PCR em tempo real aplicação

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Universidade de Aveiro 
2010 
Departamento de Biologia 
Tânia Maria dos 
Santos Oliveira 
 
 
PCR em tempo real: métodos e aplicações 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
o júri 
 
Presidente Prof. Doutor António José Arsénia Nogueira 
Professor Associado com Agregação do Departamento de Biologia da 
Universidade 
de Aveiro 
 
 
Arguente Principal Prof. Doutor Francisco Manuel Andrade Corte Real Gonçalves 
Professor Associado com Agregação da Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra 
 
 
Orientador Prof. Doutor Luís Manuel Souto de Miranda 
Professor Auxiliar Convidado do Departamento de Biologia da Universidade de 
Aveiro 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimentos 
 
O desenvolvimento deste trabalho trouxe-me mais-valias pessoais e 
profissionais incontornáveis e marcantes. Sem a colaboração e disponibilidade 
de diversas pessoas e entidades tal não seria possível. 
Um agradecimento ao Professor Luís Souto pelo tempo disponibilizado e 
exigência com que orientou este trabalho e transmissão de conhecimentos. 
Agradeço também à Mestre Helena Moreira pelo incentivo que me deu ao 
longo da elaboração da minha tese. 
Agradeço à Dr.ª Paula Magalhães do IBMC, à Dr.ª Vera do Laboratório de 
Biologia Molecular do Serviço de Sangue do HUC, à Dr.ª Paula do Laboratório 
de Hematologia do Hospital dos Covões, à Mestre Patrícia Pereira do 
Laboratório de Biologia do RNA da Universidade de Aveiro e à Dr.ª Célia 
Nogueira do Instituto de Microbiologia da Faculdade de Medicina. A todas 
estas pessoas agradeço a sua disponibilidade para me receberem nos 
respectivos laboratórios dotados de equipamentos de PCR em tempo real, 
com o intuito de me esclarecerem dúvidas e de me auxiliarem a aprofundar e 
conciliar conhecimentos na matéria. Aos meus colegas de trabalho, que me 
ajudaram a conciliar os horários de forma a poder ter tempo para a realização 
da minha tese. 
Aos meus pais e avós agradeço todo o carinho, paciência e apoio 
incondicional não só ao longo da elaboração deste trabalho, mas ao longo de 
todo o meu percurso. 
Finalmente, ao meu namorado agradeço e guardo, acima de tudo, o empenho 
com que me incentivou a desenvolver este trabalho, a paciência com que 
aceitou a minha indisponibilidade, e a forma com que sempre me ajudou a 
ultrapassar todas as dificuldades que foram surgindo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
palavras-chave 
 
PCR em Tempo Real; vantagens; equipamentos; aplicações. 
Resumo 
 
 
A reacção em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica fundamental nos 
laboratórios actuais, que revolucionou a detecção de RNA e DNA. 
Recentemente, uma nova técnica designada PCR em tempo real, evoluiu da 
técnica de PCR convencional, com o objectivo de minimizar as suas 
numerosas limitações. Esta técnica, também conhecida como PCR 
Quantitativa ou PCR em tempo real Quantitativa é um método de quantificação 
e amplificação simultânea do DNA. A PCR em tempo real é baseada na 
detecção e quantificação de um composto fluorescente (durante as primeiras 
fases da PCR), assentando num princípio básico de que o aumento 
significativo da quantidade de produto da PCR está correlacionado com a 
quantidade inicial do controle. 
A PCR em tempo real apresenta inúmeras vantagens relativamente à PCR 
tradicional. A recolha de dados ocorre durante a fase exponencial de 
crescimento da PCR, sendo por tal uma análise rápida e simples. Trata-se de 
uma técnica sem influência da amplificação não específica, podendo a 
amplificação ser controlada em tempo real. O risco de contaminação é baixo 
devido à ausência de processamento pós-PCR dos produtos resultantes. Além 
do mais, esta técnica requer apenas 3 picogramas de material, o que é cerca 
de 1000 vezes menos material genético face a ensaios convencionais. 
Finalmente, é uma técnica mais específica, sensível e reprodutível. No 
entanto, a PCR em tempo real apresenta algumas desvantagens 
designadamente, o elevado custo do equipamento e as elevadas exigências 
técnicas e científicas requeridas para o correcto manuseamento e manutenção 
do equipamento. 
A técnica da PCR em tempo real pode ser aplicada tanto em utilizações mais 
tradicionais da PCR como em novas aplicações às quais a PCR convencional 
responde de forma pouco ou menos eficaz, em áreas tão diversas como, 
saúde, forense e agricultura. As principais aplicações estão relacionadas com 
a quantificação da expressão génica, controle de qualidade e validação de 
ensaios, quantificação viral, detecção de agentes patogénicos, toxicologia 
forense quantificação de danos no DNA, genotipagem, determinação pré-natal 
do sexo de células, dosagem génica, oncologia clínica, quantificação de 
proteínas, microbiologia, análise e quantificação de DNA mitocondrial e de 
DNA nuclear, qualidade do DNA, estudo da presença de níveis de OGM nos 
alimentos, certificação, entre muitas outras aplicações possíveis. 
O principal objectivo desta tese de Mestrado visou apresentar o estado da arte 
da técnica da PCR em tempo real, nomeadamente, descrição da técnica, 
comparação com a PCR convencional, apresentação das vantagens e 
desvantagens, caracterização e análise das plataformas implantadas no 
mercado e análise e discussão detalhada de aplicações reais e potenciais. 
 
 
 
Renato e Thaiana
Realce
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Keywords 
 
Real-Time PCR; advantages; equipments; applications. 
 
Abstract 
 
The polymerase chain reaction (PCR) is a key technique in worldwide 
laboratories, which revolutionized the detection of RNA and DNA. Recently, a 
new technique, named Real-Time PCR, emerged from the traditional PCR, 
aiming to remove many of the limitations of standard end-point PCR. This 
technique, also known as Quantitative PCR, Real-Time Quantitative PCR, or 
RTQ-PCR is a method of simultaneous DNA quantify and amplification. 
The Real-Time PCR is based on the detection and quantitation of a fluorescent 
reporter (during the early phases of the PCR), being the first significant 
increase in the amount of PCR product (threshold cycle) correlated to the initial 
amount of target template. 
Real-Time PCR provides distinct advantages over traditional PCR detection. 
The data collection occurs during the exponential growth phase of PCR, being 
a quick and simple procedure. That is not influenced by non-specific 
amplification and the amplification can be monitored in real-time. The 
contamination risk is low due to the absence of post-PCR processing of 
products. Furthermore, this technique only requires 3 picogram of material 
which is 1000-fold less sample comparing to the conventional assays. Finally, it 
is most specific, sensitive and reproducible technique. However, Real-Time 
PCR present some disadvantages, namely the high equipment cost, the setting 
up requires high technical skill and support and is not ideal for multiplexing. 
Real-Time PCR can be applied to traditional PCR purposes as well as new 
applications that would have been less effective with traditional PCR, in several 
areas such as health, forensics and agriculture. Some applications are related 
to quantitation of gene expression, array verification, quality control and assay 
validation, viral quantitation, forensics toxicology, pathogen detection, DNA 
damage measurement, genotyping, among others. 
The main goal of this Master thesis is describe the state of the art of the Real-
Time PCR, namely, showing a overview of the technique and its procedure and 
comparing with the conventional PCR technique, presenting their advantages 
and disadvantages, characterizing and analysing the main platforms used in 
the nationaland international market and analysing and discussing potential 
and real applications. 
 
Índice 
Resumo 
Abstract 
Índice 
Lista de Tabelas 
Lista de Figuras 
Lista de Siglas 
 
Plano Geral da Dissertação ............................................................................................... 13 
Objectivos ........................................................................................................................... 13 
Introdução .......................................................................................................................... 14 
1. PCR convencional .......................................................................................................... 15 
1.1. Contextualização histórica ................................................................................ 15 
 1.2. Princípios da técnica ....................................................................................... 18 
 1.3. Detecção do produto da PCR .......................................................................... 24 
 1.4. Aplicações da PCR ......................................................................................... 27 
 1.5. Variantes da PCR ............................................................................................ 28 
2. PCR em tempo real........................................................................................................ 30 
2.1. Contextualização histórica ................................................................................ 30 
 2.2. Princípios da técnica ....................................................................................... 30 
 2.3. Tecnologias e métodos de detecção ................................................................ 33 
 2.4. Análise dos resultados obtidos ........................................................................ 44 
 2.5. Quantificação dos resultados da qPCR ........................................................... 47 
 2.6. Tempo dispendido numa análise qPCR .......................................................... 48 
3. PCR convencional vs PCR em tempo real................................................................... 49 
3.1. Vantagens e Limitações da técnica de PCR convencional ............................... 49 
 3.2. Vantagens e Limitações da técnica de PCR em tempo real ............................ 49 
 4. Equipamentos da PCR em tempo real ........................................................................ 51 
4.1. Principais plataformas ...................................................................................... 51 
 4.2. Discussão crítica dos equipamentos ................................................................ 53 
5. Aplicações da PCR em tempo real ............................................................................... 56 
5.1. Aplicações na área da saúde ............................................................................. 56 
 5.2. Aplicações na área forense ................................................................................ 67 
5.3. Aplicações na área da agricultura/indústrias agro-alimentares ........................ 74 
Conclusões .......................................................................................................................... 77 
Bibliografia ......................................................................................................................... 79 
Webgrafia ........................................................................................................................... 86 
Anexos ................................................................................................................................. 87 
Lista de Tabelas 
 
Tabela 1 - Componentes envolvidos no processo de clonagem 
Tabela 2 - Distinção entre géis de agarose e de poliacrilamida 
Tabela 3 - Variantes da técnica de PCR convencional 
Tabela 4 - Características distintivas entre as sondas de sequência específica e os corantes 
intercalantes 
Lista de Figuras 
 
