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1. O Trypanosoma cruzi e a Doença de Chagas
Doença de Chagas: A Descoberta.
Em 1909, Carlos Chagas comunicou a comunidade científica que, durante um projeto de erradicação da malária em Minas Gerais, ele observara a existência de uma doença causada por um protozoário flagelado. Chagas primeiro detectou estes protozoários no intestino de insetos conhecidos como barbeiros. Pesquisando possíveis hospedeiros vertebrados para este parasito ele encontrou Berenice, uma criança de dois anos que se tornou o primeiro caso registrado de infecção aguda causada por este protozoário flagelado em humanos (CHAGAS, 1909). Este protozoário foi inicialmente chamado de Schizotrypanum cruzi e logo depois foi nomeado como Trypanosoma cruzi em homenagem ao mentor de Chagas, Oswaldo Cruz. Posteriormente a infecção provocada por este parasita tornou-se conhecida como Doença de Chagas, uma homenagem ao seu descobridor, único pesquisador na história da medicina a identificar o agente etiológico de uma doença, seu transmissor, sintomas clínicos, animais reservatórios e todo o ciclo de vida de um parasito.
1.2 - O Trypanosoma cruzi : O agente etiológico da Doença de Chagas.
	O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado heteroxênico (possui um hospedeiro vertebrado e um invertebrado), taxonomicamente pertencente à classe Kinetoplastidae e à ordem Kinetoplastida que engloba a família Tripanosomatidae. Esta ordem é caracterizada pela presença de uma estrutura denominada cinetoplasto, região especializada da mitocôndria onde se encontra o DNA mitocondrial (WALLACE, 1966). Ao DNA mitocondrial condensado coube a denominação de kDNA. Os membros desta família apresentam um único flagelo e mitocôndria. Esta, além de abrigar o cinetoplasto, é única e muito ramificada (REVISTO EM DE SOUZA ET AL, 2016). 
	Os protozoários da família Trypanosomatidae são caracterizados por possuírem diferentes estágios de desenvolvimento durante seu ciclo de vida. No caso do T. cruzi, três principais estágios de desenvolvimento podem ser claramente identificados por microscopia óptica: epimastigota, tripomastigota e amastigota (Figura 1). A caracterização destes três estágios de desenvolvimento deve-se, principalmente, a três fatores: forma geral da célula, posição relativa do núcleo e do cinetoplasto e o ponto ao qual o flagelo emerge (REVISTO EM DE SOUZA ET AL, 2016).
O epimastigota (Figura 1a), estágio replicativo presente no intestino do inseto vetor, possui um formato alongado com um comprimento entre 20 e 40 μm e diâmetro de aproximadamente 5 μm. O cinetoplasto localiza-se na porção anterior ao núcleo e seu kDNA apresenta-se compactado em forma de bastão. Este estágio também possui capacidade replicativa em culturas axênicas (REVISTO POR DE SOUZA ET AL,2016).
O principal estágio infectante, denominado tripomastigota (Figura 1b), possui aproximadamente 25 μm de comprimento e 2 μm de diâmetro. Seu cinetoplasto localiza-se posteriormente ao núcleo apresentando um formato arredondado e um kDNA menos condensado. Neste estágio de desenvolvimento o parasito não possui capacidade replicativa (REVISTO POR DE SOUZA ET AL,2016).
	Caracterizada por apresentar um diâmetro de 3 a 5 μm e um flagelo curto não visível por microscopia óptica, o que originou sua denominação errônea, a forma amastigota (Figura 1c) é principalmente definida como o estágio replicativo no hospedeiro vertebrado (MEYER E DE OLIVEIRA, 1948). Porém, já foi demonstrado que amastigotas obtidos de diferentes fontes são capazes de infectar diversas células de vertebrados (CARVALHO E DE SOUZA, 1989; LEY ET AL., 1990; MORTARA, 1991; FERNANDES ET AL., 2006). Neste estágio o cinetoplasto se encontra na região anterior ao núcleo e possui o mesmo formato encontrado na forma epimastigota, com o kDNA compactado em forma de bastão (REVISTO EM DE SOUZA ET AL, 2016). 
Figura 1: Representação esquemática da ultraestrutura dos diferentes estágios de desenvolvimento de T. cruzi. A: Epimastigota, B: Tripomastigota, C: Amastigota. ADAPTADO DE TEIXEIRA ET AL., 2014. 
1.3 - O ciclo biológico do Trypanosoma cruzi.
	O ciclo biológico do T. cruzi é um ciclo complexo, possuindo dois tipos de hospedeiro: o hospedeiro invertebrado e o hospedeiro vertebrado (Figura 2). Os hospedeiros vertebrados englobam qualquer mamífero (aves, répteis e anfíbios são refratários ao T. cruzi) enquanto os hospedeiros invertebrados, também chamados de vetores, são insetos hematófagos da família Reduvidae. O inseto é capaz de se alimentar do sangue de um hospedeiro vertebrado contaminado e, desta forma, ingerir formas tripomastigotas sanguíneas e amastigotas. A maioria dos parasitos ingeridos é lisado no estômago dos insetos (CASTRO ET AL., 2007). No lúmen do trato digestivo do inseto as formas tripomastigotas que sobreviveram se diferenciam em epimastigotas, que se aderem à superfície do epitélio médio e posterior, multiplicando-se por divisão binária (ALVES ET AL., 2007; NOGUEIRA ET AL., 2007). No final do intestino, mais especificamente no reto, os epimastigotas sofrem o processo de metaciclogênese (diferenciação da forma epimastigota para tripomastigota metacíclico). Após a metaciclogênese, os tripomastigotas metacíclicos permanecem na ampola retal até que ocorra um novo repasto sanguíneo onde essas formas serão liberadas junto com as fezes do inseto (GARCIA ET AL., 2007).
	 Os tripomastigotas liberados pelo inseto são capazes de penetrar na derme do hospedeiro vertebrado, por solução de continuidade, invadindo diferentes tipos celulares. Neste momento, inicia-se o ciclo intracelular do T. cruzi, onde o disparo de diversas cascatas de sinalização culmina com o fechamento do vacúolo parasitóforo onde o parasito se encontra (RODRIGUEZ ET AL., 1996; REVISTO POR DE SOUZA, 2005). Para a formação deste vacúolo parasitóforo é essencial que haja a fusão com compartimentos da via endo-lisossomal, principalmente a fusão de lisossomos que descarregam seu conteúdo tornando o vacúolo parasitóforo um compartimento acídico (CARVALHO E DE SOUZA, 1989; LEY ET AL., 1990; ANDRADE E ANDREWS, 2004; BURLEIGH, 2005). A acidifcação do vacúolo parasitóforo é essencial para o escape do parasita para o citoplasma da célula hospedeira (ANDREWS E WITLOW, 1990). Já no citoplasma, tripomastigotas se diferenciam para amastigotas os quais vivem em contato direto com o citoplasma da célula hospedeira. Após uma fase estacionária, que dura aproximadamente de 16-24 horas inicia-se uma série de divisões fazendo com que amastigotas ocupem o citoplasma da célula hospedeira. Logo após os ciclos de divisões, os amastigotas se diferenciam para tripomastigotas. Ao final deste ciclo de divisões, o grande número de tripomastigotas em intenso movimento rompe bruscamente a membrana da célula hospedeira sendo então liberados para o meio extracelular. Parasitos liberados para o meio extracelular podem ganhar a corrente sanguínea e infectar outras células mantendo, desta maneira, a infecção. Quando o hospedeiro invertebrado se alimenta do sangue contaminado do hospedeiro vertebrado o ciclo é continuado (REVISTO POR DE SOUZA ET AL., 2014).
Figura 2: Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi. 1. Inseto reduvidae se alimenta do sangue hospedeiro vertebrado; 2. ingestão de tripomastigotas; 3. diferenciação em epimastigotas; 4. divisão de epimastigotas; 5. diferenciação em tripomastigotas; 6. liberação de tripomastigotas; 7. penetração de tripomastigotas na pele; 8. invasão em células hospedeiras; 9. lise do vacuolo parasitóforo; 10. diferenciação em amastigotas; 11. multiplicação de amastigotas; 12. diferenciação em tripomastigotas; 13. lise celular e liberação de tripomastigotas; 14. tripomastigotas e amstigotas extracelulares; 15a e 15b: reinfecção. Retirado e adaptado de TEIXEIRA ET AL., 2014.
1.4 - Doença de Chagas: um membro do grupo das Doenças Negligenciadas
 De acordo com DNDi, doenças negligenciadas são o conjunto de doenças causadas por agentes infecciosos e parasitários (vírus,bactérias, protozoários e helmintos) endêmicas em populações de baixo poder aquisitivo de países em desenvolvimento na África, Ásia e Américas. Por estes fatores, a Organização Mundial de Saúde (OMS), admite que estas doenças não despertam o interesse das grandes empresas farmacêuticas multinacionais (CALIXTO & SIQUEIRA JR., 2008). 
As principais doenças consideradas negligenciadas são malária, leishimaniose, doenças de Chagas, filariose e HIV pediátrica (DNDi). Das 580 milhões de pessoas que vivem na América Latina, 164 milhões são pobres, dentre estes 66 milhões são pobres extremos. A maior parte delas, incluindo as populações indígenas, populações rurais, moradores de favelas, trabalhadores migrantes, idosos, mulheres e crianças, vive em condições desfavoráveis ​​e sofrem uma carga maior de doenças infecciosas (CEPAL – Comissão Econômica para América Latina e Caribe – Panorama Social da América Latina, 2013). Dentre as doenças negligenciadas, a doença de Chagas apresenta grande prevalência no território brasileiro, visto que aproximadamente 1,9 milhões de pessoas apresentam-se infectadas (RASSI ET AL, 2010). Estudos realizados entre anos 2000 – 2011 indicam que a doença de Chagas foi responsável por 58.928 mortes no Brasil (76,7% de todas as mortes dentre as negligenciadas), devido principalmente a sua fase crônica (MARTINS-MELO ET AL.,2016).
	 Historicamente a doença de Chagas ocorre principalmente nos países da América Latina América Central e partes da América do Norte (México) sendo a causa de muitos casos de morbidade e mortalidade nestes países. Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde, aproximadamente oito milhões de pessoas estão cronicamente infectadas com T. cruzi e cerca de 10000 – 14000 mortes por ano são causadas por doença de Chagas (REVISTO POR RASSI JR ET AL., 2012, WHO, 2013). Nas áreas endêmicas, a doença acomete mais frequentemente indivíduos residentes em áreas rurais devido à coabitação entre insetos vetores infectados, animais domésticos e o próprio homem (DIAS, 2007). 
