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Universidade Estácio de Sá Curso de Farmácia Apostila de Aulas Práticas de Farmacognosia 2 Prof. M. Sc. Eduardo Nunes da Fonseca Agosto de 2010 2 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Sumário Assunto Página 1 – Apresentação. 3 1.1 – Introdução. 3 1.2 – Objetivos. 3 1.3 – Normas Gerais 4 1.4 – Normas para avaliação. 5 1.5 – Normas de Segurança no Laboratório. 7 2 – Desenvolvimento. 1ª Aula prática: Extração de óleos essenciais ricos em fenilpropanóides. 2 ª Aula prática: Cromatografia em camada fina do óleo essencial rico em fenilpropanóides. 3ª Aula prática: Extração de flavonóides em drogas vegetais. 3ª Aula prática: Determinação de cumarinas em drogas vegetais. 4ª Aula prática: Extração e caracterização de taninos em drogas vegetais. 5ª Aula prática: Extração e caracterização de alcalóides em drogas vegetais. 6ª Aula prática: Extração e caracterização da pilocarpina no Jaborandi e Reação de Vitali em ampola de atropina. 7ª Aula prática: Reação da Murexida em pó de café, folhas de chá verde, pó de guaraná e pó de mate: 3 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 1 Apresentação 1.1 Introdução Bem vindos ao curso prático de Farmacognosia 2, do Curso de Farmácia da Universidade Estácio de Sá. No decorrer deste curso iremos desenvolver atividades que visam um maior aprendizado e que ajudem na fixação e consolidação dos conhecimentos adquiridos nas aulas teóricas. A disciplina Farmacognosia 2 é uma das Ciências Farmacêuticas e consta da grade curricular do Curso de Farmácia da Universidade Estácio de Sá no sexto período. Como pré-requisitos a disciplina está a disciplina Farmacognosia 1. Pede-se também que o aluno já tenha cursado a disciplina de Bioquímica, Farmacodinâmica 1, Química Orgânica 3 e Farmacobotânica, uma vez que a Farmacognosia 2 vai consolidar e relacionar o conhecimento de todas as disciplinas supracitadas. 1.2 Objetivos 1. Introdução do aluno na ciência da Farmacognosia, uma das disciplinas específicas do profissional farmacêutico. 2. Aplicar os conhecimentos obtidos em outras disciplinas, integrando-os na vida profissional do aluno. 3. Desenvolver atividades de Laboratório com a finalidade de aplicar os conhecimentos adquiridos. 4. Introdução do aluno a aspectos gerais da disciplina como a produção, extração e controle de qualidade de drogas vegetais. 5. Apresentar, de forma clara e objetiva, o metabolismo vegetal e as principais classes de produtos naturais. Além dos processos de extração, identificação, controle de qualidade, falsificações e as principais drogas vegetais. 4 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 1.3 Normas Gerais • A chamada será realizada em todas as aulas, sendo o limite máximo de atraso tolerado de 20 minutos, depois de decorrido esse tempo o aluno não poderá entrar no laboratório, realizar a prática ou fazer qualquer avaliação. • Não há abono de faltas, fora nos casos previstos em lei, logo, não é tarefa pertinente ao professor avaliar ou considerar os motivos que levaram o aluno à não estar presente. • No decorrer do semestre letivo, o professor lança as freqüências dos alunos no diário de classe e Sistema Acadêmico Integrado (SIA) e, excedendo 25% do total de aulas ministradas, o discente ficará reprovado por faltas, INDEPENDENTE do seu rendimento acadêmico, por absorção do conteúdo ministrado. No caso da disciplina Farmacognosia 2, computando as aulas teóricas e práticas o aluno tem como limite de faltas de 5 aulas. • Cabe lembrar que nos dias relativos as provas (AV1 e AV2) a presença será cobrada, estando presente apenas os alunos que fizerem a prova e conseqüentemente assinarem a ata de presença. • O uso de aparelhos celulares, pagers ou qualquer equipamento eletrônico de comunicação fica proibido durante as aulas teóricas e práticas além de dias de prova. • O calendário de aulas teóricas e práticas será disponibilizado pelo professor no primeiro dia de aula estando sempre afixado no Laboratório de Farmacognosia, qualquer mudança no mesmo deve ser exposta ao aluno com discussão prévia. 