÊ PEGA O DNA ISOLADO DA BACTÉRIA E COLOCA NO TOPO DESSE GRADIENTE E COLOCA ISSO P GIRAR EM UMA ULTRACENTRIFUGA, CUJA FORÇA VAI EMPURRAR EM DIREÇÃO AO FUNDO DO TUBO A MOLECULA DE DNA EM FUNÇÃO DA DENSIDADE DELA; ENQUANTO ESSA DENSIDADE FOR MAIOR QUE A DENSIDADE DA SOLUÇÃO, ELA VAI EM DIREÇÃO AO FUNDO; ENTÃO A IDEIA É QUE A MEDIDA QUE ELA VA EM DIREÇÃO AO FUNDO, EM ALGUMA REGIÃO DESSE GRADIENTE ELA VAI ENCONTRAR NA SOLUÇÃO UMA DENSIDADE QUE SEJA IGUAL A DELA NÃO CONSEGUINDO IR MAIS ADIANTE] E aí eles pegaram a bacteria e a puseram para crescer no meio contendo isotopos pesados de nitrogenio, sais de nitrogenio de isotopo pesado e deixaram a bacteria ali por mt tempo; a ideia deles era substituir em todo o dna, todo o nitrogenio 14 por nitrogenio 15, porque com os sais de nitrogenio a bacteria vai produzir os nucleotideos dela usando o nitrogenio pesado; então depois de um certo numero de replicações de dna a gente pode considerar que o dna só continha isotopo pesado de nitrogenio, e aí eles pegaram esse dna, isolaram essa bacteria e fizeram o gradiente, botaram na centrifuga e aí viram qual era a posição do tubo -> ou seja, qual a região do tubo, em qual a densidade da solução de cloreto de cesio era igual a densidade de dna e essa densidade tá relacionada com a concentração do cloreto de césio (quanto maior a concentração maior a densidade). Aí eles determinaram a densidade dessa molécula em função da migração da molecula nesse tubo. Eles pegaram essa bacteria, que tinha crescido e só tinha nitrogenio 15 na molécula e eles transferiram aquela bacteria em um meio contendo nitrogenio 14 e deixaram lá por 20 min (tempo suficiente para replicar a molecula uma outra vez) e aí eles pegaram esse dna, purificaram e puseram novamente no gradiente de concentração de cesio e perceberam que havia pela densidade um unico tipo de molecula de dna e que essa molecula tinha uma densidade menor do que a outra (ficavamais acima um pouco no tubo) [O QUE SERIA POR EXEMPLO UM DOS POLIMEROS A E OUTRO B, COMPLEMENTAR], então eles deixaram mais 20 minutos e observaram um dna com uma densidade mais leve ainda, pois além do N15N14, eles observaram dna só formado de N14; conseguiram demonstrar então que a replicação do dna era um processo semi conservativo, onde a fita original fica junto com a sua cópia.
EXPERIMENTO DA BIDIRECIONALIDADE DA REPLICAÇÃO DO DNA
Foi visto com vírus que infecta apenas procarioto. O dna desse virus é replicado pelo mecanismo de replicação do hospedeiro que nos leva a entender que em procarioto acontece a mesma coisa (se ele é totalmente dependente da celula hospedeira para exercer tal atividade). [O GENOMA DO SV40. TEM UM PONTO DE ORIGEM DO DNA, em outro ponto a gente tem uma sequencia de nucleotideos que é reconhecido por uma enzima que é uma ENDONUCLEASE, que quebra ligações internas – ela reconhece uma sequencia e quebra a ligação; e a ideia é que a origem de replicação não está equidistante do sitio de restrição de endonuclease, ou seja, quando a endonuclease quebra esse dna circular ela gera um dna linear e este tem distancias diferentes da extremidade; então se a gente agora avaliar o processo de replicação do dna em diferentes intervalos de tempo, a gente vai ver o dna sendo replicado, e quando ele é replicado aparece uma estrutura que chamamos de bolha de replicação; uma vez que essa origem de replicação não está equidistante das extremidades, a medida que o processo vai progredindo a ideia é olhar e medir onde é que está o centro da bolha, porque se o centro da bolha se desloca você vê que a replicação está acontecendo em uma direção, mas se o centro da bolha estiver sempre na mesma posição é porque a bolha está se expandindo nas duas direções, ou seja, são duas forquilhas de replicação seguindo direções opostas, em função disso a bolha de replicação vai aumentando de tamanho e o que a gente percebe atraves da analise de microscopia eletronica que o dna viral sendo replicado é que a bolha vai aumentando, mas o centro está sempre na mesma posição, mostrando claramente que a replicação ocorre nas duas direções]
SEMIDESCONTINUIDADE (só dar p ser entendida quando olhar o processo)
Em procarioto tem apenas uma unica origem de replicação, as forquilhas vao andando e elas tendem a se encontrar. E a bolha de replicação vai aumentando em função disso. Em eucariotos, a coisa é bem diferente, primeiro o tamanho do genoma é muito maior, então para que o processo seja eficiente várias origens de replicação acontecem, abrindo várias bolhas, que a medida que vão crescendo uma encontra com a outra. 