Figura 1 - Desenho esquemático de uma experiência típica de clonagem 
Figura 2 - Figura esquemática de um ciclo da técnica da PCR 
Figura 3- Amplificação exponencial do gene na PCR 
Figura 4 – Desenho esquemático da actividade da Taq DNA polimerase 
Figura 5 (a) - Representação da molécula dATP utilizado na PCR 
Figura 5 (b) - Representação da molécula dTTP utilizado na PCR 
Figura 5 (c) - Representação da molécula dGTP utilizado na PCR 
Figura 5 (d) - Representação da molécula dCTP utilizado na PCR 
Figura 6 - Aparelho de electroforese em gel 
Figura 7 - Visualização do produto da PCR em gel de agarose 
Figura 8 - Gel de poliacrilamida 
Figura 9 - Clonagem de um gene recorrendo a um plasmídeo 
Figura 10 - Representação gráfica das fases da PCR em tempo real 
Figura 11 - Representação gráfica dos resultados da amplificação em tempo real em função 
de diferentes teores de moléculas de DNA iniciais 
Figura 12 (A) - Representação da molécula SYBR® Green intercalada na dupla cadeia de 
DNA 
Figura 12 (B) - Método de funcionamento da molécula 
Figura 13- Curvas de Tm para cada um dos corantes (LCGreen® Plus e SYBR® Green) 
Figura 14- Curvas de melting dos corantes SYBR® Green e LCGreen® Plus 
Figura 15- Cinética dos corantes SYBR® Green e EvaGreen® 
Figura 16- Representação esquemática da sobreposição espectral do quencher (molécula 
receptora) e repórter (molécula dadora) 
Figura 17- Representação de um oligonucleótido com estrutura terciária tipo hairpin-loop 
utilizado como molecular beacons 
Figura 18 – Representação esquemática da estrutura e modo de funcionamento das 
oligosondas primer „Sunrise‟ e „Scorpion‟ 
Figura 19 - Hibridação das sondas TaqMan® 
Figura 20 – Hidrólise das sondas TaqMan® 
Figura 21 - Representação do método de acção da sonda FRET 
Figura 22 - Curva HRM 
Figura 23 - Representação gráfica da curva padrão determinada após sucessivas análises de 
amostras com concentração conhecida de DNA 
Figura 24 - Mecanismo de metilação do DNA 
Lista de Siglas 
 
A - Adenina 
ABI – Applied Biosystems 
C – Citosina 
CT – Cycle threshold - Limiar da fase exponencial 
dATP – Desoxiadenosina trifosfato 
dCTP – Desoxicitosina trifosfato 
dGTP- Desoxiguanosina trifosfato 
DNA – Deoxyribonucleic acid - Ácido desoxirribonucleico 
dNTP´s - Desoxirribonucleótidos trifosfatados 
dTTP – Desoxitimidina trifosfato 
FRET – Fluorescence ressonance energy transfer - Transferência de energia de 
fluorescência 
G- Guanina 
HRM – High resolution melting - Dissociação de alta resolução 
MDA – Multiple displacement amplification 
mRNA – RNA mensageiro 
pb – Pares de bases 
PCR- Polymerase chain reaction - Reacção em cadeia da polimerase 
qPCR/RTQ-PCR – PCR em tempo real 
RNA – Ribonucleic acid- Ácido ribonucleico 
SNP – Single nucleotide polymorphism- Polimorfismo num nucleótido único 
STR´s - Short tandem repeats 
T- Timina 
TAE – Tris-acetato-EDTA 
Taq - Thermus aquaticus 
TBE – Tris-borato-EDTA 
TEMED – Tetramethylethylenediamine - Tetrametiletilenodiamina 
Tm- Temperatura de melting 
UV – Radiação ultravioleta 
 
Plano Geral da Dissertação 
 
 O estudo apresentado nesta tese intitula-se “PCR em tempo real: métodos e 
aplicações” e por tal, visa apresentar o estado da arte relativamente à técnica da PCR em 
tempo real. A presente dissertação está estruturada em 5 capítulos. No primeiro capítulo 
será abordada a técnica da PCR convencional, que serve de base à técnica da PCR em 
tempo real, descrevendo-se os princípios da técnica,discutindo-se vantagens e 
desvantagens da mesma e apresentando-se diversas variantes da técnica. O segundo 
capítulo corresponde a uma revisão da literatura relativamente à técnica da PCR em tempo 
real. Apresentar-se-á uma resenha histórica, os fundamentos da técnica, os procedimentos 
principais (métodos químicos de fluorescência, sondas e corantes). O terceiro capítulo está 
reservado à comparação das técnicas da PCR convencional e PCR em tempo real e 
discussão das suas vantagens e desvantagens. As plataformas/equipamentos disponíveis no 
mercado são apresentadas e discutidas no quarto capítulo. O quinto capítulo diz respeito à 
apresentação e discussão das principais aplicações da técnica, sendo analisadas 
detalhadamente diversos estudos publicados recentemente em revistas científicas. O 
presente trabalho é encerrado com as principais conclusões. 
 
Objectivos 
 
 Os principais objectivos que acompanharam a concretização desta dissertação 
foram de uma forma geral, apresentar o estado da arte da técnica da PCR em tempo real, e 
em particular, conhecer os princípios da técnica, procedimentos, equipamentos e 
aplicações, identificar e compreender as situações em que a técnica é mais aplicável e 
distinguir correctamente a técnica PCR em tempo real da técnica PCR convencional e 
demais técnicas derivadas desta. 
 
 
 
 
 
Introdução 
 
 O século XX foi marcado por diversas descobertas científicas. Contudo a 
descoberta da molécula de DNA, nomeadamente a sua estrutura e a sua função, terá sido 
uma das maiores revoluções no domínio da Biologia, visto ter possibilitado a compreensão 
dos mecanismos fundamentais da vida. Tal facto aumentou a vontade de conhecer e 
compreender o genoma, estando já completamente sequenciados os genomas de diversas 
espécies, incluindo o do Ser Humano. O estudo do genoma possibilitou e, ainda possibilita, 
a análise, discussão e compreensão dos fenómenos da hereditariedade, da variabilidade 
inter e intra-específica, da erradicação e/ou controlo de doenças, entre outros aspectos 
(Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 O aumento gradual do conhecimento da complexidade da molécula de DNA e a 
constante exigência de meios de diagnóstico cada vez mais rápidos, fiáveis e específicos, 
conduziram ao desenvolvimento de diversas técnicas de quantificação do DNA ao longo 
dos últimos 50 anos. Destacam-se a Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) e as 
numerosas variantes recentemente desenvolvidas, entre as quais se evidencia a PCR em 
tempo real que tem como principal particularidade a monitorização em tempo real da 
amplificação (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). Devido à rapidez, 
sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade da técnica, a PCR em tempo real é hoje 
em dia fundamental em investigação médica, forense ou biotecnológica. As suas 
aplicações estendem-se desde a genotipagem e a quantificação da expressão génica até à 
toxicologia forense e à biossegurança. Esta amplitude de aplicações é demonstrada pelo 
crescimento quase exponencial das publicações científicas baseadas nesta técnica desde a 
sua criação em 1993 (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008; Oliveira, 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Renato e Thaiana
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1. PCR convencional 
 