5 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 1.4 Normas para avaliação 1- De acordo com a Resolução Nº 035/CONSEPE/2006/AR, que aprova a mudança do processo de avaliação dos alunos dos Cursos de Graduação e de Graduação Tecnológica, comunicamos que, a partir do primeiro semestre de 2010, será adotado o seguinte critério: a- Para as disciplinas que concedem nota, o aluno será avaliado em três etapas – AV-1, AV-2 e AV-3, sendo a cada uma delas atribuído grau de 0,0 (zero) a 10,0 (dez) pontos, admitindo-se uma decimal; b- Para aprovação, nessas disciplinas, o aluno deverá atender, simultaneamente, às duas condições a seguir: · ter freqüência mínima de 75%; · alcançar média aritmética igual ou superior a 60 (cinco), dentre as duas maiores notas, sendo que a menor delas deve ser igual ou superior a 4,0 (quatro). c- O resultado da média obtida no item anterior será o grau final do aluno. 2- Exemplos: a- AV-1 = 3,0 AV-2 = 8,0 AV-3 = 2,0 · A menor nota será desconsiderada ( AV-3 = 2,0 ); · Considerando que entre as duas maiores notas (AV-1 e AV-2) existe uma nota menor que 4,0 (AV-1), o aluno estará reprovado. b- AV-1 = 6,0 AV-2 = 3,5 AV-3 = 7,0 · A menor nota será desconsiderada ( AV-2 = 3,5 ); · Considerando que as duas maiores notas (AV-1 e AV-3) são maiores que 4,0, a média aritmética do aluno será : AV-1 + AV-3 = 6,0 + 7,0 = 13,0 = 6,5 - O aluno estará aprovado com grau final 6,5. c- AV-1 = 3,0 AV-2 = 4,0 AV-3 = 6,0 6 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 · A menor nota será desconsiderada ( AV-1 = 3,0 ); · Considerando que entre as duas maiores notas ( AV-2 e AV-3 ), a menor nota é igual a 4,0, a média aritmética do aluno será : AV-2 + AV-3 = 4,0 + 6,0 = 10,0 = 5,0 - O aluno estará reprovado com grau final 5,0. d- AV-1 = 8,5 AV-2 = 2,5 AV-3 = 3,0 · A menor nota será desconsiderada ( AV-2 = 2,5 ); · Considerando que entre as duas maiores notas (AV-1 e AV-3) existe uma nota menor que 4,0 (AV-3), o aluno estará reprovado. e- AV-1 = 3,0 AV-2 = 4,0 AV-3 = 5,0 · A menor nota será desconsiderada ( AV-1 = 3,0 ); · Considerando que entre as duas maiores notas ( AV-2 e AV-3 ), a menor nota é igual a 4,0, a média aritmética do aluno será: AV-2 + AV-3 = 4,0 + 5,0 = 9,0 = 4,5 - O aluno estará reprovado, pois não alcançou o grau final 6,0; No exemplo “b” os alunos serão considerados aprovados, se também obtiverem freqüência mínima de 75%. 7 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 1.5 Normas de Segurança No Laboratório de Farmacognosia 1- Será cobrado obrigatoriamente o uso de jaleco comprido de algodão, não sendo permitido o uso de jaleco de fibras sintéticas; 2- É obrigatório o uso de calçados de couro ou similar. 3- É obrigatório o uso de calças compridas, devendo ser evitado o uso de calças de fibras sintéticas. 4- É obrigatório o uso de óculos de segurança no trabalho em laboratório, os alunosque usam óculos com lentes de grau estão dispensados do uso nas bancadas, mas são obrigados a usá-los quando manipularem reagentes e solventes na capela. As lentes de contato são proibidas porque sofrem ressecamento com solventes orgânicos voláteis; 5- Localize os extintores de incêndio, qualquer incêndio deve ser abafado imediatamente, jogando areia sobre o mesmo e caso seja no jaleco ou em alguma pessoa usar a manta abafadora de incêndios; 6- Localize a caixa de primeiros socorros; 7- Em caso de acidente de laboratório, tenha calma e avise imediatamente ao professor; 8- Proibido fumar no laboratório; 9- Trabalhe sempre acompanhado no laboratório. 10- Mantenha o local de trabalho limpo e deixe-o em ordem ao terminar as operações; Quando a aula prática acabar é obrigatório a lavagem do material usado na mesma, lembrar que o técnico não é faxineiro. 