	Atualmente, países desenvolvidos considerados áreas não endêmicas vêm apresentando um aumento de casos de pacientes chagásicos. Isto ocorre como consequência da imigração de latino-americanos e das transmissões entre humanos que pode se dar através da exposição à sangue contaminado durante a gravidez, durante transfusão sanguínea e transplantes de órgãos (NICKERSON ET AL., 1989; WHO, 2002). A ocorrência em áreas não endêmicas torna a doença de Chagas um caso de saúde pública global (REVISTO POR RASSI JR ET AL., 2012; REVISTO POR TRAINA ET AL., 2016).
	Consideráveis progressos têm sido feitos em relação ao controle da transmissão natural (SCHOFIELD E DIAS, 1999, MONCAYO E SILVEIRA, 2009; DIAS, 2016). Entretanto, alguns casos ainda foram encontrados em algumas localidades, especialmente aquelas onde não existe um controle do inseto vetor (SARQUIS, 2004; ESPINOSA-GOMES ET AL., 2002). Nas regiões de controle do inseto o ciclo enzoótico de transmissão, como a transmissão vetorial extradomiciliar (principalmente associado a atividades laboriais extrativistas), tem ganhado grande importância (SILVEIRA, 2011). A transmissão oral também vem sendo descrita como uma forma de contaminação (CAMANDAROBA ET AL., 2002; REVISTO POR COURA, 2015; NOYA ET AL.,2015). No Brasil, tem-se observado um aumento de casos de infecção oral ocasionada principalmente pela ingestão de caldo de cana, açaí e palmito de açaizeiro contaminados e não pasteurizados (STEINDEL ET AL., 2007; NÓBREGA ET AL., 2009). 
1.5- Aspectos clínicos da doença
A doença de Chagas apresenta duas fases clínicas distintas – aguda e crônica.
1.5.1 Fase Aguda
O T. cruzi induz uma infecção aguda que dura menos de 90 dias, com elevada parasitemia no sangue e sintomas geralmente brandos ou não específicos, o que faz com que o diagnóstico muitas vezes seja falho. No entanto, em alguns casos, a fase aguda pode ser fatal, ou ainda levar a quadros de miocardite e meningoencefalite (BERN ET AL., 2008). No local da entrada do parasito pode haver formação de uma lesão inflamatória, conhecida como Chagoma de inoculação. Se o local da infecção for a mucosa ocular, o chagoma é chamado de Sinal de Romaña, um edema unilateral e bipalpebral. O processo inflamatório se espalha na região infectada e pode haver linfoadenopatia. Dentro das células do organismo hospedeiro, o parasito começa a se multiplicar em ciclos assincrônicos, promovendo destruição de tecido (TANOWITZ ET AL., 1992).
Em muitos indivíduos a fase aguda apresenta sintomas bem discretos. No entanto, quando há manifestações, estas ocorrem em um período de 7 a 14 dias e incluem febre, hepatoesplengomegalia, náuseas, vomito, diarréia, anorexia, irritação da meninge e conjuntivite (quando há infecção pela mucosa ocular). Um pequeno número de pacientes desenvolve miocardite, podendo apresentar taquicardia, cardiomegalia e falência cardíaca (TANOWITZ ET AL., 1992). A fase aguda é seguida por uma fase crônica na qual a parasitemia diminui, atingindo níveis baixos que impedem a detecção do parasito por exames de sangue.
1.5.2 Fase Crônica Indeterminada
A fase indeterminada é definida como o período clínico de silêncio prolongado que segue a fase aguda. 
1.5.3 Fase Crônica Sintomática
A fase crônica perdura por toda a vida do indivíduo. A cada ano, cerca e 2-5% dos indivíduos em fase indeterminada evoluem para um quadro de fase crônica (CARODARTAL, 2007). Nesta fase, a manifestação clínica mais importante da doença é a cardiomiopatia e corresponde a um percentual de 10-30 % do total de indivíduos infectados. Em números isto representa 1,6-5,4 milhões de pessoas. Quando há cardiomiopatia, podem ser observados mionecrose, miocitólise, infiltrados inflamatórios e hipertrofia miocelular difusa. Todas as áreas do coração, incluindo as vias condutoras, podem ser afetadas resultando em perturbação do sistema cardíaco (TANOWITZ ET AL., 1992).
O cólon também está frequentemente envolvido na patogênese da doença. Quando há manifestações no cólon observa-se aumento de todo o órgão – megacólon – com sintomas de constipação. O esôfago é outro órgão que pode apresentar anormalidades (TANOWITZ ET AL., 1992). O impacto econômico da doença de Chagas na fase crônica é muito alto. Cerca de 30% dos casos de fase crônica desenvolvem lesões cardíacas e digestivas severas como arritmia cardíaca, megaesôfago e megacólon, e que representam 75, 45 e 30 mil casos por ano respectivamente, com custos estimados em US$ 750,000/ano (MONCAYO & SILVEIRA,2009).
1.6 - A quimioterapia para a doença de Chagas
	O tratamento da doença de Chagas visa curar a infecção aguda, prevenir danos aos órgãos no caso de infecção crônica assintomática e limitar a incapacidade e morbidade quando já houver manifestações clínicas (RASSI JR ET AL., 2010). Esta quimioterapia é, atualmente, baseada em dois compostos: benznidazol e nifurtimox. No Brasil somente o benznidazol é utilizado, sendo produzido pelo Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (Lafepe). Tanto o benznidazol quanto o nifurtimox têm como mecanismo de ação a formação de radicais livres e/ou metabólitos eletrofílicos através de enzimas do tipo nitroredutases, que fazem a redução do grupamento nitro (NO2) presente nessas moléculas em amino (NH2) (REVISADO POR CASTILLO ET AL., 2010). Diferente do nifurtimox, o mecanismo de ação do Bzn não depende diretamente de espécies reativas de oxigênio. Acredita-se que o radical nitro formado irá interagir covalentemente com macromoléculas (DNA e citocromo P450), além de inibir a proliferação do parasita através da enzima fumarato NADH-redutase (DÍAZ DE TORANZO ET AL., 1988). O principal efeito citotóxico está relacionado à atividade enzimática da redução do grupamento nitro que resulta em radicais livres (VIOTTI ET AL., 2009). O uso de benznidazol pode ocasionar diversos efeitos colaterais como edema, febre, ressecamento da pele, dores articulares e musculares, neuropatia periférica e linfadenopatia, neutropenia, dores de garganta e púrpuratrombocitopenica (MCKERROW ET AL., 2009). Estudos revelaram que o benznidazol apresenta atividade significativa durante o tratamento de casos de fase aguda ou ainda recém-crônica, alcançando uma taxa de cura parasitológica de 60%, enquanto que em pacientes em fase crônica tardia (mais de 10 anos de infecção) o índice de cura parasitológica reduziu para 10-20% (RODRIGUEZ-COURA & DE CASTRO, 2002). Sua eficácia varia de acordo com a cepa de T. cruzi, a fase da doença, idade do paciente, período e dose de tratamento. Deste modo, o benznidazol é considerado uma droga insatisfatória já que só possui atividade significativa nas fases aguda ou crônica recente (SOSA-ESTANI ET AL., 1998). Por não existir um tratamento efetivo para a fase crônica esta doença ainda é considerada um importante caso de saúde pública. Estes dados deixam clara a necessidade urgente de novas alternativas no tratamento da doença de Chagas. Deste modo, a Organização Mundial de Saúde (OMS) definiu um perfil de alvo para produção de novos compostos que inclui dois elementos chaves: eficiência por via oral nas fases indeterminada e crônica da doença e tratamento completo em menos de 60 dias. Além disso, a droga ideal precisa preencher alguns pontos importantes como ser um composto estável, barato, disponível na forma oral e eficiente. A molécula deve ter afinidade por um ou mais alvos do parasito, interferindo em aspectos essenciais do metabolismo e com capacidade de matar o patógeno rapidamente. É preciso ainda ter baixa ou nenhuma toxicidade com organismo humano (FREARSON ET AL., 2007).
	Embora exista financiamento para pesquisas relacionadas às doenças negligenciadas, incluindo a doença de Chagas, o conhecimento produzido não tem se revertido em avanços terapêuticos, como novos fármacos, métodos diagnósticos e vacinas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010). Uma das razões para esse quadro é o baixo interesse da indústria farmacêutica nesse tema, justificado pelo reduzido potencial de retorno lucrativo para a indústria, uma vez que a população atingida é de baixa renda e presente, em sua maioria, nos países em desenvolvimento (PÉCOUL B. ET AL., 2001). Emboras as doenças negligenciadas representem 11,4% da carga de doenças globais, os registros entre os anos de 1975 e 1999 demonstram que apenas 1% dos 1.393 novos fármacos comercializados foram direcionados para doenças negligenciadas em geral (TROUILLER P. ET AL., 2002). Este desequilíbrio também é visto no nível global de investimentos da indústria farmacêutica para pesquisa e desenvolvimento: dos US$ 35,3 bilhões de dólares investidos em 1999, apenas 10,1% foi gasto em doenças negligenciadas (PÉCOUL B. ET AL., 2001). Associado a este fato muitas doenças negligenciadas ainda não apresentam medicamentos disponíveis (CHATELAIN & LOSET, 2011).
1.7 - Desenvolvimento de fármacos para Doenças Negligenciadas
A descoberta de novos medicamentos consiste na síntese e análise de novos compostos que se mostrem promissores no combate a alguma patologia (ANVISA – portal.anvisa.gov.br). Atualmente o desenvolvimento de novos compostos quimioterápios está baseado, principalmente, na descoberta de alvos terapêuticos, desenho e seleção da molécula líder para o alvo pretendido, otimização, desenvolvimento do candidato e finalmente, produção do futuro medicamento. Para isto, as indústrias farmacêuticas passaram a utilizar os recursos da química combinatória e a realizar testes totalmente controlados por robôs de alta capacidade, capazes de testar mais de 1 milhão de amostras a cada ano. Esse fato, ao mesmo tempo em que reduziu o tempo de desenvolvimento de novos compostos fez com que os custos de desenvolvimento de um novo medicamento aumentassem expressivamente (DIMASI ET AL., 2003). A descoberta por novos compostos é apenas a etapa inicial. Em seguida, os medicamentos são desenvolvidos a partir de difereestes compostos são direcionados a estudos pré-clínicos e clínicos (fase I, II, III e IV), para análise de ação de possível efeito tóxico (CALIXTO & SIQUEIRA JR., 2008). 