COMO SÃO AS ENIZMAS QUE PARTICIPAM DO PROCESSO DE REPLICAÇÃO DO DNA
DNA polimerase – é aquela que polimeriza os desoxirribonucleotideos. E a gente tem 2 tipos diferentes de dna polimerase. Uma delas é a que utiliza dna como molde, ou seja, ela polimeriza desoxirribonucleotideos usando dna como molde, é o que a gente chama de dna polimerase dna dependente, e existe a dna polimerase rna dependente, ou seja, aquela que polimeriza desoxirribonucleotideos usando rna como molde (um exemplo que voces ja conhecem é a transcriptase reversa). Um outro tipo seria a TELOMERASE, que é responsavel por replicar os telômeros do dna eucariotico.
COMO OCORRE A POLIMERIZAÇÃO DE DESOXIRRIBONUCLEOTIDEOS? 
Algumas caracteristicas:
1. A dna polimerase não é capaz de iniciar uma sintese -> não é capaz de pegar um nucleotideo e juntar com outro; ela só é capaz de pegar uma sequencia já iniciada (primer) e adicionar um nucleotideo. Ela não consegue ligar dois nucleotideos livres; [ENTÃO COMO É QUE ESSE PROCESSO ACONTECE?] Então ela precisa de uma sequencia iniciadora que geralmente tem um nucleotideo com o terminal 3’ porque o dna ele vai crescer atraves da adição de unidades de desoxirribunucleotideos na extremidade 3’. A cópia é sintetizada de forma antiparalela em relação a fita molde
2. Precisa de uma fita molde, sequencia iniciadora (primer), desoxirribonucleotideos trifosfatados, além de magnésio como cofator que vai normalmente associado ao nucleotideo; O nucleotideo que se liga vai ser definido pela base nitrogenada da posição equivalente na fita molde. Essa hidroxila no terminal 3’ vai promover um ataque nucleofilico na ligação entre fosfatos (alfa e beta), quebrando-a, liberando pirofosfato e formando a ligação fosfodiester. [OBS: DIDEOXINUCLEOTIDEOS USADOS NA TERAPIA ANTIRETROVIRAL NO TRATAMENTO DO HIV; MAS A DROGA MAIS COMUM É O AZT, MAS EXISTEM ALGUMAS DROGAS QUE SÃO DE DIDEOXINUCLEOTIDEOS, QUE EM VEZ DE TER A HIDROXILA NO CARBONO 3, ELE TEM UM HIDROGENIO; PEGA O ANALOGO DE NUCLEOTIDEO, QUE É FOSFORILADO, A ENZIMA USA ELE PARA INCORPORAR A CADEIA SÓ QUE DEPOIS QUE ELE ENTRA NINGUEM MAIS ENTRA, POR CONTA DA AUSENCIA DE OH, ATUANDO COMO TERMINADOR DE CADEIA, E A TRANSCRIPTASE REVERSA TEM UMA AFINIDADE MUITO MAIOR POR ESSES DIDEOXIS DO QUE A DNA POLIMERASE HUMANA, ENTÃO A GENTE PODE INGERIR ISSO PARA QUE SEJA MAIS PREJUDICIAL A GERAÇÃO DO TRANSCRITO REVERSO DO HIV DO QUE A SINTESE DO DNA DO HOSPEDEIRO DO VIRUS]
A dna polimerase, além de apresentar a atividade polimerase no sentido 5’->3’, ela apresenta atividades exonucleases, que retira da extremidade. A gente tem dois tipos de atividade exonuclease, 5’3’, ou seja remove do 5’, atividade importante no final da replicação e no reparo de mutações; a outra atividade exonuclease é a 3’5’, tirando do terminal 3’, que é a atividade de revisão. 
PROCESSO DE REPLICAÇÃO EM PROCARIOTOS 
Nos procariotos tem 3 tipos de dna polimerase e todas 3 tem atividade de polimerização e revisão (3’->5’), mas a atividade 5’3’ só a DNA pol I possui. A III não atua na replicação, ela só atua no reparo do dna e em eventos de recombinação, a I e II trabalham na replicação; a I tem uma participação pequena desse processo e ocorre em função dela ter atividade exonuclease 5’3’, que as outras não tem atuando no arremate da replicação do dna, faz o finalzinho da replicação. 