11- Jogue todos os sólidos e pedaços de papel usados num frasco ou cesta para esse fim, inclusive fósforos, papel de filtro ou qualquer sólido, ainda que ligeiramente solúvel; 12- Antes de se retirar do laboratório, verifique se não há torneiras (água ou gás) abertas e lave as mãos; 13- Leia o rótulo dos frascos antes de usar as substâncias neles contidas. Verifique os símbolos de periculosidade e dos seus significados. Qualquer substância ou solução preparada deve ser imediatamente rotulada; 8 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 14- A pipetagem de ácidos, álcalis e de líquidos corrosivos ou venenosos deve ser feita com o auxílio de bulbos de aspiração; 15- A degustação, ingestão e a inalação direta de drogas ou reagentes de laboratório são muito perigosas. Pegar ou tocar com os dedos ou com as mãos pode também trazer conseqüências desagradáveis; 16- Use os reagentes nas quantidades recomendadas pelo professor; 17- Antes de efetuar qualquer alteração nos reagentes recomendados numa prática, discuta as mudanças com o professor; 18- Quando trabalhar com vidraria, proceda com cuidado para evitar quebras e cortes perigosos; 19- Trabalhe com material e instrumentos adequados, principalmente os de vidro que não contenham pontas ou arestas cortantes; 20- Deixe qualquer peça de vidro esfriar durante o tempo necessário. Lembre-se que o vidro quente tem a mesma aparência do que o vidro frio; 21- Ao forçar tubos de vidro ou termômetros através de uma rolha, lubrifique-os previamente e use um pano grosso ou toalha como protetor; 22- A espátula é normalmente recomendada para quebrar sólidos endurecidos nos frascos. O uso de bastão de vidro para essa finalidade é perigoso; 23- Quando uma substância cair no chão ou na mesa, limpe o local imediatamente; 24- Quando for testar um produto químico pelo odor, desloque com a mão para sua direção os vapores que se desprendem do frasco; 25- Dedique especial atenção a qualquer operação que necessite aquecimento prolongado ou desenvolva grande quantidade de energia; 26- Quando aquecer uma substância num tubo de ensaio, aponte a extremidade aberta para uma direção oposta à sua ou à dos seus colegas; 27- Para aquecimento de solventes inflamáveis, mesmo em quantidades pequenas, utilize manta aquecedora. Para evitar super-aquecimento, use pérolas de vidro ou fragmentos de porcelana; 9 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 28- Transfira ou verta solventes inflamáveis de um frasco para outro longe de chama ou de qualquer aparelho elétrico ligado; 29- O aquecimento de um sistema completamente fechado poderá causar explosão; 30- Ao transferir ou manejar substâncias que desprendam gases ou vapores tóxicos, fazê- lo no interior de uma câmara de exaustão (capela) de boa tiragem ou então, num local de boa ventilação; 31- Ao verter um líquido do frasco, evite deixar escorrer no respectivo rótulo, protegendo- o devidamente; 32- Ao proceder com a diluição de um ácido concentrado, adicione-o lentamente e sob agitação sobre o diluente (água, etanol, etc), e nunca o contrário; 33- É proibido permanecer com os cabelos soltos durante toda a aula prática; 34- É proibido comer ou beber dentro do laboratório; 35- É proibido colocar alimentos mesmo fechados sobre a mesa. 36- Lembrar que bancadas não são mesas de estudos, por isso é proibido colocar mochilas, bolsas ou qualquer coisa que não seja o caderno de práticas e caneta, lápis e borracha. 37- É proibido fazer brincadeiras, correr, gritar ou discutir sobre assuntos que não sejam inerentes a aula prática. 38- É proibido a permanência de alunos ao fim da aula prática ou quando o professor não estiver no Laboratório. 39- Ter calma no laboratório é fundamental!!! 40- Consulte sempre o professor em caso de dúvidas !!! Tanto o professor quanto os técnicos tem autonomia para checar qualquer uma das regras citadas acima, caso o aluno não venha a cumprir, seja a mando do técnico ou professor, o mesmo pode ser convidado a se retirar do laboratório e enviado para conversa com a Coordenação do Curso de Farmácia. Lembrar que os técnicos são funcionários da Universidade que têm como funções zelar pelos laboratórios, sendo os mesmos as autoridades quando não houver professores presentes no recinto, montar as aulas práticas e auxiliar os professores durante as aulas. 10 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Dessa forma, os mesmos devem ser respeitados e o não cumprimento pode ocasionar em advertência pelo Professor e Coordenador de Curso. 