Em relação a doenças negligenciadas, uma iniciativa de Medicamentos para Doenças Negligenciadas (DNDi – www.dndi.org) estabelece uma abordagem mais específica para o desenvolvimento de novos fármacos. O processo para descoberta se estabelece a partir das características das doenças negligenciadas. Pontos importantes como testes in vitro com determinado parasito, a toxicidade e as propriedades físico - químicas do composto, são medidas para definir pontos de decisão e fornecer informações objetivas para estudos futuros. Os principais pontos de decisão a partir desses critérios são:
Seleção de sucesso: Decisão de avançar para estudos in vivo e atingir a expansão, baseada na identificação de um único composto;
Seleção de execução: Decisão de proceder à otimização química com base na revisão de uma série de produtos químicos análogos do composto; 
Seleção otimizada: Decisão de proceder à regulamentação pré-clinica, ou seja, os testes farmacêuticos de um composto ou de um pequeno número de compostos a partir da mesma classe química;
Seleção de candidatos de drogas: Decisão de proceder à avaliação clínica de um composto com a mesma classe química (CHATELAIN & LOSET, 2011).
	A iniciativa DNDi junto ao comitê coordenado pelo Fundo de Saúde Global e Tecnologia Inovadora (GHIT) concebeu os critérios específicos para malária, tuberculose e doenças de Chagas (KATSUNO ET AL., 2015). Segundo o estudo, para a descoberta de drogas, a qualidade inicial na identificação das moléculas químicas (conhecido como “hits”) é um fator chave, pois resulta na probabilidade do sucesso dos futuros candidatos clínicos (MARTINS ET AL., 2011; KHANNA, 2012). As decisões para o sucesso no processo de identificação e otimização são cruciais, entretanto a fase de otimização pode levar anos e requer considerável investimento financeiro. Para a Doença de Chagas os “hits” estabelecidos foram: seleção in vitro (potência celular) – o inibidor deve ter sucesso para reduzir 50% do máximo da concentração (IC50 < 10uM) contra Trypanosoma cruzi intracelular (agente etiológico da Doença de Chagas); seleção in vivo – camundongos infectados caracaterizados na fase aguda da doença, o inibidor deve demonstrar uma redução de 80% da carga parasitária em órgãos ou tecidos, ou não deve haver parasitas detectados no final do tratamento, além de um aumento no tempo de vida de até 10 doses a 50 mg por kg por via oral (KATSUNO ET AL., 2015).
Na pesquisa por novos medicamentos há grandes desafios envolvidos, são eles: falta de motivação da indústria farmacêutica, validação de novos alvos moleculares, longo período de obtenção dos compostos líderes, compostos inéditos e não oriundos de outros já comercializados, completa biblioteca de compostos, e infra estruturada organizada (GIAROLLA & FERREIRA, 2011). Para a maioria das Doenças Negligenciadas, não existem tratamentos ou opções de prevenção, e no mercado há poucos medicamentos, além de caros para as populações de baixa renda e comercialmente pouco atraentes para as farmacêuticas multinacionais (FREW ET AL.,2009). Diante desse aspecto de dificuldades e limitações, torna – se clara a necessidade de novos medicamentos, que possam ser eficientes, atender as particularidades das doenças negligenciadas, atuar no alvo terapêutico, sem riscos para a saúde do homem, serem produzidos em larga escala e comercialmente baratos para a população de modo geral. 
1.8 - Compostos metálicos como novos compostos quimioterápicos
Metalocomplexos são compostos inorgânicos que apresentam distintas atividades: como fungicida, bactericida e antiviral. Sugere-se então, que esses compostos sejam importantes protótipos para o desenvolvimento de novas drogas (FERNANDES ET AL., 2010). Alguns metalocomplexos agem como nucleases e peptidases sintéticas, possuindo grande importância para manipulação de DNA e o desenvolvimento de novas drogas de efeito terapêutico (PARRILHA et al., 2008).
Complexos ferro (III), cobalto (II), cobre (II) e zinco (II) apresentaram atividadecontra Staphylococcus aureus. Análise por microscopia eletrônica de transmissão mostrou possíveis mecanismos de ação de duas drogas metalocomplexas, complexos ferro e zinco, a de maior e a de menor atividade, respectivamente. O Complexo ferro é provavelmente ligante de proteínas presentes na parede celular, pois provocou a deposição periférica de grânulos nesta região. Já o complexo zinco interage diretamente com o material genético da bactéria S. aureus, provocando danos à parede celular e à membrana plasmática, além de gerar o esvaziamento do conteúdo celular, inibindo assim a divisão celular (FERNANDES et al., 2010). 
A facilidade de coordenação dessas moléculas metálicas a compostos orgânicos, vêm possibilitando a formação de diferentes complexos, e provoca grande interesse na associação dessas drogas como instrumento de estudos futuros (FERNANDES ET AL., 2010). A literatura mostra que a coordenação de compostos pode ser uma alternativa interessante para terapia antiparasitária. Por exemplo, compostos contendo íons cobre ou cobalto ligados ao ligante (5-metil-1,2,4-triazol [1,5-a] pirimidina – 7 (4H)-um) (HmtpO), afeta fortemente o metabolismo energético de L. infantum e L.brasiliensis alterando a estrutura de membrana de organelas e induzindo morte celular (RAMIREZ-MACIAS ET AL., 2011). Esses compostos foram também ativos in vitro contra formas tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi em concentrações similares as de compostos usados comumente na terapia clínica como benznidazol, porém, com reduzida toxicidade para a célula hospedeira e melhor índice de seletividade. Além disso, em testes in vivo os compostos causaram redução da carga parasitária em relação ao tratamento com benznidazol (CABALLERO ET AL., 2011). 
	Complexos antiparasitários, derivados de benzo[g]ftalazina conjugados com imidazol e pirazol gerou resultados positivos, que mostram alterações ultraestruturais em epimastigotas de T. cruzi, por microscopia eletrônica de transmissão. Essas alterações foram: significativa presença de glicossomos nos parasitos tratados do que no controle, vacuolização extensiva, ausência e distorção de organelas citoplasmáticas e alterações na mitocôndria. Os mesmos compostos foram testados em formas amastigotas de T. cruzi e também obtiveram resultados positivos para terapia antiparasitária contra a doença de Chagas (SANCHEZ-MORENO ET AL., 2010).
1.9 - Análise Multiparamétrica de Alto Conteúdo: nova metodologia para avaliação da atividade de compostos quimioterápicos
Em relação à produção e testes de novos quimioterápicos, o DNDi estima que cerca de trinta mil novas moléculas estejam sendo testadas contra o T. cruzi em diversos laboratórios/institutos de pesquisa (LESLIE, 2011). Também existe um estímulo à utilização de drogas já disponíveis no mercado para os testes contra a doença de Chagas, o que diminuiria os custos de relacionados à produção de um novo medicamento (RASSI JR ET AL, 2010; URBINA & DOCAMPO, 2003). Porém, é fundamental o estabelecimento de procedimentos padronizados e aceitos por todos para a avaliação dos efeitos biológicos de fármacos comercializados e utilizadas na prática médica, bem como novas moléculas bioativas sintetizadas pelos vários programas de síntese. 
Para os estudos de fármacos comercializados, novas moléculas bioativas e padronização de protocolos para estudos de mecanismos de ação de drogas, a técnica hoje recomendada é a triagem de alto desempenho de dezenas a milhares de moléculas químicas através de um microscópio para análise celular multiparamétrica de alto conteúdo (do inglês, High Content Analysis, HCA) (GIULIANO ET AL., 1997). Nos últimos 15 anos, a microscopia de alto rendimento, que agrupa a técnica conhecida como análise celular multiparamétrica de alto conteúdo, tem sido uma das tecnologias que mais cresce na área de biologia celular. Este tipo de microscopia é definida pela sua produtividade, que normalmente significa processamento de milhares para centenas de milhares de amostras e inclui automatização do preparo de amostras, do imageamento e/ou aquisição de dados (REVISTO POR USAJ ET AL., 2016). Além disso, a microscopia de análise celular multiparamétrica é capaz de fornecer uma rica resolução espaço-temporal, que é necessária para compreender completamente a complexidade e dinâmica dos processos biológicos celulares (REVISTO POR USAJ ET AL., 2016). Esta tecnologia também tem se demonstrado eficiente para identificar compostos ativos entre um grande número de pequenas moléculas, desse modo ajuda na descoberta de novas drogas com novos candidatos a medicamentos, e otimiza os custos da pesquisa e tempo (FREITAS-JUNIOR ET AL., 2012). Essa seleção de alto conteúdo é uma tecnologia amplamente utilizada em programas de descoberta de drogas atualmente nas indústrias, que visa acelerar a identificação de substâncias potencialmente ativas contra várias doenças avaliadas a partir da atividade antiviral em um período relativamente curto de tempo (FREITAS-JUNIOR ET AL., 2014).
 As análises para triagem de diferentes compostos mais comumente realizadas pelo HCA incluem imagens automatizadas de fluorescência, quantificação celular, ensaios de viabilidade e índice de infectividade (MELISSA & VICKY, 2015). As imagens de alto conteúdo permitem também a quantificação de características celulares específicas (SNIJDER ET AL.,2012). Algumas exigências são necessárias para obter resultados positivos, como células saudáveis e livres de contaminação, culturas com mesmo número de passagem, células com menos de 80% de confluência, mesma concentração de solvente químico para as drogas em teste e estabelecer concentrações eficientes dos compostos (www.tdi.ox.ac.uk). Muitos detalhes são necessários para obter imagens automatizadas, como: 