De um modo geral, o processo é dividido em 3 etapas: inicio, alongamento, término. 
	INICIO 
Origem de replicação definida por uma sequencia de nucleotideos; 3 sequencias chamadas consenso (sequencias que informam que aquele trecho é importante no processo de replicação). Nós temos sequencia consenso de 13 pb, que elas se repetem e tem uma outra de 9pb que ficam espaçadas dentro da origem de replicação, e essas sequencias tem direções alternadas. (essas sequencias são ricas em AT, pois são regioes com menos pontes de hidrogênio,sendo mais fáceis de abrir)
Então a gente tem lá o dna superhelicoidizado negativamente, ou seja, a abertura o equivalente a uma volta é facil(?), e a gente tem aquelas três sequencias de 13pb e quatro de 9. O que a gente percebe? Que uma ptn chamada DNA A reconhece essas sequencias de 9pb se associando ao dna, e a partir do momento em que se associa aumenta afinidade que elas tem uma com a outra. Então forma-se uma estrutura, gerando um laço. Então a DNA A reconhece a sequencia de origem de replicação, depois que isso acontece outras proteinas se associam, DNA B DNA C; A DNA B é a proteina com atividade helicase, que é uma enzima que tem a capacidade de quebrar as pontes de hidrogenio para desfazer a helice, ou seja, p desnaturar quimicamente o dna, separa as moleculas de dna e ai sim os nucleotideos estão livres para iniciar o processo de replicação.
Uma das características da dna polimerase procariotica é que ela não é capaz de iniciar a sintese de uma sequencia iniciadora, ou seja, ela nao consegue botar o nucleotideo complementar ao outro formando a primeira ligação fosfodiester, então em procariotos a gente uma enzima chamada primase (ou iniciase) que vai encontrar um ponto qualquer dentro daquela bolha e vai começar a adicionar ribonucleotideos complementares a sequencia de dna molde, ou seja, ela ta formando rna, e a partir do momento que a sequencia iniciadora atingir um determinado tamanho aí entao que aparece a dna polimerase, que consegue adicionar desoxirribonucleotideosno terminal 3’ de dna, de um iniciador de dna ou de rna. 
	ALONGAMENTO
A gente tem então um processo que ta ocorrendo bidirecionalmente; a primase vai adicionar os ribonucleotideos; depois a dna polimerase começa a adicionar desoxirribonucleotideos. A dna pol II vai fazer a maior parte do trabalho, e a I só o arremate; então a dna pol II vai adicionando desoxirribonucleotideos a medida que a helicase vai quebrando a helice e estendendo a forquilha de replicação (A DNA POL SÓ ADICIONA NUCLEOTIDEOS NO TERMINAL 3’, SE ELA SÓ ADICIONA NESSE TERMINAL COMO FICA A SEQUENCIA INICIADORA? A MEDIDA QUE A FORQUILHA DE REPLICAÇÃO VAI ABRINDO, UMA NOVA SEQUENCIA INICIADORA VAI SENDO ADICIONADA NO TERMINAL 3’ DELA A DNA POL II COMEÇA A ADICIONAR E ELA VAI PARAR EXATAMENTE SÓ QUANDO TIVER UMA OUTRA SEQUENCIA INICIADORA NA FRENTE DELA; OU SEJA, ELA VAI TENTAR ALONGAR ESSE PRIMER ATÉ ENCONTRAR UM OUTRO FRAGMENTO A DIANTE. POR ISSO O PROCESSO É SEMI DESCONTÍNUO; EXISTE UMA FITA DE DNA QUE É SINTETIZADA CONTINUAMENTE E ELA É SINTETIZADA NA DIREÇÃO DO MOVIMENTO DA FORQUILHA E A OUTRA É SINTETIZADA DESCONTINUAMENTE NA DIREÇÃO OPOSTA DO MOVIMENTO DA FORQUILHA -> SÃO GERADOS FRAGMENTOS, CHAMADOS DE FRAGMENTOS DE OKASAKI, QUE SERIAM FORMADOS POR UMA SEQUENCIA INICIADORA DE RNA E DESOXIRRIBONUCLEOTIDEOS.)
A DNA pol I tem atividade exonuclease 5’3’, que atua no 5’, então ela vai retirar os nucleotideos do 5’ e adiciona um desoxirribonucleotideo no lugar, então ela vai fazendo essa substituição até que chega no final encontrando o desoxirribonucleotideo e aí ela para. Aí a enzima dna ligase faz a ligação da ultima ligação fosfodiester.