11 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 2 Desenvolvimento 1ª. Aula Prática: Processos extrativos – Extração do óleo essencial de fenilpropanóides: Fenilpropanóides são derivados que possuem a seguinte estrutura base: Fenil Propano Fenilpropanóides Os fenilpropanóides são provenientes biossinteticamente da via metabólica do ácido chiquímico e são exemplos de fenilpropanóides o aldeído cinâmico, o anetol, o estragol, o eugenol, o safrol, a miristicina e a elemicina. CHO OMe OMe OMe OMe MeO O OOH MeO MeO O O Aldeído Cinâmico Anetol Estragol Eugenol Miristicina SafrolElemicina Os fenilpropanóides são insolúveis em água, podendo ser solúveis em álcoois como o metanol ou etanol, por outro lado são solúveis em solvente orgânicos como o éter, clorofórmio, benzeno, etc. São substâncias voláteis que possuem um odor característico dessa forma caracterizando uma série de óleos essenciais. 12 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Óleos essenciais, segundo a ISO (International Standard Organization), são as misturas lipofílicas obtidas de partes de órgãos de vegetais por processo de hidrodestilação ou obtidas da expressão dos pericarpos de frutos cítricos. A extração dos óleos essenciais será realizada por hidrodestilação usando aparelho próprio de hidrodestilação preconizado na BHP 1996 e FB 4ª edição ou aparelho de Clevenger. Cerca de 100 g de material vegetal é colocado em balão de 1000 mL com água destilada e aquecidos com manta. 13 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Drogas a serem extraídas: Anis estrelado, Cravo, Canela, Erva-doce e Noz moscada. A tabela abaixo mostra as principais drogas cujos óleos essenciais possuem fenilpropanóides. Óleo Espécie Droga Conteúdo de óleo(%) Constituintes típicos (%) Usos Anis Pimpinella anisum Frutos 2-3 Anetol (80-90) Estragol (1-6) Flavorizante, carminativo, aromaterapia Anis estrelado (badiana) Illicium verum Frutos 5-8 Cravo-da-Índia Syzygium aromaticum Flores secas 15-20 Eugenol (75-90) β-cariofileno (3) Flavorizante, aromaterapia e anti-séptico Erva-doce Foeniculum vulgare Frutos 2-5 Anetol (50-70) Fenchona (10-20) Estragol (3-20) Flavorizante, carminativo, aromaterapia Canela da China Cinnamomum cassia Cascas secas 1-2 Ald. Cinâmico (70- 90) Flavorizante, carminativo, aromaterapia Canela do Ceilão Cinnamomum zeylanicum Cascas secas 1-2 Ald. Cinâmico (70- 80) Eugenol (1-13) Flavorizante, carminativo, aromaterapia Noz Moscada Myristica fragans Sementes 5-16 Sabineno (17-28) α e β-pinenos (23- 39) Miristicina (4-8) Elemicina (2) Flavorizante, carminativo, aromaterapia. O odor é proveniente dos fenilpropanóides sendo a miristicina alucinógena. Perguntas sobre a Prática. 1) Os óleos essências podem ser inalados diretamente? 2) Por que alguns óleos essenciais têm odores desagradáveis? 3) Que outras metodologias podem ser empregadas para a obtenção de óleos essenciais? Quais são suas vantagens e desvantagens? Material Necessário para Prática: Drogas Material Quantidade Anis estrelado, Cravo, Canela, Erva-doce, Noz moscada 50 g para o aluno pesar Equipamentos Balança de duas casas decimais 1 Unidades Mantas aquecedoras para balão de 500 mL 7 Unidades Solventes Água destilada 4 l Hexano 1 l Vidraria e Outros Algodão Balão de fundo redondo 500 mL com junta 24/40 7 Unidades Bastão de vidro 7 Unidades Béqueres de 250 mL 7 Unidades Borracha para condensador Espátulas de metal 11 Unidades 18 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Garras 14 Unidades Hidrodestiladores ou aparelhos de clevenger (com junta 24/40) 7 Unidades 19 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 2ª. Aula Prática: Cromatografia em camada fina do óleo essencial rico em fenilpropanóides: Os óleos essenciais extraídos na aula anterior vão ser avaliados por cromatografia fina em camada fina, conforme esquematizado abaixo: O sistema eluente (Fase Móvel) é Tolueno : Acetato de Etila (93:7) Prepara somente na hora do uso, no decorrer da prática fazer 100 mL. O revelador: reagente de vanilina: ácido Sulfúrico. Que deve ser preparado da seguinte forma: Solução 1 – Solução 1 % de vanilina em Etanol (100 mL), caso não dissolva diretamente pode-se proceder com o aquecimento. Solução 2 – Solução 10 % de ácido sulfúrico em Etanol (10 mL de H2SO4 e adiciona cuidadosamente 95 mL de etanol ) deve ser preparado diretamente na proveta adicionando inicialmente o ácido seguido do álcool, cuidadosamente (A MISTURA É EXOTÉRMICA). 20 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Borrifa-se primeiramente a solução 1, seguida imediatamente da solução 2, após evaporação, a placa de cromatografia deve ser aquecida a 110° C em placa de aquecimento (NA CAPELA) por alguns segundos. Sugestões de placas a serem feitas: 1 – Placa com óleo essencial de canela x padrão de aldeído cinâmico. 2 – Placa com óleo essencial de cravo x padrão de eugenol. 3 –Placa resumo com todos os óleos essenciais. Prever a polaridade das moléculas dos fenilpropanóides e fazer uma projeção destas moléculas na placa de cromatografia. CHO OMe OMe OMe OMe MeO O OOH MeO MeO O O Aldeído Cinâmico Anetol Estragol Eugenol Miristicina SafrolElemicina Perguntas sobre a prática. 1) Partindo das estruturas dos fenilpropanóides, nas condições cromatográficas para o experimento da aula prática, como você preveria a separação cromatográfica dos fenilpropanóides, justifique sua resposta. 2) Determine o Rf para as substâncias encontradas na placa de cromatografia. 3) Avaliando a coloração e o Rf para as amostras de óleos essenciais avaliadas, qual seu parecer a respeito da qualidade das amostras. Justifique sua resposta. 21 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Material Necessário para Prática: Drogas Material Quantidade Óleos essenciais extraídos 1 mL Equipamentos Placa de aquecimento 1 Unidades Bomba de vácuo 1 Unidades Reagentes Ácido sulfúrico (em solução alcoólica) Vanilina (em solução Alcoólica) Solventes Tolueno 1 l Acetato de Etila 1 l Vidraria e Outros Algodão Caixa de cromatoplacas – cortar 5 placas com dimensões 10 cm x 5 cm Vidros de relógio c/ 15 cm de diâmetro 5 Unidades Béqueres de 600 mL 5 Unidades Borracha para condensador Pinças 5 Unidades Capilares 10 Unidades Borrifadores de 250 mL 2 Unidades 22 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 3ª. Aula Prática: Extração de flavonóides em drogas vegetais. Os flavonóides são os compostos fenólicos mais abundantes entre os conhecidos na natureza. Seu nome deriva de flavus que significa amarelo em latim, em virtude da cor amarelada destes derivados. As antocianidinas uma classe de flavonóides normalmente são responsáveis pelas cores de flores, sendo importantes para auxiliar a polinização. Quimicamente possuem vários esqueletos, mas os flavonóides mais característicos possuem o anel benzocromona ilustrado abaixo em uma flavona. São ainda muito encontrados ligados a açúcares formando heterosídeos. 23 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Os flavonóides tornaram-se muito importantes após a descoberta da atividade antioxidante característica destas moléculas. Hoje são usados em cosméticos e como medicamentos. Várias plantas medicinais possuem flavonóides, alguns exemplos são o ginkgo, camomila, maracujá, tília, calêndula, sabugueiro, arnica, crataegus entre outras. 1 – Extração. Pesar cerca de 2-3g de droga e adicionar 50 mL de etanol (EtOH) em becher de 250 mL, aquecer em placa de aquecimento por 10 minutos a 60°C, cobrir com vidro de relógio. Após a extração filtre com funil e algodão (ou papel de filtro) para um becher e a solução será usada nos testes abaixo: 2 – Reações dos flavonóides. 2.1) Reação da cianidina: Técnica: Em um tubo de ensaio transferir parte da solução do becher, junte 10 gotas de ácido clorídrico concentrado e um fragmento de magnésio metálico. A formação de cor vermelha, rósea ou castanha indica a presença de flavonóides. 2.2) Reação com hidróxidos alcalinos: Técnica: Em um tubo de ensaio transferir parte da solução do becher, adicione 20 gotas uma solução diluída de hidróxido de sódio 1N e a solução adquire coloração amarela e às vezes precipitado amarelo. 24 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 25 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática defarmacognosia 2 3ª. Aula Prática: Determinação de cumarinas em drogas vegetais. As cumarinas são lactonas derivadas dos fenilpropanóides e possuem esqueleto característico, como mostrado abaixo, na cumarina e umbeliferona espectivamente: As cumarinas foram inicialmente descobertas pelas suas propriedades anticoagulantes, que são usadas até hoje como a varfarina. Hoje em dia são usadas ainda como pigmentadores para pele em pessoas que sofrem de vitiligo como os psoralenos. Várias plantas medicinais possuem cumarinas, alguns exemplos são o guaco, camomila, jaborandi, angélica, maracujá, tília entre outras. Procedimento para detecção das cumarinas 1 – Extração. Pesar cerca de 2-3g de droga e adicionar 50 mL de metanol (MeOH) em becher de 250 mL, aquecer em placa de aquecimento por 10 minutos a 50°C, cobrir com vidro de relógio. Após a extração filtre com funil e algodão (ou papel de filtro) para um becher e evaporar o metanol em banho-maria na capela. 2 – Hidrólise das cumarinas. Ao extrato obtido no becher adicionar cerca de 25 mL de água destilada e 5 gotas de ácido clorídrico (HCl) concentrado, aquecer em banho-maria por mais 40 minutos. 26 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Após o aquecimento filtrar novamente para um bécher de 50 mL, adicionar 25 mL de água destilada e mais 5 mL de hidróxido de amônia 6 N (NH4OH). Após agitar use placas de petri para transferir o conteúdo do becher e expor a luz ultravioleta de comprimento 365 nm. O aparecimento da fluorescência na solução indica a presença das cumarinas. 27 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 28 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 4ª.Aula Prática: Extração e caracterização de taninos em drogas vegetais: Os taninos são macromoléculas fenólicas, amplamente distribuídas na natureza. São responsáveis pela adstringência características de algumas plantas e de frutos verdes. Os Taninos são extremamente hidrofílicos e são classificados em hidrolisáveis e condensados. Plantas com taninos sempre foram muito utilizadas para diarréias, como antiinflamatórios e para aftas. Além disso, para fabricação de tintas e borracha, além de utilizada para curtir o couro. Várias plantas medicinais possuem taninos, alguns exemplos são o crataegus, romã, hamamelis, barbatimão entre outras. Procedimento para detecção dos taninos 1 – Extração. Pesar cerca de 5g de droga e adicionar 100 mL de água destilada em becher de 250 mL, aquecer em placa de aquecimento por 10 minutos a 100°C, cobrir com vidro de relógio. Após a extração filtre com funil e algodão (ou papel de filtro) para um becher e a solução será usada nos testes abaixo: 2 – Reações dos taninos 2.1) Reação com a gelatina. Em um tubo de ensaio, tome 5 mL de solução extrativa junte 5 gotas de ácido clorídrico diluído 1N e depois, a solução de gelatina 2,5 % gota-a-gota, para evitar a 29 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 solubilização do precipitado formado. Centrifugar para visualizar o precipitado que indica taninos. Serão usados Hamamelis e Cratego: Extração do material vegetal: Ferva, durante 5 minutos, 50 g de fármaco pulverizado em 250 mL de água. Filtre e complete o volume por adição de água fria. A) Reação com a gelatina. Em um tubo de ensaio, tome 5 mL de solução extrativa junte algumas gotas de ácido clorídrico diluído e depois de 2-3 mL da solução de gelatina 2,5 % gota-a-gota. O ácido é necessário para evitar a solubilização do precipitado formado. Preparação da solução de gelatina 2,5 % contendo 10 % de cloreto de sódio. Fazer um pacote de gelatina incolor (procedimento normal adicionar água quente depois água fria e colocar na geladeira). Quando a gelatina estiver pronta pese 25 g e mergulhe, durante algumas horas, em 1 litro de solução aquosa de cloreto de sódio 10 %; aqueça depois em banho-maria até a dissolução. Deixe esfriar e complete o volume anterior em balão volumétrico de 1 L. Atenção fazer com 2 dias de antecedência. Para conservação da solução adicionar 50 mg de nipazol, e conservar em geladeira, validade da solução com conservante 6 meses, sem 1 semana. B) Reação com sais de ferro. Num tubo de ensaio adicione 5 mL da solução extrativa mais 5 mL de água e gotas da solução de FeCl3: Anote a cor da solução ou do precipitado. Cor verde-marrom indica tanino condensado e de azul-preto tanino hidrolisável, caso haja precipitado com a gelatina. Caso necessário centrifuge os dois precipitados. 