um microscópio especializado capaz de ler placas de formato de 96 a 384 poços em diferentes comprimentos de onda;
automatização para ler placas e permitir que as imagens a sejam adquiridas durante a noite e no fim de semana;
software específico que permite a visualização de todos os dados dos poços, e exporta características celulares em um formato de dados gerenciáveis ​​(por exemplo, .xls, .csv ou .txt);
experiência e conhecimento técnico para essa tecnologia;
a densidade celular adequada deve ser determinada empiricamente; por exemplo, células pouco confluentes, não são fácieis para segmentar e identificar no software;
o número de canais trabalhados aumenta vastamente o tempo de captura e obtenção das imagens, por isso deve ser considerado os canais que são realmente necessários para seu resultado (SAUNDERS ET AL., 2014). 
 Os ensaios requerem protocolos robustos e pode ser altamente específico (por exemplo, a medição de um determinado processo molecular de uma via de morte celular) ou mais em geral (por exemplo, contagem de celular e distinguir células viáveis). As análises das imagens tipicamente requerem uma grande quantidade de tempo e esforço para desenvolver, devido a necessidade inerente de "ensinar" para o algoritmo computacional (software específico) as complexidades do fenótipo, seguido de quantificação estatistica representativa do número de células por poço e campos, e posterior validação estatística dos dados obtidos (SAUNDERS ET AL., 2014). Mesmo com esse detalhamento do processo, há a possibilidade de ocorrer erros que são oriundos da incorreta semeadura das células, pipetagem, degradação dos reagentes, solubilidade, pH, temperatura das estufas de incubação, variações na concentração do gás e na umidade (www.tdi.ox.ac.uk). 
Freitas Junior e colaboradores (2012) iniciaram o desenvolvimento de um protocolo a partir da triagem de drogas in vitro e imagens automatizadas a partir de experimentos de interação da forma intracelular amastigota de Leishmania com macrófagos humanos. Os ensaios realizados foram baseados no número de imagem e algoritmos, projetados por computadores e desenvolvidos para interpretar a infecção e quantificar as atividades de compostos anti-parasitários. Para confirmar a importânciada utilização de ensaios HCA, verificou-se número de células; número de células infectadas (células contendo pelo menos um parasita); proporção de infecção (o número de células infectadas dividido pelo número de células); número total de parasitas por célula; o desvio padrão do número de parasitas por célula; área total de células (número de pixels ocupados por células), e área média por célula (número médio de pixels por célula). Nesse trabalho foi descrito que HCA seleciona fenótipo específico para Leishmania (ausência ou redução de protozoários em células hospedeiras de macrófagos), a partir da avaliação das atividades dos compostos. Os potenciais alvos foram expostos aos compostos testados, aumentando a probabilidade de encontrar compostos ativos com diferentes modos de ação. HCA demostrou ser uma ferramenta importante para o desenvolvimento de um novo fármaco e auxilia na busca por novos compostos ativos contra Leshimaniose. Trypanossoma cruzi e Leishmania são gêneros de protozoários da família Trypanosomatidae, logo os mesmos padrões desenvolvidos por Freitas Junior e colaboradores (2012), podem ser comprovados e testados em T.cruzi, na busca por novos mecanismos contra Doença de Chagas.
Os ensaios de HCA para triagem fenotípica em T.cruzi requerem na manutenção in vitro, culturas capazes de produzir protozoários suficientes para gerar infecção significativa, idade da cultura celular, cepa do protozoário, estágio do ciclo de vida e o tempo de incubação também devem ser considerados como relevantes para o uso destes nos ensaios (SYKES & AVERY, 2013). Os experimentos para essa triagem são realizados da seguinte forma: culturas celulares mantidas em placas de 384 poços são infectadas com T.cruzi na forma tripomastigota (forma infectiva) que se desenvolve e multiplica no interior de células hospedeiras na forma amastigota (MELISSA L. & VICKY M., 2013; MELISSA L. & VICKY M., 2015). Após 24h de interação, os compostos testados são incubados em diferentes concentrações, com objetivo de encontrar a concentração mais próxima ao IC 50 (concentração máxima inibitória de 50% da infecção) e verificar o composto mais ativo. Nos determinados tempos experimentais (24h, 48h, 72h) são capturadas imagens dos poços, através do microscópio óptico de fluorescência automatizado, e posteriormente essas imagens são analisadas pelo software específico. Os dados obtidos são analisados quantitativamente a partir de parâmetros como índice de infectividade e citotoxidade, viabilidade celular e atividade gerada pelo composto ativo (MELISSA L. & VICKY M., 2015). Autores descrevem que esse tipo de ensaio automatizado é reprodutível, gera leituras de alta qualidade e bem sucedido na identificação de compostos que já foram relatados na literatura com atividade contra T.cruzi, descrevendo a sensibilidade desde padrão, além da vantagem de determinar a presença de baixos níveis de amastigotas após o tratamento com os compostos, importante para o potencial farmacológico dos ensaios (MELISSA L. & VICKY M., 2013; ALONSO-PADILLA & RODRÍGUEZ, 2014; ANNANG ET AL., 2015; MELISSA L. & VICKY M., 2015).
1.10 - Validação de métodos
O bom desempenho de qualquer técnica analítica depende crucialmente de dois parâmetros: a qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatística dos cálculos envolvidos no seu processamento. Uma forma de assegurar a aplicabilidade e o alcance de um método durante as operações de rotina de um laboratório é estabelecendo os limites destes parâmetros por meio da etapa conhecida como validação (RIBEIRO ET AL, 2008). A necessidade de se mostrar a qualidade das análises químicas está sendo cada vez mais reconhecida e exigida, pois, dados analíticos não confiáveis podem conduzir a decisões desastrosas e a prejuízos financeiros irrecuperáveis (RIBANI ET AL., 2004). Segundo a ABNT NBR ISO/IEC 17025, validação é a confirmação por exame e fornecimento por evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado uso pretendido são atendidos. 
Durante a validação de algum método, um passo importante é definir o planejamento de validação, que inclui a aplicação, objetivo, escopo do método, os parâmetros de validação e os critérios de aceitação, todos esses requisitos são documentados no protocolo de validação. Os parâmetros de validação são os indicadores quantitativos do protocolo de validação e do bom desempenho das técnicas, e são descritas como: Seletividade, Linearidade, Faixa de trabalho, Faixa linear, Limite de detecção, Limite de quantificação, Tendência/recuperação, Precisão (repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade) e Robustez (DOQ-CGCRE-008). Esses parâmetros e os critérios são específicos para cada tipo de método, de acordo com as características do método e o objetivo da validação. 
Este trabalho tem como objetivo a produção de protocolos padronizados e a validação da técnica de HCA (High Content Analysis), por comparação da técnica manual à técnica automatizada, pelo método de contagem de células infectadas por tripanossomatídeos. A otimização do método automatizado é importante para que a validação seja coerente, por isso alguns experimentos importantes foram realizados. Esses experimentos determinaram a concentração de células e de protozoários ideais para os ensaios, modelo celular mais adequado e referências específicas do protocolo de quantificação. A partir da otimização o ensaio se tornou robusto e de fácil repetitividade, dando continuidade ao trabalho, definimos os parâmetros de validação. Os parâmetros de validação utilizados foram: 
Máximo de quantificação, para concentração celular de plaqueamento e a concentração parasito /célula hospedeira. Ou seja, concentrações máximas para que ocorra uma adequada quantificação, tanto pelo método manual quanto pelo método automatizado. (Critério de aceitação: concentração celular 5.103 / concentração parasitos 50:1).
Seletividade suficiente, para avaliar a eficiência da contagem por HCA (método automatizado) comparada com a contagem manual (método de referência). A determinação estatística é descrita pela comparação arbitrária (comparação entre as contagens para verificar se há diferença significativa entre os métodos).
Exatidão, para avaliar e garantir que a contagem manual seja significativa, e usada como referência. A determinação estatística é descrita pelo Teste T Student. (Critério de aceitação: tcalc < tcritico).
A validação da contagem de células infectadas com tripanossomatídeos, pelo método de HCA, será importante para descoberta de novos compostos contra Doença de Chagas. Pois com desse método, devido a rapidez e a reprodutibilidade, é possível analisar em um mesmo experimento, grande número de compostos testados, e uma resposta mais rápida sobre os mais eficientes. 
1.10 - Trypanosoma dionisii: um possivel modelo não patogênico para doença de Chagas 	
Embora haja uma urgência para a produção de novos compostos contra as formas infectivas de Trypanosoma cruzi, relativamente poucos laboratórios são capazes de testar os compostos contra formas infectivas. Em muitos países a legislação impoe muitas restrições ao trabalho com protozoários patogênicos sendo sempre importante lembra que muitos casos de infecção por T. cruzi repostado na literatura ocorreu devido a infecções acidentais em laboratórios de pesquisa (HERWALDT, 2001; BRENER AND GAZINELLI, 1997). Este fato também explica porque o "screening" de compostos anti T. cruzi ocorre, em muitos laboratórios, utilizando o estágio de desenvolvimento não infectivo mantido em culturas axênicas (epimastigotas). Diante deste fato surge a necessidade de um modelo não patogênico, capaz de infectar células de mamífero, para testes iniciais de novos compostos quimioterápicos.