[O DNA superhelicoidizado positivamente aparece naturalmente na frente da bolha de replicação e como ele é superhelicoidizada positivamente, o numero de nucleotideos por volta é pequeno, ele precisa ser subenrolado pela dna topoisomerase II, que leva ele p estado relaxado de 10pb; mas se essa mesma enzima pega o dna no estado relaxado e aumenta isso p 13pb por volta, ai nesse caso o dna fica superhelicoidizado negativamente
3- FINAL 
A gente tem sequencias que se associam a proteinas que vão ajudar na resolução dessas duas moleculas de dna. Por algum motivo, a molecula de dna circular do procarioto no final da replicação, uma molecula de dna fica dentro da outra, a gente costuma chamar cada molecula dessa de dna de concatâmeros, eles ficam concaterados, que para resolver novamente aparece uma dna topoisomerase II , só que diferente, que vai quebrar as duas fitas, só que em vez de girar, faz com que um anel saia de dentro do outro;
EM EUCARIOTOS:
O Numero de dna pol é enormes; a gente tem a alfa, delta e epison que atuam na replicação do dna genômico e a gama, que atua na replicação do dna mitocondrial. Existem outras que atuam em outras fases do metabolismo do dna, reparo. Em eucariotos, a origem de replicação não é tão bem definida como em procariotos. 
A gente vai ter uma região que é reconhecida por proteina. A gente tem na fase G1, a região de origem que se liga no complexo de reconhecimento da origem, depois duas outras proteinas se associam a esse complexo, depois mais uma proteina – helicase- que tambem se associa a esse complexo; passamos a chamar de complexo pré replicativo; isso fica lá na origem de replicação esperando que seja replicado. [EM DETERMINADAS FASES DO CICLO CELULAR, ALGUMAS CICLINAS DEFINEM QUE A SITUAÇÃO VAI PROSSEGUIR; QUANDO O CICLO CELULAR FICA NO FINAL DA FASE G1, QUE INICIA A FASE S, OCORRE A SINTESE DE UMA CICLINA, UMA PTN QUE VAI SE ASSOCIAR A UMA QUINASE DEPENDENTE DE CICLINA, CELICATO, QUE VAI PROMOVER A FOSFORILAÇÃO DA PTN CD66; QUANDO ISSO ACONTECE ELA SE DESLOCA DO COMPLEXO E COMEÇA A SER DEGRADADA E A QUE TAVA ASSOCIADA A ELA CDT1 TAMBÉM SOLTA E AÍ ESSA CICLINA FOSFORILA AQUELE COMPLEXO PROTEINA E AÍ COMEÇA ENTÃO O PROCESSO DE REPLICAÇÃO]
A molecula de dna genomico do eucarioto é linear. Nas celulas somaticas, de modo geral, telômero -> cada vez que a replicação acontece os telômeros vão diminuindo; mas se isso acontece em uma celula somática da p entender, maaaas se isso acontece em uma celula germinativa a coisa começa a complicar, porque se nela tiver pedaços de dna que não são replicados, a tua celula germinativa vai gerar individuos com telomeros menores, então nas celulas germinativas existe aquela atividade telomerase, que é uma enzima que sintetiza dna usando rna como molde (um grupo prostetico), vai alongar esse dna e depois completar esse pedaço. 
Boa parte dos tumores mais agressivos são aqueles que são monoclonados, partem de uma unica celula, e se a atividade telomerasica dele não estivesse funcionando, ele ia crescer e de repente ia parar, os telomeros iam diminuir e a ideia é que se esses telomeros forem diminuindo muito eles podem comprometer o processo de replicação daquele cromossomo e aí a celula se torna irreplicavel; então a partir do momento em que a celula vai se dividir muitas vezes, já que o tumor é monoclonal, ela vai chegar num ponto em que ela vai parar de crescer, só que a atividade telomerásica ela não é expressa em uma celula somatica, ela volta a ser expressa, permitindo que a celula continue se replicando. 
Existe uma classe de antineoplasicos que atuam na atividade telomerase; você consegue atuar como inibidor da telomerase você impede que esses telomeros sejam refeitos e o tumor depois de atingir determinado tamanho não vai conseguir progredir e assim as celulas vao ter sua replicação diminuida
OS TELOMEROS TEM UM MECANISMO DE MANUTENÇÃO NAS CELULAS GERMINATIVAS, NAS CELULAS SOMATICAS ISSO É PERDIDO;a