30 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 31 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 5ª.Aula Prática: Detecção de alcalóides em drogas vegetais, usando reagentes de precipitação: Os alcalóides foram os primeiros derivados dos vegetais que despertaram grande interesse farmacológico, isto porque muitos possuem várias atividades farmacológicas como a cocaína, atropina, morfina entre vários outros. O termo alcalóide é usado para classificar as moléculas básicas (aminas) oriundas das plantas, entretanto mais recentemente estudos mostram que estas moléculas possuem várias classificações de acordo com sua origem. Várias plantas medicinais possuem alcalóides, mas normalmente a quantidade é bem reduzida. Procedimento para detecção dos alcalóides. 1 – Extração. Aqueça, à fervura, 5 g de droga grosseiramente dividida e 50 mL de solução de HCl 1 N, filtre a quente. Com auxílio de uma solução de NaOH 40% alcalinize a solução extrativa até pH superior a 9. Resfrie cuidadosamente a solução e a coloque em uma ampola de decantação de 250 mL. Faça a extração desta solução com 2 x 20 mL de éter etílico e após a extração, juntar as fases orgânicas. Observação (O éter a ser utilizado deve ser o éter etílico, não usar éter sulfúrico pois este vem misturado com etanol e não formará duas fases com a água. Clorofórmio também pode ser usado mas este gera muita emulsão entre as duas fases, não usar hexano uma vez que este é muito lipofílico) Depois do repouso conveniente, separe a solução etérea e agite-a, numa outra ampola com 25 mL de HCl 1 N. Distribuir a fase aquosa original (FA1) em 5 tubos de ensaio e fazer o mesmo com a fase orgânica da extração do ácido clorídrico (FO2). 32 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 2 – Detecção dos alcalóides e ácidos aminados. A partir dos 5 tubos pingue 5 gotas de cada reagente conforme quadro abaixo. Tubo 1 - branco Tubo 2 – Reagente de Dragendorff Tubo 3 – Reagente de Meyer Tubo 4 – Reagente de Bertrand Tubo 5 – Reagente de Bouchardat Fase Aquosa 1 Fase Orgânica 1 A presença de precipitado em qualquer tubo da fase aquosa indica a presença de ácidos aminados ou alcalóides quaternários, já a presença de precipitado em qualquer tubo da fase orgânica indica a presença de alcalóides. Sugestão ao professor, fazer 10 mL de solução a 1% de padrões como cafeína e sulfato de atropina para 5 g de droga Extrair com HCl. Neutralizar com NaOH Transferir para funil de decantação e extrair a fase aquosa com 2 x 20 mL deÉter etílico Fase aquosa 1 (FA1) Fase orgânica 1 (FO1) Extrair com HCl 1 N Fase aquosa 2 (FA2) Fase orgânica 1 (FO1) 33 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Todos os reagentes são vendidos comercialmente com exceção do reagente de Bertrand que é preparado como descrito abaixo: Reagente de Bertrand: Dissolva 5 g de ácido silíco-túngstico em 100 mL de água. Reagente de Dragendorff Solução 1 dissolva 0,85 g de subnitrato de bismuto em 10 mL de ácido acético glacial e 40 mL de água sob aquecimento. Se necessário filtre. Solução 2 dissolva 8 g de iodeto de potássio em 30 mL de água. Misture a solução 1 e 2 na proporção de 1:1 e armazene. (Guardar ao abrigo da luz) À cada mililitro de solução armazenada deve-se adicionar 2 mL de ácido acético glacial e 10 mL de água (SOMENTE NA HORA DE UTILIZAÇÃO). Reagente de Meyer Dissolva, em água, 2,71 g de cloreto de mercúrio e 10 g de iodeto de potássio, complete o volume a 200 mL com mais água agite e filtre. 