O Trypanossoma dionisii é um tripanosomatídeo não patogênico, isolado de quirópteros (morcegos) em países do novo e velho mundo (HOARE, 1972, MOLYNEUX, 1991). Assim como o T. cruzi, o T. dionisii pertence ao subgênero Schizotrypanum e apresenta um ciclo de vida heteroxênico divididoentre um hospedeiro invertebrado e um hospedeiro vertebrado (Figura 3) (HOARE, 1972). Em morcegos infectados com T. dionisii, formas amastigotas (similares as de T. cruzi) são encontradas no músculo esquelético de morcegos infectados com essa espécie (GARDNER E MOLYNEUX, 1988). Entretanto, diferente das demais espécies de Schizotrypanum, além de “ninhos” de amastigotas nos músculos cardíaco, estriado e do estômago, T. dionisii produz “pseudocistos” contendo formas epimastigotas no coração, diafragma, músculos do esterno, mucosa intestinal e ovário dos morcegos. Este protozoário possui alta capacidade de infectar células de mamíferos em geral, explorando as mesmas vias de entrada e infecção do Trypanossoma cruzi, além da semelhante manutenção em cultura (MAEDA ET AL, 2012; OLIVEIRA ET AL, 2009). Também se sugere que estes parasitos exploram estratégias similares para completar seu ciclo de vida, e ambas as espécies dividem componentes antigênicos e epítopos que são reconhecidos por anticorpos monoclonais contra T. cruzi (MAEDA ET AL, 2012; OLIVEIRA ET AL, 2009). Diversos autores sugerem que os genes gGAPDH (codificador da enzima glicossômica GAPDH) e SSU rRNA (codificador da subunidade menor de RNA ribossômico) geram topologias congruentes devido a formação de alinhamentos confiáveis, e as análises independentes e combinadas desses genes têm comprovado a proximidade filogenética entre Trypanosoma cruzi e Trypanosoma dionisii (HAMILTON ET AL, 2007, CAVAZZANA ET AL, 2010). Por outro lado, T. dionisii não é capaz de manter uma infecção em humanos e alguns mecanismos de morte deste parasita foram propostos como, por exemplo, morte extracelular dos parasitas revestidos por anticorpos, citotoxicidade mediada por linfócitos e/ou mediada por complemento (MKWANANZI ET AL., 1976; THORNE ET AL., 1979, GLAUERT ET AL., 1982).
Desde 1977, T. dionisii tem sido descrito como um potencial modelo experimental para rastreio inicial de novos compostos desenvolvidos para o tratamento da doença de Chagas (GABORAK, 1977). Os novos dados que demonstram a proximidade filogenética assim como o compartilhamento das mesmas vias de entrada corroboram com a sugestão de que o T. dionisii seja um ótimo modelo não patogênico para estudos relacionados à doença de Chagas. 
Figura 3: Representação esquemática do ciclo biológico de Trypanosoma dionisii. Adaptado de Molyneux, 1991
2. Objetivos
2.1 Objetivo geral
Produção de protocolos padronizados e a validação da técnica de HTS para analisar o efeito inibitório, a viabilidade da célula hospedeira e mecanismos de morte gerados pelo tratamento com compostos metalocomplexos, nos modelo de infecção in vitro de T.cruzi e T. dionisii, visando rapidez e reprodutibilidade quando comparado com as técnicas atualmente utilizadas.
2.2 Objetivos específicos
Avaliar o efeito dos compostos metalocomplexos, no crescimento de amastigotas intracelulares de T.cruzi e T.dionisii mantidos em células LLCMK2 e RAW 264.7 por diferentes tempos do desenvolvimento de seu ciclo celular e selecionar os compostos de melhor desempenho.
Analisar os possíveis danos ultraestruturais em T.cruzi e T.dionisii in vitro em interação com células LLCMK2, após o tratamento com os compostos selecionados, a fim de estudar a atividade antiparasitária dos mesmos.
Comparar os estudos entre T.cruzi e T.dionisii, e justificar a proximidade genética entre os protozoários.
Desenvolver protocolos padronizados para aprimoramento da técnica de HTS para tripanossomatídeos.
Comparar a técnica automatizada com a técnica manual já bem descrita na literatura.
Validação do método automatizado.
3.Material e métodos
 Parâmetros de validação e otimização do método automatizado
Os parâmetros de validação definidos para esse trabalho foram: máximo de quantificação, exatidão e seletividade. Diversos experimentos foram propostos com objetivo de comparar o método manual com o automatizado. Para definir o máximo de quantificação, uma curva de plaqueamento celular foi realizada para os dois tipos celulares (LLCMK2 e RAW 264,7), as concentrações definidas foram: 5x102, 103, 5x103, 104 e 5x104. O mesmo experimento foi realizado para obter a concentração ideal na relação parasitos por célula hospedeira, as concentrações testadas foram: 5:1, 10:1 e 50:1. Para definirmos a contagem manual como referência, usamos o parâmetro de exatidão, através da ferramenta estatística Teste t, com objetivo de garantir que a contagem manual seja significativa.
O parâmetro de seletividade foi definido através da comparação entre as contagens
dos métodos, e como ferramenta estatística usamos a comparação arbitrária. O método automatizado é relativamente novo quando comparado ao método manual, logo, houve uma necessidade de otimizar os procedimentos necessários para o método se tornar robusto e reprodutível. Para isso, foi observado quesitos importantes relacionados ao software do equipamento InCell Analyzer 2000 e detalhes experimentais. 
 3.2 - Parasitos Utilizados
	Para o desenvolvimento desta dissertação foram utilizados tripomastigotas e amastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y -TcII) , isolada de um caso agudo de doença de Chagas (SILVA E NUSSENZWEIG, 1953) e tripomastigotas e amastigotas de Trypanosoma dionisii (cepa TCC211) isolados de morcegos no estado de Rondônia, Brasil. Esta cepa por gentilmente doada pela Dra. Martha Teixeira (USP). Ambas espécies foram mantidos e obtidos in vitro conforme descrito a seguir.
3.3 - Manutenção dos parasitas in vitro
Para a manutenção de tripomastigotas in vitro (T. cruzi e T. dionisii), foi utilizada a linhagem de células epiteliais LLC-MK2 (ATTC – CCL7) cultivadas em garrafas de cultura de tecidos de 175cm3 (TPP) em meio RPMI 1640 (Thermo) suplementado com 10% de SFB (Thermo). As culturas foram mantidas a 37o C sob atmosfera de 5% de CO2, sendo que o meio RPMI 1640 e o SFB foram trocados a cada 48 horas. Após a confluência, as culturas foram tratadas com 1mL de uma mistura de tripsina e verseno (Sigma-Aldrich) (0,2 e 0,002%, respectivamente) e as células soltas foram coletadas, diluídas 1:5 e distribuídas em novas garrafas de cultivo onde, após 24 horas, foram infectadas com o estágio tripomastigota de T. cruzi ou tripomastigotas de T. dionisii na proporção aproximada de 10:1 parasitos/célula. De cinco a sete dias após a infecção, o estágio tripomastigota foi obtido a partir do recolhimento do sobrenadante da cultura. Os tripomastigotas obtidos de culturas infectadas também foram utilizados para infectar novas garrafas de cultivo contendo células LLC-MK2, conforme descrito acima, mantendo a infecção. As culturas infectadas também tiveram as soluções de meio RPMI 1640 e SFB trocadas a cada 48 horas.
3.4 - Cultivo e manutenção das célula-hospedeiras	Comment by Emile: Thay, falta colocar da RAW aqui também.Tem que colocar também que concentraçoes diferentes foram feitas em 96 pocos até chegar a concentração ideal.
	Células epiteliais de rim de macaco Rhesus (Macaca mulatta), LLC-MK2 (ATCC CCL7, Rockville, MD\EUA), com inoculo inicial de 5x103, foram mantidas em garrafas plásticas de 75cm3, contendo meio RPMI-1640 Medium (Thermo Fisher Scientific) e 5% de SFB (Gibco -Thermo Fisher Scientific). As células da linhagem RAW 264,7 de macrófagos (ATCC® TIB-71™), com inoculo inicial de 104, foram mantidas em garrafas plásticas de 75cm3, contendo DMEN HIGH (Thermo Fisher Scientific) e 10% de SFB (Gibco -Thermo Fisher Scientific). A cada 48 h ou após a formação de monocamadas confluentes, as culturas foram tratadas com solução tripsina/EDTA para obtenção de subculturas dessas células. Experimentos iniciais foram realizados para obter a curva de plaqueamento, ou seja, concentrações crescentes das duas linhagens celulares que foram plaqueadas em placas de 96 poços, a partir desses dados foi possível chegar a concentração ideal de plaqueamento para até 72h. As concentrações para formar a curva foram: 5x102, 103, 5x103, 104 e 5x104. No dia anterior aos experimentos,104 células para as duas linhagens eram plaqueadas em placas de 24 poços contendo lamínulas de vidro, 5x103 de células RAW 264,7 e 103 de células LLC-MK2 eram plaqueadas em placas de 96 poços para os experimentos de microscopia óptica e para o HTS, respectivamente. Para os experimentos de análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão, as células eram plaqueadas em garrafas plásticas de 75 cm3 ou placas de Petri estéreis.
3.5 - Preparo dos Compostos
Para esta dissertação foram utilizados os seguintes compostos: a) benzinidazol (composto utilizado para o tratamento da Doença de Chagas no Brasil); b) posaconazol (quimioterápico disponivel no mercado, utilizado para doenças fúngicas e atualmente em fase II para o tratamento de Doença de Chagas e c) compostos metalocomplexos FeHPSO4, ZnBe, Fe7HCBMPa, B10109, A11312 e B2310 sintetizados e cedidos pelo Dr. Adolfo Horn Jr. e colaboradores do Laboratório de Ciências Químicas -UENF (Figura 4). Todos os compostos foram diluídos em DMSO (dimetil sulfóxido de sódio Merck) para obtenção da solução estoque na concentração de 50mM. Para os experimentos in vitro a solução estoque foi diluída nas concentrações 0,001µM, 0,01µM, 0,1µM, 0,5µM, 1µM, 5µM, 10µM e 100µM. A concentração final de DMSO no meio nunca excedeu 0,01% (v/v). O controle foi feito com uso da maior concentração de DMSO sem a adição dos compostos. Os compostos eram mantidos estocados a -22ºC.	Comment by Emile: Thay, aqui tem que entrar a figura 4 que tem que ser dos compostos, não achei esta figura!KD?
	
Nome do composto
	
Estrutura
	
Metal
	
FeHPSO4
	
	
Ferro
	
Fe7HCBMPa
	 
	
Ferro
	
ZnBe
	
	
Zinco
	
B10109
	 
	
Cobre
	
B2310
	
	
Cobre
	
 A11312
	
	
Ferro
 
3.6 -Interação protozoário – célula hospedeira
Para chegar na proporção adequada de parasitos por células hospedeiras, experimentos com concentrações crescentes (5:1, 10:1, 50:1) de parasitos foi realizado, para a linhagem de macrófagos RAW 264,7. Pois os experimentos de HTS, foram realizados com essa linhagem, devido a suas características de desenvolvimento. Enquanto, para os experimentos de microscopia eletrônica de transmissão e microscopia óptica, utilizamos a linhagem LLC-MK2. Parasitos suspensos em meio RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) foram postos para interagir por 24 h a 37°C com células LLC-MK2, utilizando-se uma relação de 50:1 (parasito:célula). Após a interação, as células foram lavadas com PBS (solução salina de fosfato) pH7.2 para remoção de parasitas não internalizados. Em todos os experimentos, foram preparadas interações entre parasitas e células hospedeiras na ausência de quaisquer compostos (controle negativo). As drogas foram adicionadas após 24 h de interação e deixadas por até 72h para os ensaios de curvas de crescimento e obtenção do IC50 dos compostos metalocomplexos.
3.7 -Avaliação da atividade anti-proliferativa dos compostos 
3.7.1 - Microscopia óptica automatizada
Para avaliar o efeito dos compostos, células RAW 264.7 (ATCC® TIB-71™) na concentração de 5x103 células por poço foram plaqueadas em placas de 96 poços (Costar 3606) incubadas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2. Formas tripomastigotas de T.cruzi e T. dionisii em fase exponencial de crescimento foram utilizadas com inóculo inicial de 50 protozoários por célula hospedeira. As culturas, então, foram cultivadas na presença do marcador nuclear Hoeschst 33342 (Trihydrochloride, Trihydrate, 100 mg – ThermoFisher), na concentração de 1uL por 5mL em meio RPMI 1640 Media (Sigma-Aldrich) e 5% de SFB. Nessa mesma solução adicionamos outro marcador o WGA (Wheat Germ Agglutinin Conjugates, flourescein conjugate – Invitrogen), na concentração de 10µL em 10mL de meio RPMI 1640 Media (Sigma-Aldrich) e 5% de SFB. O objetivo de utilizar esses dois marcadores nos experimentos, foi devido as características preferenciais de ligação. O Hoeschst 33342 se liga as bases adenina e timina do DNA, logo o núcleo da célula se torna fluorescente. Já o WGA se liga aos açucares de membrana, presentes na forma de oligossacarídeos. Essas duas características fazem com que a célula se torne bem delimitada, e mais fácil para identificação do software. Para determinar o IC50, os protozoários foram cultivados na presença dos diferentes compostos por 24h, 48h e 72h, nas concentrações 0,001µM, 0,01µM, 0,1uM, 1µM, 10µM e 100µM. A cada 24h, foram obtidas imagens no microscópio óptico de fluorescência automatizado (In Cell -  GE Healthcare Life Sciences), na objetiva de 10x, 4 quadrantes, para posteriormente ser analisado no software específico (InCell Analyser 2000). 	Comment by Emile: Falta colocar sobre o WGA! Falta colocar as objetis utilzadas!Os quads usados!
3.7.2 - Microscopia óptica 
Células RAW 264.7 (ATCC® TIB-71™ - cedidas pelo Banco de células do Rio de Janeiro - Inmetro) na concentração 104 células por poço foram previamente plaqueadas em lamínulas redondas de 15 mm de diametro, nas placas de 24 poços para interação com tripomastigotas de T. cruzi e T. dionisii na concentração de 50 protozoários por célula hospedeira, durante 24h, 48h e 72h, incubadas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2. As culturas, então, foram cultivadas na presença de diferentes concentrações dos inibidores (0,5 µM, 1µM e 5µM). A cada 24h de interação e em contato com as drogas, as lamínulas em duplicata foram coletadas e fixadas em solução de paraformaldeído 4% em PBS, lavadas 3x em PBS, coradas com corante Giemsa 10% em água destilada, durante 15 minutos. Desidratadas em diferentes concentrações de acetona-xilol: 1) 100% acetona; 2) 100% acetona; 3) 70% acetona e 30% xilol; 4) 30% acetona e 70% de xilol; 5) 10% acetona e 90% de xilol; 6) 100% xilol. Após desidratação as lamínulas foram montadas sobre gotas de Entellan. As lâminas prontas foram observadas ao microscópio óptico Axioplan - ZEISS. O índice de proliferação foi determinado através da análise de número total de 300 células infectadas em duplicata de cada condição do experimento. Os resultados foram representativos de três experimentos diferentes, utilizando o teste t de “student” como ferramenta estatística.
3.8 - Microscopia de fluorescência
Células RAW 264.7 e LLC-MK2 foram infectados com tripomastigotas de T.cruzi e T.dionisii e após tratamento com as drogas, foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído 4 % em tampão PBS (Tampão fosfato salino). Após fixação, as lamínulas foram lavadas, permeabilizadas com solução de bloqueio BSA (Soro Albumina Bovina 3%, Saponina 0,1% em PBS, pH=8.0) por 1h, e incubadas com anticorpo LC3B (Thermo Fisher Scientific) produzido em coelho (1:400 de diluição) por 1h no escuro em temperatura ambiente. Decorrido o tempo de incubação, a interação foi lavada por cinco vezes (5 minutos cada) com a solução de bloqueio para total retirada do anticorpo não acoplado aos sitios nãoespecíficos. Logo após, as células foram incubadas por 40 minutos com anticorpo secundário aniti coelho (produzido em cbra acoplado ao fluorocromo Alexa 546 (Thermo Fisher Scientific) diluído na solução de bloqueio (1:800) Após as incubações com os anticorpos secundários, as células foram lavadas como descrito acima (com solução de bloqueio) e incubadas com DAPI (Sigma–Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) por 5 minutos (diluição de 1:1000). Após o tempo de incubação as lâminas foram montadas em lamínulas com o reagente Prolong Gold (Thermo Fisher Scientific) e observadas em microscópio Leica DMI6000B.
3.9 - Microscopia eletrônica de transmissão 
Com o objetivo de avaliar a ultraestrutura dos parasitas, na ausência e presença dos diferentes compostos nas concentrações 0,5 µM, 1µM e 5µM, experimentos para microscopia eletrônica de transmissão com diferentes tempos de interação foram preparados. A célula hospedeira cultivada na presença e na ausência de 0,01% DMSO também foi analisada. As amostras foram fixadasem solução contendo glutaraldeído 2.5% (SigmaAldrich) em tampão cacodilato de sódio 0.1 M (pH 7.2) e pformaldeído nascente 4% (Electron Microscopy Science - EMS), pH 7.4 por no mínimo 4 horas a temperatura ambiente. O material foi então lavado em cacodilato de sódio 0.1M pH 7.2, pós-fixado em tetróxido de ósmio 1%, ferrocianeto de potássio 1,25% e cloreto de cálcio 5mM no mesmo tampão (50 minutos). Logo após, o material foi desidratado com séries crescentes de acetona (30% a 100%) seguida de infiltração em resina epóxi, na proporção de 2 partes de acetona para 1 de resina (6 horas); 1:1 acetona/resina por (6 horas), 1:2 acetona/resina por (6 horas), resina pura por (12 horas) e, após este período o material foi posto para polimerizar (48 horas/60⁰C). Os blocos foram trimados, cortados (cortes de 60 nm de espessura) e contrastados com 5% de acetato de uranila 5% em água (40 minutos) e citrato de chumbo (5 minutos). Após secarem, as grades foram observadas em Microscópio Eletrônico de Transmissão FEI SPIRIT (120Kv). 
4.0 Análise da citoxicidade in vitro
 O limiar de citoxicidade dos compostos foi avaliado sobre culturas de células de RAW 264.7 e LLC-MK2 com concentrações crescentes de cada composto, seguido pela análise da viabilidade por PI (Iodeto de proprídio - Sigma–Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) e Hoescht 33342 (Trihydrochloride, Trihydrate, 100 mg – ThermoFisher). Além de ensaios por MTT (Teste de citotoxicidade pelo método direto). Os controles foram realizados pela adição do veículo de cada droga, no caso DMSO. 	Comment by Emile: Quad usados? Objetivas? Coloquei embaixo e reduzi essa parte.
4.1 PI (Iodeto de proprídio - Sigma–Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 	Comment by Emile: Este não é a mesma coisa que em cima?
Para avaliar o efeito dos compostos na viabilidade das células RAW 264.7 e LLC-MK2, as mesmas foram plaqueadas em placas de 96 poços incubadas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2, na concentração de 5x103 células por poço, com concentrações crescentes de cada composto (0,5 µM, 1µM e 10µM). Para os ensaios, foram utilizados os marcadores Hoescht 33342 (Trihydrochloride, Trihydrate, 100 mg – ThermoFisher), incubado durante o plaqueamento e PI (Iodeto de proprídio - Sigma–Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), incubado após 48h de experimento (5µl por poço – durante 15 minutos no escuro). As imagens deste ensaio foram obtidas no microscópio óptico de fluorescência automatizado (In Cell -  GE Healthcare Life Sciences), através da objetiva de 10x e 9 quadrantes por poço, para posteriormente ser analisado no software específico (InCell Analyser 2000).
4.2 Teste de citotoxicidade pelo método direto (MTT M5655 - Sigma–Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)
	Para avaliar o efeito dos compostos na viabilidade das células hospedeiras RAW 264,7 e LLC-MK2, na concentração de 5x103 células por poço e 103, respectivamente, foram plaqueadas em placas de 96 poços incubadas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2, com concentrações crescentes de cada composto (0,5 µM, 1µM e 5µM). Após 48h, foi adicionado a solução MTT (5mg/ml em PBS) em todos os poços, mesmo aqueles que não possuíam células. Durante 4 h as células foram incubadas a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2. Posteriormente, foi adicionado 150ul por poço de solvente MTT (1:1 de DMSO em isopropanol), a placa coberta com papel alumínio foi levada para o agitador orbital por 15 minutos. A leitura foi realizada na absorbância de 590nm com filtro de referência de x = 620 nm, espectrofotômetro TECAM (Infinite® 200 PRO series). 
