MEIOS DE CULTURA

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MEIOS DE CULTURA
Profa. Ana Paula Alves
FaSar - 2017
	Introdução
Nutrição de microrganismos
	
	 Nutricionalmente são os mais versáteis e diversificados
 Alguns podem viver com poucas substâncias inorgânicas
 Outros são tão exigentes quanto o homem
 Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório:
Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais
Cultivo in vivo: quando não se conhece as exigências nutricionais
Exemplo de microrganismos que precisam de hospedeiro para ser cultivado:
	
	- Mycobacterium leprae (causador da hanseníase)
- Glomus clarum (fungo simbionte)
	
	
	
	
	
	
	
	
11/10/2017
10
 
Classificação nutricional dos microrganismos:
Tabela 1 – 
Classificação nutricional das bactérias e de outros organismos.
Com exceção para CO
2
, os 
compostos orgânicos
são os que contém carbono
Para o cultivo 
laboratorial 
(
in 
vitro
) 
são utilizados meios de cultura que simulam
 
e
até melhoram as condições naturais.
Os elementos químicos principais para o crescimento das células
 
são denominados
 
macronutrientes
 
(C,
 
N,
 
H,
 
O,
 
S,
 
P).
O 
carbono 
é um dos elementos 
mais importante 
para o
 
crescimento microbiano.
Necessidade de meios de cultura adequados
 
célula
Macronutrientes
: - Necessários em grande quantidade.
Tem 
papel importante na estrutura e
 
metabolismo.
Micronutrientes
: - Necessários em quantidades mínimas.
Funções enzimáticas e estruturais das
 
biomoléculas
Introdução
Nutrição de microrganismos
Matéria seca
Água
C N H
P, S, K, Na ...
A capacidade de algumas bactérias em utilizar o
 
nitrogênio atmosférico (FBN) é de fundamental importância para a vida de todos os
 
seres.
moléculas orgânicas (aminoácidos, peptídeos)
moléculas inorgânicas (NH
3
, NO
3
-
, N
2
)
Fonte de
 
carbono:
Compostos orgânicos (microrganismos
 
heterotróficos):
carboidratos 
lipídeos proteínas
Dióxido de carbono (microrganismos
 
autotróficos):
É
 
a forma
 
mais
 
oxidada
 
do
 
carbono,
 
assim 
a
 
fonte
 
de
 
energia
 
deve
 
vir
 
da
 
luz
 
ou
 
de
 
outros 
compostos
 
inorgânicos.
Fonte de
 
Nitrogênio:
É elemento necessário em maior quantidade depois do carbono, cerca de 12
 
%.
(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)
Componentes necessários às células Macronutrientes
 
Oxigênio:
Elemento
 
comum encontrado
 
nas
 
moléculas
 
biológicas 
(aminoácidos,
 
nucleotídeos,
 
glicerídeos)
É obtido a partir das proteínas e gorduras.
Na forma de oxigênio molecular (O
2
), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.

 
Hidrogênio:
- 
Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos 
(água, sais e gases)

 
Função: 
Manutenção do
 
pH
Formação de ligações de H entre moléculas
Fonte de energia nas reações de oxi-redução na respiração
Componentes necessários às células
Outros macronutrientes:
P – Síntese de ácidos
 
nucléicos,ATP
S
–
 
Estabilidade
 
de
 
aminoácidos,
 
componente
 
de vitaminas
K – Estabilidade dos ácidos nucléicos, bomba de
 
Na/K
Mg – Estabilidade dos
 
ribossomos
Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de
 
endósporos
Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos. