Exercício Reação em cadeia da Polimerase - Técnicas e Aplicabilidade do PCR

Prévia do material em texto

Estudo Dirigido
Através da reação em cadeias da polimerase (Polymerase Chain Reaction) pode- se amplificar muito o número de cópias de um segmento de DNA, considerando que, é necessário conhecer a sequência das partes flanqueadoras de um segmento de DNA o qual será clonado. O processo de amplificação requer em três etapas a primeira delas é separada as fitas de DNA através do aquecimento. Na segunda etapa acontece o anelamento dos oligonucleotídeos que são os indicadores sintéticos da replicação que pode se estender pelo DNA polimerase, ressaltando que o DNA isolado o qual contém o segmento a ser amplificado, é aquecido, depois resfriado e em todo esse processo não se desnatura e permanece ativa, pois a Taq DNA polimerase consiste numa enzima extraída da bactéria Thermus aquaticus encontrada em fontes hidrotermais com temperatura de 75º C, portanto é termoestável resistente a elevadas temperaturas. Dentre os indicadores usados por PCR com o acréscimo dos sítios de clivagem de endonuclease de restrição, pode-se criar extremidades coesivas, que serão usadas na ligação do DNA amplificado a um vetor	de	clonagem. Na terceira etapa com a adição dos quatro desoxinucletídeos trisfosfatos e o segmento de DNS iniciado e replicado seletivamente. Todas as etapas são repetidas 25 a 30 vezes e através da polimerização o novo DNA é sintetizado. (NELSON; COX, 2006, pp:315-318) Os reagentes utilizados nesse processo são, a solução tampão que garante Ph e concentração iônica adequada para a reação, a Taq-Polimerase, os primers, H2O, deoxinucleotídeos trisfosfato que colaboram na construção das moléculas de DNA,o DNA extraído da amostra e o Mg+2 que é usado eventualmente para otimizar a reação. (UFMG) 
Destaco duas variações da técnica de PCR tradicional a Nested PCR e Multiplex PCR.
Nested PCR é uma técnica onde utiliza o produto amplificado de uma primeira PCR como molde com a finalidade de aperfeiçoar a especificidade e a eficiência da reação. Desta maneira, a partir de primers que se hibridizam no interior de produto da primeira reação, um produto amplificado é reamplificado. São utilizados dois primers, sendo um mais externo usado na primeira reação onde necessita de um tempo maior de extensão, pois o produto é maior e o outro primer é interno ao produto da primeira reação.
Sendo assim, como dito antes para melhorar a eficiência da reação o segmento genômico é amplificado inicialmente de forma ampla e posteriormente aplicando a amplificação da real sequência-alvo. Mesmo que está técnica demande mais tempo, seja necessário usar mais reagentes e o risco de contaminação é maior, a sua aplicabilidade é útil quando a quantidade de DNA para se detectar é pequena e quando existem impurezas nas amostras as quais podem inibem a amplificação do DNA.
Multiplex PCR baseia-se em uma técnica onde mais de um segmento genômico é amplificado em uma única reação, ou seja, é amplificado simultaneamente mais de uma sequência de DNA, destacando que cada um com seu par de primers específico. E essa técnica tem como finalidade promover especificação entre diferentes espécies ou gêneros. As suas vantagens estão no pouco tempo utilizado, baixo custo e pelo aumento no número de genes que podem ser amplificados de uma só vez. Porém trás como desvantagens, a presença de múltiplos primers o que pode levar a adição de um primer errado a um molde e também levar a hibridação entre os mesmos. (VIEIRA, p. 8-9)
Já a PCR de origem, é uma técnica feita pelo processo em cadeia da polimerase que pode amplificar uma única molécula de DNA ou RNA vários bilhões de vezes em algumas horas. É uma amplificação enzimática de um fragmente de DNA de interesse que se localizam entre dois primers oligonucleotídiocos. É realizada com a utilização de uma DNA polimerase que faz novas fitas derivadas do molde, promovendo a duplicação das cadeias de DNA por meio da variação de temperatura, iniciadores os primers e uma polimerase termoestável. Como vantagens permitem avaliar uma sequência precisa de DNA de forma rigorosa e com uma elevada especificidade e sensibilidade e também apresenta custo reduzido, assim como as demais técnicas apresentadas a cima. Poém tem como desvantgens a facilidade de contaminação, pode ocorrer incororações erradas de base e é necessário o conhecimento da sequência de DNA de interesse a ser amplificado.
(NUSSBAUM, R. L.; MCINNES, R. R.; MD; PhD; WILLARD, H. F., 2002. Pp: 38-40)
A aplicação de PCR está muito presente em laboratórios, pesquisas, testes genéticos, diagnósticos e nas práticas em ciências forenses. A técnica já se aplica na clonagem de fragmentos de DNA de humanos mumificados e animais extintos, trazendo novas perspectivas para o campo da arqueologia e paleontologia molecular, sendo que, os DNAs colhidos nesses campos já estão sendo aplicados por PCR e utilizados em migrações humanas. Também se utiliza na investigação criminal e investigação de paternidade. (UFPE).
É importante salientar que a técnica de PCR contribui para o diagnóstico do Protozoário Trypanosoma cruzi, Mycobacterium tuberculosis, Hepatite c dentre outra patologias. Ela possibilita a ciência da saúde uma ferramenta de suma importância para o analise e evolução de vírus patogênicos humanos e pode contribuir para a descoberta e diagnostico precoce de patologias genéticas e infecções virais. (NELSON; COX, 2006, pp: 316)
Referências:
NELSON, D. L; COX, M. M. Lehninger Princípios de Bioquímica. 4° ed. São Paulo:Scavier, 2006. Pp:315-318.
NUSSBAUM, R. L.; MCINNES, R. R.; MD; PhD; WILLARD, H. F. THOMPSON & THOMPSON Genética Médica. 6° ed. Rio de Janeiro, Editora: Guanabara Koogan S.A, 2002. Pp:38-40.
 
VIEIRA, D. P. Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. Disponível em: http://www.imt.usp.br/wp-content/uploads/proto/protocolos/aula1.pdf. Acesso em: 08 nov. 2017. Pp: 6-9. 
http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/pcr2.htm 
https://www.ufpe.br/biolmol/aula7_PCR-RAPD-licar.htm