5.0 Análise estatística
 Os valores de IC50 nos testes in vitro foram obtidos através da análise de curva padrão utilizando o programa Sigma Plot 10.0. Para os testes de significância será usado o software Graph Pad Prism 5.0. Na parte da validação, foi utilizado o software Microsoft Excel® 2010, para verificar se houve diferença estatística significativa entre a contagem manual realizada por três operadores diferentes da mesma lamínula, que posteriormente foi comparada estatisticamente com a contagem automatizada. A partir do cálculo do t-Student entre amostras pareadas, com distribuição bicaudal a um nível de significância (α) = 95% e grau de liberdade (gl) = 2, cujo t-crítico na tabela t-Student é de 4,903.
onde:
x = média das contagens de uma lamínula;
Ho: µ=0 e HA: µ≠0
s = desvio-padrão amostral da amostra;
n = número de amostras.
A hipótese (H0) formulada para a aplicação da análise estatística foi:
H0: as contagens da mesma lamínula realizada por três operadores diferentes são iguais.
5. Resultados
5.1- Determinação do número de células 
 	Com o intuito de garantir que a confluência celular presente na área a ser imageada permita a quantificação precisa pelo software de análise, em todos os tempos do experimento (24 horas à 72 horas de interação), é essencial determinarmos o número de células máximo que pode ser detectado no decorrer do tempo. Neste trabalho utilizamos dois modelos celulares, LLCMK2 e RAW 264.7. A linhagem LLCMK2 é uma linhagem de tecido epitelial de rim de macaco (Macaca mulata – ATCC), muito usada na literatura para interação com patógenos intracelulares obrigatórios. A linhagem RAW 264.7 é uma linhagem macrofágica, originada do tecido muscular de camundongo (BALB-C). As principais diferenças relacionadas entre estes tipos celulares estão relacionadas a área celular (a área da linhagem LLC-MK2 é maior do que a área da linhagem RAW264.7) e a capacidade de formar uma monocamada (por ser uma linhagem macrofágica, a RAW264.7 não forma monocamada). Os dois modelos foram testados utilizando número crescente de células por poço (5x102, 103, 5x103, 104 e 5x104) assim como diferentes tempos pós plaqueamento (até 72horas). Para que as imagens fossem capturadas pelo sistema de aquisição do Incell 2000 e pudessem ser analizadas pelos programas de análise foi necessário incubar as células com um intercalante de DNA, permeável a membrana celular e que não impede o ciclo celular (Hoescht 33342). Após o plaqueamento e incubação com Hoescht 33342, os poços foram imageados no aparelho Incell 2000 utilizando objetiva 20 vezes de aumento (Objetiva Nikon, 20x, N.A=0.45, ELWD – Corr Collar 0-2.0, Plan Fluor). Pudemos observar, após 72 horas de plaqueamento, que para células da linhagem RAW264.7 a concentração de 5x103 células por poço foi a que apresentou a melhor relação entre área do campo ocupada e a menor diferença em relação ao número de células quando comparamos a contagem manual (utilizando a ferramenta de contagem celular do programa ImageJ) e a contagem automatizada (utilizando o programa Incell Analyzer). Neste caso, o programa Incell Analyzer foi capaz de quantificar 94% das células quantificadas através da contagem manual. Nas demais concentrações utilizadas a contagem automatizada foi capaz de quantificar 93% (5x102), 93,89% (103), 54% (104) e 52% (5x104). Já no caso da linhagem LLCMK2, a melhor concentração observada foi nos poços onde foram plaqueadas 103 células. Neste caso, embora tenhamos obtido somente cerca de 40% de confluência na área observamos que 97,35% das células quantificadas manualmente puderam também ser quantificadas através da contagem automatizada. Nas demais concentrações obtivemos 97,02%(5x102), 92,22% (5x103), 84,33% (104) e 75,53 (5x104). A quantificação do número de células por campo expressos nas tabelas 1 e 2 são referentes a quantificação em um campo imageado. A média e desvio padrão obtido na contagem manual (através do software ImageJ) foram expressos a partir da contagem da mesma imagem por três operadores diferentes. Para que a contagem manual pudesse ser utilizada como referência para a automatizada, foi necessário realizar o teste de hipóteses seguido do teste t Student.A hipótese utilizada como nula foi a de que a contagem da mesma imagem por diferentes operadores treinados seria a mesma. Para um nível de significância (α) de 95% e graus de liberdade (gl) igual 2 em um n=3. Após realização dos testes (como demonstradona seção de material e métodos) observamos que o T calculado foi maior que o T crítico (4,903) em todos os casos. Deste modo, a hipótese nula é rejeitada e o método é significativo (Tabela 3). Todos os campos imageados mantiveram a mesma relação entre a contagem manual e automatizada. Com isto, definimos o parâmetro de EXATIDÃO proposto para este método.
Na figura X podemos observar claramente a confluência quando um número crescente de células (em ambas linhagens) foi utilizado. As imagens utilizadas para quantificação foram as representadas nesta figura.
Em relação a quantificação automatizada (realizada pelo software InCell Analyzer) não foi possível realizar os testes estatísticos pois não há desvio padrão independente do operador ou do número de vezes que a contagem for executada. Quando comparamos a contagem manual com a contagem automatizada nas imagens obtidas de poços onde foram plaqueadas 103 células (LLCMK2) ou 5x103 células (RAW264.7) não observamos diferença significativa entre os resultados. A partir deste número de células plaqueados a contagem obtida através do método manual (referência) torna-se muito distinta da obtida pelo método automatizado. Portanto, 103 células LLCMK2 e 5x103 células RAW264.7 passam a ser definidos como o MÁXIMO DE QUANTIFICAÇÃO do método. 
Tabela 1: RAW264.7 - Contagem Manual do número de células X Contagem automatizada do número de células X Área do Campo Ocupada por células após 72 horas de plaqueamento
	Número de Células Plaqueadas
	Contagem Manual (Image J)/Campo
	Contagem Automatizada (InCell Analyzer)/Campo
	Área do Campo Ocupada (%)
	5x102
	81±1
	76
	28%
	103
	305±2
	288
	43,73%
	5x103
	431±1
	255
	58,93%
	104
	330±0.57
	180
	59%
	5x104
	310±1.73
	197
	53%
Tabela 2: LLCMK2 - Contagem Manual do número de células X Contagem automatizada do número de células X Área do Campo Ocupada por células após 72 horas de plaqueamento
	Número de Células Plaqueadas
	Contagem Manual (Image J)/Campo
	Contagem Automatizada (InCell Analyzer)/Campo
	Área do Campo Ocupada (%)
	5x102
	100±0.57
	98
	38%
	103
	188±1
	184
	40%
	5x103
	489±1,15
	451
	66%
	104
	830±2
	700
	66,4%
	5x104
	940±1,52
	710
	73%
Tabela 3: T calculado para a contagem manual executada por três operadores distintos
	Número de Células/poço
	T calc - RAW264.7
	T calc - LLCMK2
	5x102
	142,1
	312.5
	103
	265
	329
	5x103
	756
	740
	104
	1031
	721
	5x104
	310
	1080
Figura XXX: Micrografias ópticas de fluorescência de diferentes concentrações de plaqueamento das linhagens celulares RAW 264.7 e LLCMK2 após 72 horas. 5x102, 103, 5x103, 104e 5x104 células foram plaqueadas em placas de 96 poços e os núcleos foram marcados com 0.1µg/mL de Hoescht 33342. Após 72 horas foram feitas imagens dos poços com diferentes concentrações de células utilizando objetiva de 20X de magnificação. As imagens foram segmentadas utilizando p software In Cell Analyzer Barra=100µm. 
5.2 - Determinação da Relação Parasito x Célula Hospedeira 
Após determinar o número ótimo de células que deve ser plaqueada para se obter a melhor relação entre área ocupada e quantificação celular, decidimos obter a melhor relação entre o número de células hospedeiras e o número de protozoários utilizados na interação. Esta observação é essencial para que a quantificação realizada através do software reproduza a quantificação feita através da contagem manual. Neste trabalho utilizamos como modelo dois protozoários: o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, e o Trypanosoma dionisii, tripanosomatídeo filogeneticamente semelhante que vem sendo preconizado como modelo não patogênico para estudo de quimioterápicos contra Doença de Chagas. Para obter melhor relação parasito-célula hospedeira utilizamos o número de 5x103 células RAW 264.7 por poço e as colocamos para interagir com uma relação de cinco, dez ou cinquenta parasitos para cada célula hospedeira. Pudemos observar que a relação de 50 parasitos para cada célula hospedeira foi a proporção onde obtivemos uma infecção mais homogênea (um maior número de células contendo parasitos por campo - Figura Y). Em relação a comparação entre a contagem manual e a automatizada não houve diferença significativa quando comparado com as proporções de 5 parasitos para cada célula hospedeira ou 10 parasitos para cada célula hospedeira (Tabela 4 e 5). Esta proporção ótima foi independente do protozoário utilizado, embora a infecção com T. cruzi seja maior (maior número de protozoários quantificados por campo) quando comparado com T. dionisii. A quantificação do número de parasitos por campo expressos nas tabelas 3 e 4 são referentes a quantificação em um campo imageado. Todos os campos imageados mantiveram a mesma relação entre a contagem manual e automatizada.
. 
Figura Y: Micrografias ópticas de fluorescência segmentadas da interação da célula RAW264.7 com diferentes proporções de infecção. 5x102células RAW264.7 e foram plaqueadas em placas de 96 poços e postas para interagir com uma proporção de 5:1, 10:1 ou 50: 1 parasitos para cada célula hospedeira. Após 24 horas de infecção, os núcleos foram marcados com 0.1µg/mL de Hoescht 3342. Após 72 horas foram feitas imagens dos poços com diferentes concentrações de células utilizando objetiva de 20X de magnificação e em seguida as imagens obtidas foram analisadas a partir do programa InCell Analyser. Barra=100µm. 
Tabela 4: Contagem Manual do número de T. cruzi X Contagem automatizada do número de protozoários após 72 horas de interacão
	Relação T. cruzi - célula hospedeira/campo
	Contagem Manual (ImageJ)