34 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 35 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 36 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 6ª.Aula Prática: Extração e caracterização da pilocarpina no Jaborandi e Reação de Vitali em ampola de atropina: Dando continuidade a análises de alcalóides, faremos reações específicas para alcalóides. 1 - DETECÇÃO DA PILICARPINA NO JABORANDI. Método de Helche Procedimento A 5 g de Jaborandi adicione 4 mL de amônia 6 N e junte 30 mL de clorofórmio, agite durante 2 minutos e filtre com sulfato de sódio para uma cápsula de porcelana. Na capela em banho-maria evapore o clorofórmio. Dentro da própria capsula de porcelana (NA CAPELA) dissolva o resíduo num pequeno volume de água (2-3 mL), junte-lhe por fim 5-10 gotas de ácido sulfúrico concentrado, 20 gotas de peróxido de hidrogênio (deve ser conservado em geladeira), 1 mL de clorofórmio e uma partícula (ponta de espátula) de dicromato de potássio. Caso o clorofórmio torne-se de violeta azulado, indica a presença de pilocarpina. 2 – REAÇÃO DE VITALI PARA AMPOLAS DE ATROPINA Coloque o conteúdo de 5 ampolas de sulfato de atropina em uma cápsula de porcelana e evapore a secura, na placa de aquecimento a 100°C, na capela. Após a evaporação coloque 5 gotas de HNO3 concentrado e deixe por mais 3 minutos sob aquecimento em placa, retire da placa. Após esfriar o resíduo é solubilizado em 1-2 mL de acetona e tratado com solução alcalina de KOH 5%/Etanol. O aparecimento de coloração carmim indica alcalóide tropânico. (atropina, escopolamina ou cocaína). 37 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Obs: para preparar a solução de KOH, dissolva 5g de KOH na menor quantidade possível de água sob banho de gelo, e depois adicionar etanol até 100 mL. A solução degrada de 24 a 72h por isso não usar quando adquirir coloração castanha. 38 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 39 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 7ª.Aula Prática: Reação da Murexida em pó de café, folhas de chá verde, pó de guaraná e pó de mate: As metilxantinas são consideradas por muitos autores como alcalóides púricos ou purínicos. Estas moléculas são caracterizados pelo núcleo púrico, o mesmo das bases nitrogenadas do DNA adenina e guanina, sendo as metilxantinas os alcalóides mais consumidos no mundo. O principal representante desta classe é a cafeína ou 1,3,7-trimetilxantina, sendo a teofilina e teobromina outras metilxantinas com efeitos farmacológicos. Parte experimental Isolamento da cafeína: Aqueça até a fervura cerca de 5 g de material pulverizado, 50 mL de ácido sulfúrico 2 %, assim que ferver filtre. A cerca de 20 mL do filtrado junte 3 mL de hidróxido de amônia 6 N e agite em ampola com 20 mL de clorofórmio. Decante o 40 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 clorofórmio e filtre com sulfato de sódio anidro para uma cápsula de porcelana. Leve a cápsula para um banho-maria e evapore o clorofórmio (NA CAPELA). Reação da murexida: Ao resíduo da extração das metilxantinas contido na capsula de porcelana, junte 10 gotas de ácido clorídrico 6 N e 10 gotas de peróxido de hidrogênio concentrado e evapore em banho Maria. Deve-se formar um precipitado de cor vermelha. Junto ao resíduo evaporado adicione gotas de amônia 6 N: o líquido adquire coloração violeta. Recomenda-se fazer a reação da murexida com padrão de cafeína. Material necessário para prática: Montar 6 grupos. Drogas Material Quantidade Pó de café 50 g Erva mate 50 g Pó de guaraná 50 g Chá verde 50 g Cafeína (padrão) 100 g Equipamentos Placa de aquecimento grande 1 unidade Balança 2-3 unidades Banho-maria 2-3 unidades Solventes e reagentes Clorofórmio 1 L Ácido sulfúrico 1 L Hidróxido de amônia 1 L 41 Universidade Estácio de Sá – Curso de Farmácia – Apostila de prática de farmacognosia 2 Sulfato de sódio anidro 500 g Ácido Clorídrico 1 L Peróxido de hidrogênio 1 L Soluções Ácido sulfúrico 2% 1 L Hidróxido de Amônio 6 N 500 mL Ácido Clorídrico 6 N 200 mL Vidrarias e outros Béquer de 250 mL 12 unidades Espátula de metal 6 unidades Funil pequeno 6 unidades Garra tipo aro 12 unidades Ampola de decantação 6 unidades Suporte 12 unidades Cápsula de porcelana 6 unidades
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