1.1 Contextualização histórica 
 
Após a descoberta da estrutura e função da molécula do DNA, vários cientistas 
interessaram-se pelo desenvolvimento de métodos de detecção e quantificação dos ácidos 
nucleicos. As primeiras técnicas basearam-se em ensaios de „hibridização‟. Apesar de este 
procedimento permitir a detecção de quantidades de material na ordem dos picogramas e 
de ser um teste sensível, fiável e relativamente rápido, apresentava como maior limitação o 
recurso a sondas radioactivamente marcadas, o que trazia implicações para a saúde, 
requeria autorizações legais e dispositivos eficientes e era na globalidade um processo 
dispendioso. Por tal, foi desenvolvido uma segunda geração de métodos de detecção de 
hibridização (colorimétrica, químico-luminescente e químico-fluorescente) baseados em 
materiais não radioactivos, de forma a substituir os materiais radioactivos. Contudo estas 
técnicas não apresentavam sensibilidade tão elevada como nos primeiros sistemas. Até aos 
dias de hoje, uma variedade de técnicas baseadas no princípio básico da hibridização foram 
desenvolvidas (por exemplo: hibridização Southern- e Northern-blot) sendo 
frequentemente aplicadas na investigação fundamental e em diagnósticos clínicos. Contudo 
a rápida evolução no domínio da saúde e das ciências forenses exigiu o desenvolvimento 
de novas técnicas que permitissem a detecção rápida e fiável de quantidades ínfimas de 
moléculas, como os ácidos nucleicos. De forma a ultrapassar as limitações da sensibilidade 
que eram inerentes aos protocolos de detecção e hibridação do ácido nucleico, uma nova 
técnica foi desenvolvida: a técnica da PCR ou técnica da Reacção em Cadeia da 
Polimerase (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
A PCR foi concebida pelo Químico Americano Kary Mullis em 1983 (Saiki et al., 
1985). Mullis desenvolveu um processo através do qual o DNA poderia ser multiplicado 
artificialmente através de ciclos repetidos de duplicação cuja reacção seria catalisada pela 
DNA polimerase. Esta técnica baseia-se na amplificação exponencial selectiva de uma 
quantidade reduzida de DNA de um conjunto de células, correspondendo a um mecanismo 
de síntese artificial de DNA num processo em cadeia que imita a replicação do DNA. 
Trata-se de um método rápido e eficiente para amplificação de sequências específicas a 
partir de uma mistura complexa de sequências genómicas ou DNA complementar. 
Pequenas quantidades de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes e em 
Renato e Thaiana
Realce
poucas horas, permitindo assim uma detecção rápida e fiável dos marcadores genéticos de 
doenças infecciosas, cancro ou doenças genéticas, entre outras aplicações. Pode ainda ser 
aplicada no mapeamento genético, na clonagem de genes, em testes de paternidade e na 
construção de árvores filogenéticas. Assim sendo, esta técnica revolucionou várias áreas 
tais como, a Biologia Molecular, a Patologia, a Farmácia, a Botânica e a Medicina Forense 
(Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
Mullis viu reconhecido a importância da sua criação através da arrecadação do 
prémio Nobel da Química, que compartilhou com o Químico Canadiano Michael Smith, 
por ter estabelecido a base dos oligonucleótidos para o estudo das proteínas. A 
incorporação dos ciclos térmicos na técnica foi uma clara e determinante inovação na 
detecção e amplificação de grandes quantidades de DNA (Mackay et al., 2007; Pelt-
Verkuil et al., 2008). 
O desenvolvimento da técnica da PCR optimizou o processo de clonagem devido a 
não necessitar de microrganismos vivos e permitir um aumento exponencial da quantidade 
de DNA amplificado de forma rápida e segura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 - Desenho esquemático de uma experiência típica de clonagem 
 (Adaptado de http://www.dbio.uevora.pt/LBM/Foco/Hospedeiros/Hospedeiros.html, acedido a 10.11.2009). 
Renato e Thaiana
Realce
Antes da descoberta da PCR, a clonagem prévia e a respectiva replicação na célula 
do hospedeiro eram requisitos fundamentais para a síntese de DNA. Na verdade, a 
clonagem era e continua a ser um processo relativamente complexo que envolve a selecção 
de um plasmídeo adequado (vector) para a inserção de um determinado gene (DNA dador). 
Tanto o DNA dador como o vector têm sequências de DNA específicas, nas quais as 
endonucleases de restrição vão cortar as cadeias do DNA numlocal especifico. 
Posteriormente, mistura-se o fragmento de DNA (contendo o gene que vai ser clonado), o 
plasmídeo (no qual o gene será inserido) e a endonuclease de restrição escolhida. A enzima 
escolhida deverá cortar o plasmídeo num só local, e sendo assim este poderá então receber 
uma porção adicional de DNA. Em seguida, incubam-se os fragmentos de DNA e os 
plasmídeos cortados e abertos, com a enzima ligase que por sua vez liga fragmentos de 
DNA e plasmídeos. Sendo assim, desta ligação vai resultar um plasmídeo recombinante 
que contém o fragmento de DNA desejado. No final do processo, as células que adquiriram 
os plasmídeos dizem-se «transformadas» (Fig.1; Pelt-Verkuil et al., 2008). Na tabela 1 
encontram-se sumariados todos os componentes envolvidos no processo de clonagem. 
 
Tabela 1 - Componentes envolvidos no processo de clonagem. 
 
Componente da clonagem Função 
DNA dador Fonte do DNA ou gene a ser clonado 
Endonuclease de restrição Enzima utilizada para cortar tanto o DNA do dador 
como o do vector em locais específicos, de modo a que o 
DNA do dador possa ser inserido no vector 
Vector Plasmídeo ou bacteriófago utilizado para introduzir o 
gene a ser clonado numa célula hospedeira 
Ligase do DNA Enzima utilizada para ligar as extremidades livres e 
adaptáveis do DNA do vector e do dador, e assim formar 
um vector recombinante 
Célula hospedeiro Geralmente uma bactéria ou uma célula de levedura. Os 
vectores recombinantes introduzem -se nas células 
hospedeiras de modo a obter maiores quantidades da 
molécula de DNA recombinante 
 
 
 
 
 
1.2. Princípios da técnica 
 
 A reacção da PCR envolve três fases: a fase de desnaturação pelo calor, a fase de 
annealing e a fase de extensão (Fig. 2). 
 Na primeira fase ocorre a separação da dupla hélice de DNA por aquecimento a 
uma temperatura elevada (94ºC-96ºC), originando duas cadeias separadas (Pelt-Verkuil et 
al., 2008). 
 A fase de hibridação dos primers (oligonucleótidos iniciadores) ocorre entre 50ºC e 
54ºC. Durante esta fase é adicionado o par de primers que se recombinam com as duas 
cadeias de DNA separadas com elevada especificidade. O par de primers liga-se 
exactamente à sequência complementar de DNA, indicando os pontos inicial e final da 
nova cópia de DNA que irá ser sintetizada na fase seguinte (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 Durante a fase de extensão do DNA a temperatura é elevada até ao intervalo 72ºC a 
76ºC, que coincide com a temperatura a que a DNA polimerase tem o seu máximo de 
actividade. Aquela enzima reconhece os sítios onde os primers se recombinaram com o 
DNA alvo e liga-se a eles. A enzima sintetiza a cadeia complementar utilizando os 
nucleótidos trifosfatados que estão livres e em excesso na solução da reacção (dNTP‟s). A 
extensão começa sempre na zona 3‟ do primer. A DNA polimerase sintetiza 
exclusivamente na direcção 5‟-3‟. Consequentemente, na construção da cadeia 
complementar da sequência alvo de DNA, os nucleótidos livres na solução são somente 
adicionados à zona 3‟ dos primers (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 No fim de um ciclo de PCR obtém-se duas novas cadeias de DNA para cada alvo 
da dupla cadeia. Assim, duas novas cadeias são sintetizadas a partir da cadeia molde em 
cada ciclo completo da técnica de PCR, fazendo com que se dê um crescimento 
exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2
n
 vezes mais cópias do que havia no início (Fig. 
3) (Delidow et al., 1993). 
 O produto da reacção da PCR é denominado amplicão (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 - Figura esquemática de um ciclo da técnica da PCR 
(Adaptado de http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html, acedido a 25.11.2009). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 - Amplificação exponencial do gene na PCR 
(Adaptado de http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html, acedido a 25.11.2009). 
 
 Para a realização da técnica de PCR é necessário o DNA molde e uma mistura de 
reagentes, denominada de Master Mix. Esta mistura tem como componentes essenciais a 
enzima DNA polimerase, iniciadores da reacção (primers), desoxirribonucleótidos 
trifosfatados (dNTP´s), tampão, catião bivalente – Mg 2+ e catião monovalente – K + (KCl) 
(Chen e Janes, 2002; Roche, 2003; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 Iniciadores (Primers) 
 
 Os primers são oligonucleótidos responsáveis por iniciar a reacção da PCR. Estes 
são adicionados à solução e após a descida da temperatura, ocorre a sua hibridização com 
as sequências complementares presentes nas moléculas do DNA molde. Os iniciadores 
utilizados na PCR servem para localizar a sequência alvo. Os quatro nucleótidos (G – 
guanina, C – citosina, A – adenina e T – timina) utilizados na PCR correspondem aos 
nucleótidos presentes na sequência dos primers, compostos por um grupo fosfato, uma 
pentose e uma base nitrogenada (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
Os fragmentos de DNA a amplificar não devem exceder as 3000 pares de bases 
(pb) e idealmente deverão ser inferiores a 1000 pb. Por sua vez, a correcta dimensão dos 
primers é também determinante para o sucesso da aplicação da técnica, devendo aqueles 
apresentar cerca de 18 a 30 pb. Estas sequências de oligonucleótidos deverão ter um 
tamanho suficiente para que a probabilidade de hibridar com outras regiões que não a 
desejada, seja reduzida. A concentração dos primers na solução também afectará o 
resultado final da PCR, isto é, baixa concentração induz má polimerização e concentrações 
excessivas induzem o aparecimento de produtos inespecíficos e formação de dímeros de 
primers (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
Durante a reacção da PCR, a temperatura é considerada um factor fundamental, 
contribuindo, por exemplo, para quebrar as ligações entre os nucleótidos do primer e da 
cadeia de DNA ou para prevenir a ocorrência de incompatibilidades caso os primers sejam 
excessivamente longos. A temperatura na qual 50% das moléculas do conjunto 
primer/DNA estão desemparelhadas e as outras 50% estão ainda hibridizadas denomina-se 
temperatura de melting (Tm). Se o primer tiver menos de 25 nucleótidos, a Tm pode ser 
estimada recorrendo à Regra de Wallace, sendo dada pela fórmula Tm=4(G+C) + 2(A+T) 
ºC, em que G, C, A, T correspondem ao número de cada um dos nucleótidos no primer. 
Esta temperatura vai determinar por sua vez a temperatura de annealing, que diz respeito à 
temperatura à qual ocorre a junção dos primers. Frequentemente esta temperatura é 
seleccionada de acordo com a Tm consensual sendo lhe diminuído 2 a 4ºC (Chen e Janes, 
2002; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 
 
 Polimerase 
 
A escolha da DNA polimerase é determinada pelos objectivos da experiência. 
Existem no mercado uma larga variedade de enzimas, que diferem em termos de 
estabilidade térmica, fidelidade e direcção de processamento da polimerização. 
A polimerase mais popular é a Taq polimerase (Fig.4) extraída da bactéria 
termófila Thermus aquaticus, que vive em águas a 75ºC. A Taq DNA polimerase é uma 
proteína com cerca de 94 kDa com actividade de polimerização 5‟-3‟ que é mais eficiente 
no intervalo 70ºC a 80ºC. A enzima é bastante termo-estável, apresentando um tempo de 
meia vida de aproximadamente 35-40 minutos a 95ºC. Desta forma, esta enzima poderá ser 
adicionada no início da reacção e permanecerá activa durante todos os ciclos de 
amplificação (Chen e Janes, 2002; Yazd et al., 2009). 
 
 
Figura 4 – Desenho esquemático da actividade da Taq DNA polimerase. 
(Adaptado de Roche, 2003). 
 
A Pfu DNA polimerase é uma enzima termoestável, isolada da Pyrococcus 
furiousus,com actividade de polimerização 3‟-5‟ que é mais eficiente no intervalo a 75ºC. 
O tempo de meia vida a 95ºC é superior a 120 minutos (Chen e Janes, 2002; Kima et al., 
2008). 
A Vent polimerase é isolada da arqueobactéria termofila Thermoccocus litoralis, 
que habita em fundos oceânicos com temperaturas superiores aos 98ºC. Esta enzima 
distingue-se da Taq polimerase pelo facto da actividade de polimerização ocorrer na 
direcção 3‟-5‟ e de ser bastante mais termoestável visto apresentar um tempo de meia vida 
a 95ºC de cerca de 400 minutos (Chen e Janes, 2002; Yazd et al., 2009). 
 
 
 
Direcção da polimerização 
 dNTP´s 
 
 Os desoxirribonucleótidos trifosfatados dNTP´s: dATP- desoxiadenosina trifosfato 
(Fig. 5 (a)); dTTP - desoxitimidina trifosfato (Fig. 5 (b)); dGTP - desoxiguanosina 
trifosfato (Fig. 5 (c)) e dCTP - desoxicitosina trifosfato (Fig. 5 (d)) são seleccionados de 
acordo com o emparelhamento ao molde, e são ligados à cadeia por ligações fosfodiéster. 
 Os quatro nucleótidos devem conter a mesma concentração, para que não ocorram 
erros de incorporação. As elevadas concentrações de dNTP´s normalmente vão aumentar 
este tipo de erros, mas por sua vez, concentrações demasiado baixas fazem diminuir o 
rendimento da reacção (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 
 
 
Figura 5 (a) – Representação da molécula de dATP utilizado na PCR (Extraído de 
http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxyadenosine_triphosphate, acedido a 12.10.2010). 
 
 
 
 
Figura 5 (b) – Representação da molécula de dTTP utilizado na PCR (Extraído de 
http://en.wikipedia.org/wiki/Thymidine_triphosphate, acedido a 12.10.2010). 
 
 
 
 
Figura 5 (c) – Representação da molécula de dGTP utilizado na PCR (Extraído de 
http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxyguanosine_triphosphate, acedido a 12.10.2010). 
 
 
 
 
Figura 5 (d) – Representação da molécula de dCTP utilizado na PCR (Extraído de 
http://en.wikipedia.org/wiki/Deoxycytidine_triphosphate, acedido a 12.10.2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Tampão 
 
 O tampão é utilizado para manter o pH estável durante a reacção. Normalmente 
utiliza-se o tampão Tris-HCl, com o pH ajustado entre 8,3 - 8,8 à temperatura ambiente e a 
uma concentração de 10 mM (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 MgCl2 
 
 A actividade das DNA polimerases termoestáveis depende da existência na solução 
de catiões bivalentes livres, normalmente Mg
2+
, sendo por tal o MgCl2, um co-factor 
essencial na reacção. Vários componentes da reacção ligam ao Mg
2+
, incluindo os primers, 
o DNA a ser amplificado, produtos da PCR e os dNTP‟s. A concentração do ião magnésio 
deve exceder a concentração de dNTP‟s, atendendo ao facto da ligação entre ambos os 
reagentes ocorrer na proporção de 1:1 e devido ao ião actuar como co-factor enzimático na 
PCR, ao tornar-se substrato da DNA polimerase. Desempenha ainda um papel de auxílio 
na ligação do primer ao DNA molde. Tipicamente, a concentração molar do ião pode 
variar entre 1.5 a 4.0 mM, dependendo esta da concentração molar de grupos fosfatos, do 
kit utilizado e do nível de degradação do DNA. Contudo, deve realçar-se que baixas 
concentrações deste ião corresponde normalmente a reduzidas quantidades do produto 
final, assim como, excessivas concentrações de Mg
2+
 tornam a PCR pouco específica. 
(Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 KCl 
 
 O recurso a sais, como o KCl, é fundamental para fornecer a força iónica necessária 
durante a reacção. Regra geral, os tampões apresentam cerca de 50 mM de KCl, estando 
optimizados para fragmentos de DNA superiores a 500 pb. Para fragmentos mais reduzidos 
de DNA, a concentração de KCl deve ser aumentada para 70-100 mM, uma vez que torna 
mais eficiente a PCR. Note-se que a concentração do sal influencia a Tm do conjunto 
primer/DNA molde e por conseguinte a temperatura de annealing (Chen e Janes, 2002; 
Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
1.3. Detecção do Produto da PCR 
 
O produto da reacção da PCR é normalmente visualizado através de electroforese 
em gel. Outros métodos analíticos podem ser aplicados com a finalidade de detecção dos 
produtos da PCR, tais como, Southern blotting, ensaio ELAHA (enzyme-linked amplicon 
hybridization assay), ensaio ELOSA (enzyme-linked oligosorbent assay), entre outros 
(Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
A electroforese em gel consiste na separação de moléculas com carga eléctrica não 
nula, geralmente usada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA. Durante a 
aplicação de uma diferença de potencial assiste-se à migração de partículas que originam 
um conjunto de bandas. A visualização destas bandas é realizada através de radiação ultra-
violeta e só é possível devido à adição de um composto fluorescente apropriado que, ao 
interagir com o DNA, se torna fluorescente. A selecção do composto é determinante, na 
medida em que uns compostos se ligam preferencialmente ao DNA em vez do RNA e 
outros mostram maior afinidade ao DNA de cadeia dupla face ao de cadeia simples. O 
brometo de etídio é um exemplo de um composto fluorescente, que apresenta 
características mutagénicas e que é largamente utilizado para a detecção de DNA em géis 
(Oliveira, 2009). Outro exemplo é o nitrato de prata que é utilizado em géis de 
poliacrilamida. O tamanho do produto é depois estimado por comparação das bandas com 
marcadores de massas moleculares previamente conhecidas (Chen e Janes, 2002). 
O gel de agarose é amplamente utilizado pese embora outros géis se possam 
utilizar, tais como a poliacrilamida. O gel utilizado depende do tamanho das moléculas a 
separar. Regra geral, utiliza-se gel de poliacrilamida para separar proteínas ou moléculas 
de DNA de pequenas dimensões (até 500 pb) e agarose para moléculas de DNA maiores. O 
gel de agarose é fácil de elaborar e forma poros de maiores dimensões sendo adequado a 
moléculas de maior massa molecular. O gel de poliacrilamida tem maior capacidade de 
resolução, permitindo distinguir fragmentos que diferem numa só base, ou que tendo o 
mesmo número de bases, têm diferentes conformações (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 Agarose 
 
O polissacarídeo agarose é um composto sólido quimicamente estável à temperatura 
ambiente que pode ser extraído a partir de algas marinhas. A agarose forma uma matriz 
porosa (cujo tamanho do poro pode ser controlado) e através do qual as moléculas de 
ácidos nucleicos migram a uma velocidade principalmente dependente da carga eléctrica, 
massa (pb) e conformação das moléculas. A velocidade de migração depende ainda da sua 
composição nucleotídica, da concentração da matriz de agarose utilizada, do campo 
eléctrico aplicado ao sistema (V/cm) e ainda da composição do tampão utilizado na 
electroforese. Regra geral, as moléculas com menor massa migram mais rapidamente do 
que as de maior massa, dado que as de maior massa têm tendência a ficar retidas na matriz 
de agarose. A migração das partículas ocorre no sentido do pólo positivo, dado que as 
moléculas de DNA são carregadas negativamente (Lo et al., 2006; Miguel, 2007; Pelt-
Verkuil et al., 2008). A Figura 6 ilustra um equipamento de electroforese em gel. O gel de 
agarose, previamente carregado com os produtos da reacção da PCR, é colocado na cuba 
com a solução tampão. Uma corrente eléctrica é aplicada e o DNA migrará do terminal 
negativo (fio preto) até ao terminal positivo. A Figura 7 ilustra o resultado final de uma 
electroforese com gel de agarose com as respectivas bandas. 
O gel é produzido recorrendo-se ao uso de tampão TBE ou TAE, cuja percentagem 
do sistema gel-tampão depende do respectivo comprimentodos fragmentos de DNA. A 
matriz do gel é composta geralmente por cerca de 1 a 2% de agarose, dependendo do 
tamanho dos produtos da PCR (Chen e Janes, 2002; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
Figura 6 - Aparelho de electroforese em gel. 
 (Extraído de http://pt.wikibooks.org/wiki/Ficheiro:Gel_electrophoresis_apparatus.JPG, acedido a 26.11.2009). 
 
 
Figura 7 - Visualização do produto da PCR em gel de agarose 
(Adaptado de http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html, acedido a 26.11.2009). 
 Poliacrilamida 
 
 A poliacrilamida corresponde à mistura de dois polímeros, a acrilamida (C3H5NO) 
e a bis-acrilamida (N,N´- Metileno-bis-acrilamida), na proporção de 19:1 respectivamente. 
Diferentes relações entre as concentrações destas moléculas vão permitir a criação de 
diferentes gradientes de separação. A preparação de um gel de poliacrilamida envolve a 
mistura da acrilamida e a bis-acrilamida em concentrações adequadas, num suporte de 
vidro, e a posterior adição de TEMED (N,N,N´,N´-Tetrametiletilenodiamino) e persulfato 
de amónio, que actuam como catalisadores da polimerização. A mistura, dissolvida no 
tampão de corrida desejado, é colocada rapidamente numa cuba de montagem semelhante 
à utilizada para agarose com o objectivo de polimerizar. Os poços são formados com 
recurso a um pente (Fig. 8). Após a polimerização, coloca-se o gel na cuba, cobre-se com o 
tampão, carrega-se com as amostras e com o marcador e aplica-se a corrente eléctrica 
(Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8 – Gel de poliacrilamida 
(Adaptado de http://www.ehu.es/biomoleculas/isotopos/jpg/electrophoresis6.gif, acedido a 21.04.2010). 
 
 A tabela 2 sumaria as principais diferenças entre os géis de agarose e de 
poliacrilamida. 
 
Tabela 2 - Distinção entre géis de agarose e de poliacrilamida. 
 
Agarose Poliacrilamida 
Forma poros de maiores dimensões Forma poros de menores dimensões 
Géis Horizontais Géis Verticais e Horizontais 
Separar proteínas ou moléculas de DNA de 
maiores dimensões 
Separar moléculas de DNA de pequenas dimensões (até 
500 pb) 
Moléculas de maior massa molecular Moléculas de menor massa molecular 
Não desnaturante Pode ser ou não desnaturante 
Corar o DNA com brometo de etídio Corar o DNA com brometo de etídio ou com nitrato de 
prata 
 
1.4. Aplicações da PCR 
 
A PCR pode ter diversas aplicações, tais como (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 
2008): 
1. DNA fingerprint: técnica forense, na qual pequenas amostras de DNA retiradas da 
cena de um crime são amplificadas para serem analisadas. 
2. Testes de parentesco: podem ser determinadas relações genéticas através da 
comparação de dois ou mais DNA fingerprints. 
3. Mutações pontuais: frequentemente geradoras de polimorfismos genéticos, podem 
ser detectadas por acção das enzimas de restrição ou através da sequenciação. 
4. Doenças infecciosas por agentes patogénicos diversos: a amplificação do DNA do 
agente possibilita um diagnóstico precoce mesmo antes da ocorrência de infecções. 
5. Diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional (particularmente para doenças 
herdadas). 
6. Diagnóstico e prognóstico de doenças genéticas: o estudo dos genes relacionados 
com essas doenças permite quer o diagnóstico, quer a evolução das mesmas. 
7. Análise de DNA antigo: diversas investigações amplificaram com sucesso material 
genético de insectos extintos há mais de 20 milhões de anos fossilizados em âmbar. 
8. Clonagem de genes baseado no isolamento de um gene de um organismo e a sua 
inserção noutro organismo (Fig. 9). A PCR (passo 2) é utilizada para obter 
múltiplas cópias (passo 3) a partir de um único gene contido no DNA do organismo 
A (passo 1). O gene é então inserido num plasmídeo (passo 4 e 5) e posteriormente 
o plasmídeo é inserido no organismo B (passo 6). Este organismo devido à sua 
expressão génica gerará múltiplas cópias do gene inicial (passo 7). 
 
 
Figura 9 – Clonagem de um gene recorrendo a um plasmídeo 
(Adaptado de Sarmento et al., 2006, acedido a 21.04.2010). 
 
1.5. Variantes da PCR 
 
 
 A versatilidade da técnica da PCR convencional permitiu o desenvolvimento de 
numerosas variantes. A tabela 3 procura apresentar e caracterizar sumariamente algumas 
variantes da técnica de PCR convencional. 
 
Tabela 3 - Variantes da técnica de PCR convencional. 
 
Sigla Designação 
inglesa 
Designação 
portuguesa 
Caracterização 
sumária 
Exemplos 
MPCR PCR multiplex PCR múltiplo Utiliza mais do que um par 
de primers na mesma 
reacção 
Polimorfismos bialélicos 
autossomais (Turchi et al., 2004) 
N-PCR PCR nested – Destinada a reduzir a 
contaminação dos produtos 
da reacção 
Análise genética de 
impressões digitais (Lagoa et al., 
2008) 
qPCR/R
TQ-PCR 
PCR in real 
time 
PCR em 
tempo real 
Visualização da 
amplificação à medida que 
a reacção ocorre 
Quantificação de DNA em 
amostras VF forenses (Schulz et 
al., 2006) 
RT-PCR Reverse 
Transcriptase 
Polymerase 
Chain Reaction 
PCR por 
Transcriptase 
Reversa 
Amplificar o DNA obtido 
por meio da transcrição 
reversa de RNA 
Detecção de diferentes 
espécies de RNA do vírus 
respiratório (Valassina et al., 
1997) 
PCRSQ Semi-qantitative 
PCR 
PCR semi-
quantitativo 
Baseia-se na intensidade 
do produto final 
amplificado, tentando 
verificar até que ponto 
determinado produto 
aumenta ou diminui em 
relação a um gene de 
referência 
Identificação do PRKAA1 no 
cromossoma 5, que é um 
potencial responsável do gene 
do cancro do colo do útero 
(Huang et al., 2006) 
RAPD-
PCR 
Random 
Amplified 
Polymorphic 
DNA 
– Baseia-se na análise do 
polimorfismo dos 
fragmentos de DNA 
amplificado aleatoriamente 
Identificação do genoma do 
actinomiceto em regiões 
conservadas (Mehling et al., 1995) 
 
REP-
PCR 
Repetitive 
Extragenic 
Palindromic 
Sequências 
Palindrômicas 
Extragénicas 
Repetitivas 
 
Recorre a sequências 
oligonucleotídicas 
iniciadoras 
complementares de 
sequências de DNA 
repetitivas 
Caracterização molecular de 
isolados de Salmonella 
(Albufera et al., 2009) 
ERIC-
PCR 
Enterobacterial 
Repetitive 
Intergenic 
Consensus 
Consenso de 
sequências 
enterobacteria
nas 
intergênicas e 
repetitivas 
Usada para estudar a 
diversidade da comunidade 
microbiana e dinâmica 
Identificação do destino da 
E.coli quando ocorre o abate 
de porcos (Namvar e Warriner 
,2006) 
BOX-
PCR 
BOX-PCR - Utiliza somente um 
oligonucleótido iniciador, 
devido à orientação 
invertida das repetições no 
genoma 
Investigar o parentesto 
genético do Bacillus anthracis 
entre 25 espécies de Bacillus 
(Kima et al., 2002) 
RACE-
PCR 
Rapid 
amplification of 
cDNA end 
- Facilita o isolamento de 
sequências das 
extremidades 5‟ e 3‟ dos 
cDNA‟s, permitindo obter 
cDNA‟s completos 
Amplificação de cDNA e de 
DNA de Isochrisis Galbana 
pela sequenciação de enzimas 
lipolíticas (Godet et al., 2007) 
AS-PCR Allele specific 
PCR 
PCR 
alelo-
específica 
Distinção entre alelos que 
diferem num único 
nucleótido 
Determinação quantitativa da 
relação entre mutações de 
genes normais ras no sangue 
de pacientes com leucemia 
(Horikoshi et al., 1994) 
iPCR Inverse PCR PCR inverso Clonagem de sequências 
de DNA adjacentes a uma 
sequência conhecida a 
partir de um molde circular 
Genotipagem do grupo 
sanguíneo ABO (Kobayashi e 
Akane, 2000)PCR 
Screen 
PCR screening PCR de 
rastreio 
Indica a presença ou não 
de uma modificação 
genética 
Identificação do tipo I do 
vírus do herpes humano (Yu et 
al., 2009) 
LM-
PCR 
Ligation 
mediated PCR 
PCR mediada 
por ligação 
Utiliza um único primer 
para garantir que a 
amplificação é linear 
Detecção de aductos de DNA 
ao nível da sequência do 
DNA (Pfeifer et al., 1993) 
AFLP-
PCR 
Amplified 
fragment-length 
polymorphism- 
PCR 
Análise do 
polimorfismo 
de 
comprimento 
de fragmentos 
amplificados 
O DNA genômico é 
tratado com duas enzimas 
de restrição e os 
fragmentos ligados a 
adaptadores 
Identificação e tipagem de 
espécies de Candida (Lopes et 
al., 2007) 
RFLP-
PCR 
Restriction 
Fragment 
Length 
Polymorfism – 
PCR 
Polimorfismo 
de 
Comprimento 
de Fragmentos 
de Restrição 
 
Se existirem dois 
amplicons com uma 
variação da sequência de 
nucleótideos nos sítios de 
reconhecimento das 
enzimas de restrição, 
geram diferentes padrões 
de fragmentos 
Diferenciação de larvas 
califorídeos (Diptera, 
Calliphoridae) em cadáveres 
humanos (Schroeder et al., 2003) 
DOP-
PCR 
Degenerate 
oligonucleotide
primed-
Polymerase 
Chain Reaction 
- Utiliza parcialmente uma 
sequência degenerada de 
um protocolo de PCR, com 
duas diferentes 
temperaturas de annealing 
Estudo do cancro familiar da 
próstata recolhe algumas 
alterações genéticas únicas, 
quando comparamos com os 
tumores esporádicos da 
próstata (Verhagen et al., 2000) 
Anchore
d PCR 
Anchored 
Polymerase 
Chain Reaction 
- Utiliza apenas um primer 
em vez de dois primers 
Estudo de células T humanas 
receptoras de transcrições 
(Ferradini et al., 1993) 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. PCR em tempo real 
 
2.1. Contextualização histórica 
 
 O sucesso da amplificação de DNA pela técnica da PCR convencional está 
dependente de diversos factores, como a presença de inibidores, a quantidade de DNA, o 
estado de degradação do DNA, entre outros. Assim, a necessidade de monitorizar em 
simultâneo a quantidade e qualidade do DNA amplificado levou ao desenvolvimento de 
uma variante da técnica da PCR convencional: a PCR em tempo real. 
A PCR em tempo real, também conhecida como PCR quantitativa ou PCR em 
tempo real quantitativa ou simplesmente qPCR ou RTQ-PCR, foi descrita pela primeira 
vez em 1993, por Higuchi e seus colaboradores. Montaram um sistema ao qual acoplaram 
uma câmara de vídeo, de modo a monitorizar a PCR durante todos os ciclos. Este 
mecanismo permitia-lhes detectar o aumento da fluorescência durante a reacção, devido à 
ligação do brometo de etídio às moléculas de DNA de dupla cadeia recém-sintetizadas 
(Higuchi et al., 1993). 
O procedimento é semelhante ao da técnica da PCR convencional diferindo 
essencialmente numa característica inovadora: a possibilidade de quantificação em tempo 
real do DNA amplificado, em cada ciclo de amplificação. Neste método, as fases de 
amplificação, detecção e quantificação são totalmente automatizadas, ocorrendo em 
simultâneo e em tempo real (Heid et al., 1996). O sucesso da técnica rapidamente levou ao 
seu aperfeiçoamento. Para tal contribuíram, por exemplo, o desenvolvimento de sondas de 
oligonucleótidos de dupla-hélice e a descoberta de que a Taq polimerase possui actividade 
exonuclease 5‟-3‟. Na última década diversas plataformas de instrumentação foram criadas 
e comercializadas, no entanto, a maioria é composta por um termociclador, com sistema 
óptico para a excitação e recolha da emissão da fluorescência e um computador com 
software próprio para a aquisição de dados e análise final da reacção (Mackay et al., 2007). 
 
2.2. Princípios da técnica 
 
O procedimento da técnica de PCR em tempo real segue o princípio geral da PCR 
convencional. Assim, apresenta as três fases características da PCR: a fase de crescimento 
exponencial, fase de crescimento linear e fase estacionária. A primeira fase é bastante 
Renato e Thaiana
Realce
Renato e Thaiana
Realce
Renato e Thaiana
Realce
específica e precisa. Na fase de crescimento linear os produtos da reacção são consumidos 
e iniciam o processo de degradação. A fase estacionária corresponde ao final da análise 
devido ao elevado nível de degradação dos produtos da PCR. Os compostos fluorescentes 
adicionados ao DNA geram um sinal de fluorescência que é directamente proporcional à 
quantidade de produto amplificado ao longo das diferentes fases e que podem ser 
representados graficamente como demonstrado na Figura 10. 
 
Figura 10 – Representação gráfica das fases da PCR em tempo real. 
(Adaptado de Kubista et al., 2006). 
 
 A fase de crescimento exponencial é considerada a melhor para se estudar a 
reacção devido à elevada eficiência registada, uma vez que a relação entre a quantidade de 
produto e do input de DNA é mais consistente. Por este motivo os dados de fluorescência 
são geralmente recolhidos desde o início do processo de amplificação. 
 A interpretação dos resultados obtidos pelos equipamentos obriga a que se 
definam conceitos específicos, como baseline, ponto CT e threshold. A baseline 
corresponde ao limiar mínimo de detecção de fluorescência do instrumento sendo 
considerado „ruído de fundo‟ do equipamento. O ponto CT, denominado na literatura como 
cycle threshold, corresponde ao número de ciclos necessários para que a fluorescência da 
reacção seja detectável. Trata-se de um ponto a partir do qual a fluorescência detectada 
ultrapassa o limiar da fase exponencial, conhecido também na literatura como threshold, 
definido automática e arbitrariamente pelo software do equipamento em função da 
baseline. O valor mínimo de CT é dependente da quantidade de moléculas presente no 
Fl
u
o
re
sc
ên
ci
a 
Número de ciclos 
Limiar da fase 
 exponencial 
Renato e Thaiana
Realce
Renato e Thaiana
Realce
início do processo de amplificação, o que significa que um menor número de moléculas 
inicialmente representa um maior número de ciclos requeridos para gerar um aumento 
exponencial do sinal da fluorescência que seja significativamente superior à baseline (Heid 
et al., 1996; Kubista et al., 2006; Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). Na 
maioria dos protocolos da PCR em tempo real, o valor CT varia entre 17 ciclos 
(aproximadamente 10 milhões de moléculas iniciais) e 37 ciclos (aproximadamente 1 
molécula inicial) como é demonstrado na Figura 11 (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 
Figura 11 – Representação gráfica dos resultados da amplificação em tempo real em 
função de diferentes teores de moléculas de DNA iniciais (Adaptado de Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
A eficiência (E) da amplificação é fundamental para o sucesso da técnica. Esta deve 
variar idealmente entre os 90% e 100% (-3.6 > declive > -3.1), podendo ser determinada 
através de métodos diversos. O mais simples baseia-se na equação: E = 10
(-1/declive)
-1. 
A eficiência da amplificação pode ser influenciada por diversos factores, incluindo 
o comprimento do amplicão, existência de estruturas secundárias na amostra, qualidade 
dos primers usados, procedimentos laboratoriais incorrectos, presença ou utilização de 
inibidores da PCR (hemoglobina, ureia, heparina, glicogénio, gorduras, iões cálcio, etc.), 
presença ou utilização de promotores da PCR (glicerol, DMSO, BSA, proteína gene 32, 
Taq Extender, E.coli ss DNA binding), entre outros (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
Fl
u
o
re
sc
ên
ci
a 
Renato e Thaiana
Realce
Renato e Thaiana
Realce
2.3. Tecnologias e métodosde detecção 
 
A análise in vitro dos produtos da amplificação por PCR em tempo real é 
concretizada através da utilização de compostos fluorescentes. Diversos protocolos têm 
sido desenvolvidos para permitir a detecção dos produtos da PCR, ao longo da 
amplificação. Todos os protocolos requerem o uso de um termociclador de PCR em tempo 
real específico, bem como capilares de vidro onde se desenvolve a reacção em cadeia da 
polimerase. Estes equipamentos incluem ainda um sistema óptico, uma fonte de 
iluminação ultra-violeta e um detector de fluorescência. 
O termociclador procede às oscilações de temperatura necessárias para a 
concretização dos três ciclos da PCR. As variações da temperatura são obtidas através da 
circulação de ar aquecido a partir de uma bomba de calor e controlada numa câmara 
técnica. Esta reacção ocorre em capilares de vidro de borosilicato, que apresentam uma 
superfície específica elevada para que ocorra um equilíbrio rápido entre a temperatura do 
ar e os componentes da reacção. Desta forma, um ciclo de amplificação pode ser concluído 
em menos de 30 segundos. As propriedades ópticas do vidro de borosilicato estão 
optimizadas para a quantificação da fluorescência. A unidade óptica do aparelho é 
constituída por três canais de detecção que medem a luz emitida em comprimentos de onda 
diferentes. Os resultados da fluorescência medida podem ser monitorizados a cada instante 
no computador que se encontra ligado ao sistema (Silva et al., 2007). 
 
Os métodos químicos de fluorescência utilizados na PCR em tempo real são hoje 
em dia diversificados, recorrendo todos eles a um composto fluorescente cujo sinal é 
passível de ser detectado por um laser do termociclador ao longo do processo. De acordo 
com a literatura, estes métodos podem ser agrupados em dois grandes grupos de acordo 
com o tipo do composto fluorescente e respectivo comportamento durante o processo. 
Serão considerados os seguintes grupos de compostos: corantes intercalantes e sondas de 
sequência específica (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
Corantes intercalantes 
 
 Os corantes intercalantes são fluorocromos sem especificidade para uma sequência 
particular de DNA, que se intercalam na dupla cadeia de qualquer produto da PCR 
permitindo a sua detecção. Contudo o correcto design dos primers confere elevada 
especificidade da detecção e quantificação a estes métodos. 
Neste domínio, a primeira tecnologia desenvolvida foi patenteada pela Molecular 
Probes®, Inc, em 1990, sendo denominada de SYBR® Green. Recentemente foram 
desenvolvidas novas moléculas: a LCGreen® Plus (Idaho Technology) e a EvaGreen® 
(Biotium Inc). 
 
 SYBR® Green 
 
 A tecnologia SYBR® Green baseia-se num conjunto de moléculas com a 
capacidade de se ligar de forma covalente à dupla cadeia de DNA e quando excitadas 
emitem uma fluorescência verde que é medida e convertida numa quantidade de DNA 
(Fig. 12(A)). Esta tecnologia beneficia do facto das moléculas SYBR® Green não 
interferirem com a actividade da maioria das nucleases e das DNA polimerases e de 
aquelas apresentarem elevada afinidade com a dupla cadeia de DNA, o que é bastante útil 
na detecção de amostras de DNA com um baixo número de cópias (Mackay et al., 2007). 
No início do processo a fluorescência é reduzida, visto que as moléculas SYBR® 
Green livres não estão ligadas ao DNA de dupla cadeia e como tal, o sinal produzido é 
mínimo. Ao longo do processo, após a detecção dos primers, quantidades crescentes dos 
fluorocromos ligam-se à dupla cadeia de DNA pré-sintetizada pela enzima Taq DNA 
polimerase. No fim da fase de extensão de cada ciclo, a fluorescência é monitorizada e 
quantificada e, consequentemente o DNA amplificado é determinado (Fig. 12(B)) (Correia, 
2007; Mackay et al., 2007). 
A literatura refere que o correcto desenho dos primers torna-se determinante na 
especificidade do DNA a amplificar. Contudo, alguns estudos demonstraram que a SYBR® 
Green liga-se preferencialmente a produtos da PCR cuja temperatura de melting seja 
superior, indicando a sua potencial preferência por regiões ricas em guanina e citosina. 
Desta forma, a especificidade dos resultados deve ser validada através de uma análise da 
temperatura de melting (Correia, 2007; Mackay et al., 2007). 
Como acontece com qualquer ligação da molécula de DNA, o SYBR® Green pode 
causar mutações e trata-se de um possível agente cancerígeno, no entanto é mais seguro e 
mais fácil de eliminar comparativamente ao brometo de etídio (Mackay et al., 2007). 
 
Figura 12 (A) - Representação da molécula SYBR® Green (azul) intercalada na dupla 
cadeia de DNA (verde); (B) - Método de funcionamento da molécula 
(Extraído de (A) - http://www.fleury.com.br/Medicos/SaudeEmDia/ManualHematologia/pages/PCRQuantitativoemTempoReal-
TimePCR.aspx, acedido a 26.11.2009; (B) - http://homepages.strath.ac.uk/~dfs97113/BB310/lect403.html, acedido a 14.12.2009). 
 
A tecnologia SYBR® Green apresenta como principais vantagens a grande 
sensibilidade, o reduzido custo e a facilidade de manuseamento. Em contrapartida, 
apresenta como principal desvantagem a possibilidade de ligação a todo o DNA em cadeia 
dupla, durante a reacção de polimerização, incluindo os dímeros de iniciadores e outros 
produtos não específicos, o que se pode traduzir numa subestimação da concentração do 
fragmento alvo. Além disso, a detecção com SYBR® Green exige uma optimização 
extensiva, uma vez que não é específico para uma determinada sequência de DNA. Desta 
forma, torna-se imperativo o acompanhamento dos ensaios de forma a validar os resultados 
(Mackay et al. 2007; Oliveira 2009). 
 
 LCGreen® Plus 
 
 O corante LCGreen® Plus exibe uma elevada sensibilidade para produtos da PCR 
com temperaturas de melting reduzidas e destina-se preferencialmente para análises HRM 
(tema tratado posteriormente) (Wittwer et al., 2003; Herrmann et al., 2007). 
 A adição do corante LCGreen® Plus, promove um aumento da temperatura de 
fusão do DNA, cerca de 1-3ºC. Este corante beneficia da capacidade de detecção de 
heteroduplexes (Fig.13) formados durante a PCR. Por tal, este corante está optimizado para 
detecção de variantes da sequência de DNA (SNP´s, inserções/delecções) (Wittwer et al., 
2003; Herrmann et al., 2007). 
 
 
A B Luz emitida 
Polimerase 
Renato e Thaiana
Realce
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13 - Curvas de Tm para cada um dos corantes (LCGreen® Plus e SYBR® Green) 
(Adaptado de http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00009/BTN_A_00011265_O_ILF_9537a.jpg, acedido a 23.03.2010). 
 
 
 O corante LCGreen® Plus diferencia-se do corante SYBR® Green, pela capacidade 
de saturar a molécula toda e de ser contínuo, possibilitando a distinção e discriminação 
entre diferentes curvas de melting (Fig. 14). A análise das curvas de melting geradas com 
corante SYBR® Green é limitada quando estão presentes múltiplos duplexes na solução. 
Produtos com temperaturas de melting superiores são preferencialmente detectados e os 
heteroduplexes não são observados a concentrações do corante compatíveis com a PCR 
(Wittwer et al., 2003; Herrmann et al., 2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14 - Curvas de melting dos corantes SYBR® Green e LCGreen® Plus (Adaptado de 
http://www.genengnews.com/media/images/articles/block_4352.jpg, acedido a 23.03.2010). 
 
 
 EvaGreen® 
 
 O corante EvaGreen® foi desenvolvido recentemente sendo utilizada quer pela 
Applied Biosystems, quer pela BioRad, visto lhe ser reconhecido numerosas vantagens. 
Entre elas, destacam-se a intensidade da fluorescência resultante da ligaçãodo EvaGreen® 
ao DNA que é várias vezes superior ao de SYBR® Green (Fig.15), a menor inibição para o 
processo de PCR e a extrema robustez e estabilidade, tanto termicamente como 
hidroliticamente, sob condições alcalinas ou ácidas. Além disso, a absorção e emissão de 
EvaGreen® é semelhante ao SYBR® Green, o que significa que a mesma configuração 
óptica para SYBR® Green também se pode usar para EvaGreen® (Ihrig et al., 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15 - Cinética dos corantes SYBR® Green e EvaGreen® (Adaptado de 
http://www.gencompare.com/qpcr.htm, acedido a 13.04.2010). 
 
 
Sondas de sequência específica 
 
As sondas, lineares ou em alça, são oligonucleótidos que requerem um fluorocromo 
que é adicionado a uma sonda com especificidade para uma dada sequência de DNA e que 
detectam exclusivamente a dada sequência em todos os produtos da PCR. Estas 
tecnologias permitem que o resultado possa ser monitorizado em tempo real, através do 
computador da plataforma de instrumentação. 
 
A transferência de energia de um marcador fluorescente para um segundo, conceito 
denominado na literatura inglesa como Fluorescence resonance energy transfer (FRET), é 
uma propriedade que depende da interacção molecular entre dois fluorocromos (molécula 
repórter e molécula quencher) e é determinada pela distância física entre as duas 
Número de ciclos 
F
lu
o
re
s
c
ê
n
c
ia
 r
e
la
ti
v
a
 
moléculas. A emissão de energia do repórter (molécula dadora) é absorvida pelo do 
quencher (molécula receptora) levando ou à extinção da fluorescência ou ao auto-
quenching. Este efeito de quenching mútuo (entre as duas moléculas) é determinado pela 
sua sobreposição espectral (comprimento de onda a que ambas emitem ou absorvem 
radiação) e pela distância física entre ambas (Fig. 16). A distância crítica entre os dois 
fluorocromos pode variar desde poucas unidades de Angstroms (o equivalente à dimensão 
de um único nucleótido) até ao comprimento de diversos nucleótidos que determina a 
quantidade obtida de quenching. Uma vez excedida esta distância crítica, a fluorescência 
da molécula repórter deixará de ser absorvida (Watrob et al., 2003; Pelt-Verkuil et al., 
2008). 
 
Figura 16 – Representação esquemática da sobreposição espectral do quencher (molécula 
receptora) e repórter (molécula dadora) (Adaptado de Pelt Verkuil et al., 2008). 
 
O princípio FRET é usado em sistemas de detecção que recorrem a molecular 
beacons, a partir dos quais oligonucleótidos são desenhados especificamente para exibir 
estrutura terciária tipo hairpin-loop, isto é, uma forma particular de alça cujas 
extremidades estão ligadas uma à outra entre si e a parte mediana tem aspecto de uma 
presilha (Fig.17) (Watrob et al., 2003; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
Figura 17 – Representação de um oligonucleótido com estrutura terciária tipo hairpin-loop 
utilizado como molecular beacons (Adaptado de http://www.bio.davidson.edu/Couses/genomics/method/beacon1.gif, 
acedido a 10.02.2010). 
Nucleótidos específicos do produto da PCR 
Repórter Quencher 
Receptor Dador 
Excitação 
Excitação 
Emissão 
Emissão 
As moléculas repórter e quencher estão posicionadas em ambas as extremidades do 
oligonucleótido permitindo assim, que os fluorocromos estejam bastante próximos um do 
outro. Os molecular beacons não hibridizados retêm a estrutura hairpin-loop, o que 
demonstra que nenhum sinal fluorescente emitido pela molécula repórter é absorvido 
devido à forte proximidade da molécula quencher. Os molecular beacons hibridizados até 
uma dada região complementar do DNA alvo adoptam uma estrutura linear, em vez da 
estrutura hairpin-loop, com a consequência de que ambas as moléculas fluorescentes 
permanecerão espacialmente afastadas. Este facto provocará uma significativa redução da 
actividade de absorção da molécula quencher, e consequentemente a fluorescência 
escapará e será registada (Watrob et al., 2003; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
Na prática, esta tecnologia tem sido utilizada para quantificar e caracterizar DNA 
alvo amplificado, bem como, monitorização de polimorfismos genéticos em organismos 
(exemplo: SNPs ou polimorfismos de nucleótidos únicos) (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
Existem vários tipos de molecular beacons, nomeadamente, os primers „Scorpion‟ 
e „Sunrise‟ ou tecnologias derivadas daquelas, como as sondas TaqMan®. 
 
 Sondas primers ‘Scorpion’ e ‘Sunrise’ 
 
Os primers „Scorpion‟ não requerem a extensão da cadeia complementar, 
bloqueando a sua extensão para assegurar que a estrutura em alça da sonda é apenas 
quebrada durante a hibridização específica. Num primeiro passo, o primer „Scorpion‟ é 
extendido no DNA alvo, seguindo-se a sua desnaturação e respectiva dissociação. 
Posteriormente durante a reacção da PCR, a sonda „Scorpion‟, na presença da sequência 
alvo, provoca a separação do fluoróforo e do quencher, com o respectivo aumento da 
fluorescência emitida. Já os primers „Sunrise‟ requerem a duplicação da cadeia oposta para 
que a estrutura hairpin possa ser desfeita. Este fenómeno separa os marcadores eliminando 
o quenching de uma maneira similar às sondas hairpin (Fig. 18) (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 
Figura 18 – Representação esquemática da estrutura e modo de funcionamento das 
oligosondas primer „Sunrise‟ e „Scorpion‟ (Adaptado de Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
 Sondas TaqMan® 
 