	Contagem Automatizada (InCell Analyzer)
	5:1
	70
	68
	10:1
	124
	120
	50:1
	260
	255
Tabela 5: Contagem Manual do número de T. dionisii X Contagem automatizada do número de protozoários após 72 horas de interacão
	Relação T. dionisii- célula hospedeira/campo
	Contagem Manual (ImageJ)
	Contagem Automatizada (InCell Analyzer)
	 5:1
	 41 
	 43
	 10:1
	 98
	 97
	 50:1 
	 203
	 198
5.3 - Análise do Efeito Antiproliferativo gerado pelo tratamento com Benznidazol ou Posaconazol em amastigotas intracelulares de T. cruzi e T.dionisii
 	Após a determinação do número de células hospedeiras e da obtenção da melhor relação entre estas e o os protozoários, iniciamos a ánálise do efeito antiproliferativo gerado pelo benznidazol ou posaconazol em amastigotas intracelulares de T. cruzi e de T. dionisii. O intuito principal desta análise foi investigar se o protozoário não patogênico (Trypanosoma dionisii) poderia servir de modelo para o "screening" inicial de novos compostos quimioterápicos para doença de Chagas. Como o benznidazol é atualmente a única droga disponível no Brasil para o tratamento da fase aguda da doença (não há tratamento para fase crônica), o utilizamos para este fim. Já o posaconazol foi escolhido para este experimento por ser uma droga já comercializada para o tratamento de doenças fúngicas e por ser descrito na literatura como um potencial quimioterápico para o tratamento da doença de Chagas na fase aguda e crônica (Veiga-Santos et al, 2012). Com isto, após decorrida a infeção das células RAW264.7 com 50 parasitos para cada célula hospedeira (T. cruzi ou T. dionisii) a interação foi tratada com concentrações crescentes de benznidazol (10 µM-300 µM) ou com concentrações crescentes de posaconazol (0,1nM-10nM). Na figura Z (B e C) podemos observar que a porcentagem de infecção diminui a medida que aumentamos a concentração de benznidazol (figura Z-B) ou de posaconazol (figura Z-C) nos tempos analizados. Quando o tratamento foi realizado com células infectadas com T. cruzi pudemos observar uma inibição significativa a partir de 100µM (24 horas de tratamento)enquanto em células infectadas com T. dionisii a redução pode ser observada a partir da concentração de 50 µM . Após 72 horas de tratamento pode-se obter uma IC50 de 195 µM para infecção de T. cruzi enquanto obtivemos uma IC50 de 130 µM para T. dionisii. A figura Z- A apresenta um conjunto de imagens segmentadas após 72 horas de tratamento com benznidazol de células RAW264.7 infectadas com T. dionisii. Nesta imagem representativa podemos observar claramente um decréscimo no número de amastigotas intracelulares a medida que aumentamos a concentração do composto utilizado. Quando células infectadas com T. cruzi ou T. dionisii foram tratadas com concentrações crescentes de posaconazol pudemos observar uma redução significativa a partir de 0,5nM em células infectadas com T. cruzi (Figura W-B) e a partir de 0,1nM em células infectadas com T. dionisii (Figura W-C) após 24 horas de tratamento. Após 72 horas de tratamento com posaconazol, o IC50 foi de 0,25 nM para T. dionisii e 1 nM para T. cruzi. A figura W-A apresenta uma imagem representativa de células infectadas com T. cruzi e com T. dionisii após 72 horas de tratamento. Nesta, podemos observar a diferença do número de parasitos nas células controle e nas tratadas com a IC50 de posaconazol. 
Figura W: O tratamento de macrófagos infectados com amastigotas de T. cruzi ou T. dionisii com benznidazol e posaconazol inibe a multiplicação de amastigotas em diferentes concentrações dependendo das espécies de A: imagens representativas segmentadas da infecção com T. dionisii tratados com BZN em diferentes concentrações. O fármaco foi adicionado nas culturas de macrófagos após 24 h de interacção, quando a maior parte das células foram infectadas. Todos os dias, os índices de associação foram determinados (número médio de parasitas internalizados multiplicado pela percentagem de macrófagos infectados dividida pelo número total de macrófagos). Os resultados são expressos como a média de três experiências independentes.
FiguraX: O tratamento de macrófagos infectados com amastigotas de T. cruzi ou T. dionisii com benznidazol e posaconazol inibe a multiplicação de amastigotas em diferentes concentrações dependendo das espécies de A: imagens representativas segmentadas da infecção com T. dionisii tratados com BZN em diferentes concentrações. O fármaco foi adicionado nas culturas de macrófagos após 24 h de interacção, quando a maior parte das células foram infectadas. Todos os dias, os índices de associação foram determinados (número médio de parasitas internalizados multiplicado pela percentagem de macrófagos infectados dividida pelo número total de macrófagos). Os resultados são expressos como a média de três experiências independentes.
5.4 - Análise ultraestrutural de amastigotas de T. dionisii tratados com posaconazol 
	A análise ultraestrutural têm sido utilizada na literatura para identificar possíveis alvos intracelulares após o tratamento com compostos quimioterápicos. Em relação ao tratamento com posaconazol, já havia sido demonstrado anteriormente as alteraçoes ultraestruturais nos amastigotas intracelulares de T. cruzi (VEIGA-SANTOS ET AL, 2012). Com o intuito de verificar se as alterações ultraestruturais geradas pelo tratamento em T. dionisii eram semelhantes às observadas em amastigotas intracelulares de T. cruzi, após o tratamento com a IC50 de posaconazol, fixamos a interação e processamos para microscopia eletrônica de transmissão. Após o tratamento com 1 nM de posaconazol por 48 horas pudemos observar uma alteração drástica no complexo de Golgi, isto é, observamos uma desorganização das cisternas que passaram a apresentar espaços dilatados e vazios (FiguraH-B). Também pode-se observar a presença de estruturas semelhantes a vacúolos autofágicos, indicando que este tipo de morte (autofagia) pode estar sendo disparado pelo tratamento com posaconazol. Após 72 horas de tratamento ainda era possível observar a presença de vesículas internas no interior do parasito (Figura H-D), assim como também foi possível se observar alterações no cinetoplasto (Figuras 5C e D) como o desprendimento de membrana (Fig.5C). Não pudemos observar nenhuma modificação ultraestrutural na célula hospedeira, indicando que a concentração utilizada inibir 50% do crescimento do parasito não seria tóxico para a célula de mamífero. 
5.5 - Morte celular por autofagia em amastigotas intracelulares previamente tratados com posaconazol
 	Visto que a análise da ultraestrutura de amastigotas tratados com posoconazol indicava a formação de vacúolos semelhantes a vacúolos autofágicos, prosseguimos com caracterização molecular destas estruturas. A via de autofagia é uma via intracelular principal para a degradação e reciclagem de proteínas de longa duração e organelas inteiras (KLIONSKY ET AL., 2000). Um dos principais marcadores moleculares de vacúolos autofágicos é o conjunto de proteínas conhecidos como LC3s (Map Associated Proteins 1-LC3s). Esse conjunto de proteínas é formado por três membros (LC3A, LC3B e LC3C) sendo que cada membro pode apresentar mais de uma proteína variante. Dentre esta proteínas, a LC3B é a proteína que é recrutada para o vacúolo autofágico em etapas iniciais de formação (KOUKORAKIS ET AL., 2015). Para ratificar a formação de vacúolos autofágicos no interior dos amastigotas, células infectadas com T. dionisii e tratadas com a IC50 de posaconazol foram incubadas com um anticorpo contra a proteína LC3B e observadas em microscópio de imunofluorescência. Aproximadamente 30% dos macrófagos infectados com amastigotas apresentaram-se fortemente marcados após tratamento com o posaconazol. Nenhuma marcação foi observada em amastigotas não tratados, sugerindo que o tratamento com posaconazol é capaz de induzir autofagia (Figura 6A,B e C), conforme relatado anteriormente para T. cruzi (VEIGA-SANTOS ET AL., 2012).
FiguraXXX
FiguraXXXX: Micrografias eletrônicas de transmissão de amastigotas intracelulares tratados com IC50 de posaconazol. (A) Os amastigotos não tratados dentro dos macrófagos peritoneais apresentam morfologia. N, núcleo; K, cinetoplast; F, flagelo; G, Golgi). (B) Depois 48 horas de tratamento com posaconazol, aparecem estruturas autofágicas (seta) e lamelas dilatadas do complexo de Golgi (asteriscos) de amastigotas (C-D) Tratamento de amastigotas intracelulares por 72 horas levou a alterações no cinetoplasto (k), e ao desprendimento de membrana (seta), além da presença de vesículas internas (ponta de seta).
FiguraXXX: Microscopia de imunofluorescência de amastigotas marcadas com anticorpos contra LC3B (Cadeia leve 3 de proteína associada a microtúbulos), um marcador de morte celular autofágica (vermelho), e Hoechst, um marcador nuclear (azul). A-C representam células sem tratamento e D-E representam células tratadas com a IC50 de posaconazol. Barra=10 µm.
5.6 - Análise de Efeitos Antiproliferativos após tratamento com compostos metálicos
Para observar o possível efeito antiproliferativo gerado pelos compostos metálicos FeHPSO4, B10109, A11312, Fe7HCBMPa, ZnBe, B2310 feito uma curva dose resposta com concentrações crescentes (1nM-100µM) por 24, 48 e 72 horas de tratamento que tanto para amastigotas intracelulares de T. cruzi (Figura1A) quanto para amastigotas de T. dionisii (Figura 2B). Independente do parasito utilizado foi feito um controle utilizando a maior concentração do solvente utilizado para a diluição dos compostos metálicos, assim como um controle positivo. Para controle positivo utilizamos a droga de escolha para o tratamento da doença de Chagas. Dos seis compostos testados, quatro apresentaram efeitos significativos a partir da concentração 1µM: Fe7HCBMPa, ZnBe, B10109 e FeHPSO4. Dentre estes as interações tratadas com os compostos ZnBe e FeHPSO4 apresentaram uma inibição de proliferação de aproximadamente 50% após 48 horas de tratamento (1-10µM). Cabe ressaltar que não houve diferença entre os tratamentos