 A tecnologia TaqMan® é uma variação dos molecular beacons, desenvolvida por 
Perkin Elmer e descrita por Holland e colaboradores, em 1991, que lançou a base das 
oligosondas fluorogénicas. Esta destina-se à detecção de sequências específicas nos 
fragmentos de DNA amplificados na PCR (Holland et al., 1991; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
A detecção e monitorização da actividade exonucleotídica 5‟‐3‟ da Taq DNA polimerase é 
fundamental nesta tecnologia, sendo utilizados para tal, dois primers específicos de uma 
determinada sequência de DNA e uma sonda Taqman® homóloga à região do fragmento 
de DNA entre os primers (Mackay et al., 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
A sonda apresenta na extremidade 3‟ uma molécula que aceita a energia da 
molécula repórter e a dissipa na forma de luz ou calor, designada na literatura como 
quencher e na extremidade 5‟ um fluorocromo repórter (Heid et al., 1996; Pelt-Verkuil et 
al., 2008). A proximidade física da molécula repórter e do quencher no princípio da análise 
suprime a detecção da fluorescência daquele pela transferência de energia Förster (Pelt-
Verkuil et al., 2008; Oliveira, 2009). Na fase de hibridação do PCR, as sondas vão-se ligar 
à sequência alvo com a qual apresentam uma total complementaridade (Fig. 19). 
Posteriormente, as sondas TaqMan® hibridizam e são detectadas pela enzima Taq DNA 
polimerase que a hidrolisa pela sua actividade exonucleotídica 5‟-3‟ (Fig. 20). Este 
processo conduz à separação do quencher da molécula repórter, durante a extensão 
Primer ‘Scorpion’ 
Primer ‘Sunrise’ 
resultando num aumento exponencial da intensidade de fluorescência até um ponto onde 
pode ser detectado, ultrapassando o limiar CT (Novais e Pires-Alves 2004; Ferro 2005; 
Pelt-Verkuil et al., 2008). É possível então estabelecer uma relação inversa entre o número 
de moléculas de DNA iniciais na reacção e o valor de CT, que é a base para os cálculos na 
PCR em tempo real. (Alonso et al., 2003). 
 
 
 
 
 
Figura 19 - Hibridação das sondas TaqMan®. R: molécula repórter (emite fluorescência), 
Q: Quencher (absorve fluorescência da sonda intacta) (Adaptado de 
http://www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico_2009/13_PCR_tempo_real.pdf, acedido a 26.11.2009).Figura 20 – Hidrólise das sondas TaqMan®. R: molécula repórter (emite fluorescência), 
Q: Quencher (absorve fluorescência da sonda intacta) (Adaptado de 
http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Pierce/realtimepcr.htm, acedido a 10.02.2010). 
 
O recurso à sonda TaqMan® provou ser um método muito específico para 
determinar a presença ou ausência de sequências específicas. Trata-se de uma tecnologia 
bastante rápida, com elevada sensibilidade e precisão e menor risco de contaminação. 
Além do mais, é uma técnica que pode ter viabilidade de automatização, não necessita de 
processamento da amostra pós‐PCR e permite que diversos tipos de análises sejam 
realizados simultaneamente. Contudo é um método relativamente dispendioso, pelo facto 
de exigir duas moléculas (repórter e quencher) ligadas às extremidades da sonda, e 
complexo em termos de planeamento pois requer uma amplificação e uma hidrólise 
eficientes (Novais e Pires-Alves 2004; Mackay et al., 2007; Oliveira, 2009). 
 
 
 
 Sondas de hibridização FRET (método non-quenching) 
 
 Outra aplicação do princípio FRET não tem por base a absorção da fluorescência da 
molécula repórter, mas sim o aumento da fluorescência da molécula repórter. Corresponde 
no essencial a um par de oligonucleótidos (sondas) que estão marcados com um composto 
fluorescente. Nesta metodologia uma molécula dadora transfere energia para uma molécula 
receptora, que por seu turno emite fluorescência com intensidade crescente. Para tal, uma 
das sondas é marcada com fluoróforo na extremidade 3‟, e a outra sonda é marcada com 
outro fluoróforo na extremidade 5‟. As sequências das duas sondas são escolhidas por 
forma a que estas hibridizem em locais adjacentes do DNA alvo. Após hibridizarem, os 
dois fluoróforos estão posicionados na proximidade um do outro. Quando o fluoróforo é 
excitado emite fluorescência e por sua vez excitará o fluoróforo da outra sonda que emitirá 
também fluorescência. A sonda receptora só irá absorver a fluorescência emitida pela 
primeira, quando as duas sondas se encontrarem ligadas a uma curta distância na cadeia de 
DNA (Fig. 21) (Ferro 2005; Carvalho 2007; Pelt-Verkuil et al., 2008). 
O recurso a sondas de hibridização apresenta diversas vantagens, nomeadamente, 
elevada especificidade do método (a fluorescência é o resultado directo da hibridização de 
duas sondas independentes), a não dependência da acção da actividade exonucleotídica da 
polimerase, pode-se acompanhar a temperatura de melting das sondas e a facilidade do 
desenho, síntese e optimização (Carvalho, 2007). 
As sondas de hibridização FRET têm sido utilizadas com sucesso em protocolos da 
PCR em tempo real destinados a determinar a presença ou ausência de focos de mutação 
nos produtos da PCR (Pelt-Verkuil et al., 2008). 
 
Figura 21 – Representação do método de acção da sonda FRET (Adaptado de 
http://www.medunigraz.at/zmf/mb/image_fret.html, acedido a 10.02.2010). 
 
 A tabela 4 apresenta um sumário das características mais distintivas entre as sondas 
de sequência específica e dos corantes intercalantes. 
 
Tabela 4 – Características distintivas entre as sondas de sequência específica e os corantes 
intercalantes. 
 
Sondas de sequência específica Corantes intercalantes 
Elevada sensibilidade e especificidade Baixa especificidade 
Possibilidade de sesenho de novas 
sondas sempre que necessário 
Maior simplicidade 
Complementares a uma determinada 
zona do fragmento amplificado e são 
marcadas com um fluoróforo 
Intercalam-se na dupla cadeia de DNA em 
formação 
Especifico para o fragmento que se 
deseja detectar 
Inespecífico para o fragmento que se pretende 
detectar 
Exemplos: TaqMan® (sonda de 
hidrólise); Primers ‘Scorpion’ (sondas 
de hibridação). 
Exemplos: SYBR® Green, LCGreen® Plus e 
EvaGreen® 
 
 
2.4. Análise dos resultados obtidos 
 
A análise das curvas de melting é uma abordagem clássica largamente utilizada 
para proceder à análise dos resultados obtidos na PCR em tempo real. Estas curvas 
representam a temperatura em função da fluorescência e dependem do tamanho e 
composição em bases do produto amplificado. Frequentemente obtêm-se através de 
aumentos sucessivos da temperatura nos poços da reacção até se perder a fluorescência 
devido à desnaturação do DNA. Quando se atinge a temperatura de melting da sequência 
alvo observa-se uma quebra abrupta da fluorescência; caso se observem diminuições 
adicionais da fluorescência tal pode representar contaminação ou insuficiente 
especificidade dos parâmetros do PCR. A temperatura de melting de cada produto de 
amplificação depende do seu conteúdo em guanina e citosina (G+C), comprimento e 
características da sequência, permitindo distinguir diferentes produtos da PCR. Este 
método tem sido utilizado para avaliar a extensão de potenciais ligações não específicas do 
corante a qualquer produto de dupla cadeia, incluindo dímeros de primers (artefacto 
originado pela interacção de dois primers durante a fase de extensão do PCR, com 
subsequente formação de um produto da PCR pela extensão a partir da extremidade 3‟ de 
um ou de ambos os primers) e produtos de amplificação não específicos (Espy et al., 2006; 
Mackay et al., 2007). 
As principais vantagens das curvas de melting estão relacionadas com a 
possibilidade da confirmação da(s) sequência(s) do(s) produto(s) da PCR, com a sua alta 
especificidade (cada produto tem a sua própria temperatura de melting), com o reduzido 
risco de contaminação (o capilar utilizado é fechado), com o facto de diferenciar produtos 
da PCR específicos dos inespecíficos e com a possibilidade de caracterizar polimorfismos 
de inserção/delecção, genotipar SNPs e detectar mutações (Espy et al., 2006; Carvalho, 
2007; Mackay et al., 2007). 
 
 Análise HRM 
 
 A análise HRM (High Resolution Melting) é um método pós-PCR bastante recente, 
homogéneo, rápido, simples e que se realiza em sistema fechado, que foi desenvolvido 
tendo por base as enormes potencialidades da análise clássica das curvas de melting. É uma 
técnica que consiste na caracterização de amostras de DNA de acordo com seus 
comportamentos de dissociação durante a transição de DNA dupla cadeia para DNA de 
cadeia simples com o aumento da temperatura, recorrendo a corantes fluorescentes 
intercalantes que se ligam ao DNA de dupla cadeia, sendo o fenómeno monitorizado 
através da PCR em tempo real. Estes corantes apresentam baixa toxicidade para a reacção, 
podendo portanto ser usados em concentrações elevadas a fim de saturar toda a dupla 
cadeia de DNA das amostras. Isso significa, que os sinais de fluorescência medidos têm 
maior fidelidade (sensibilidade e resolução), aparentemente devido à menor proporção de 
redistribuição de corante das regiões desnaturadas para aquelas ainda em dupla cadeia. 
Durante a PCR, quando ocorre a desnaturação do DNA a fluorescência desaparece 
originando a curva de melting. As diferenças da composição de bases do DNA podem ser 
detectadas e comparadas através da curva e temperatura de melting (Tm). A análise dos 
dados é feita com um software específico (Reed, et al., 2004; Krypuy, et al., 2006; 
Herrman et al., 2007; Tesoriero, 2008; Villela et al., 2010). 
Entretanto, para o sucesso de ensaios de HRM são exigidos certos requisitos, 
nomeadamente (Tesoriero, 2008): 
 Utilização de equipamentos com elevada intensidade e elevada sensibilidade 
óptica; 
 Captura de dados com rapidez; 
 Controlo rigoroso e muito preciso; 
 Análise de fragmentos de DNA até 250 pb. Produtos maiores podem ser 
analisados, porém com menor resolução; 
 Análise exclusiva do(s) produto(s) da PCR, uma vez que amostras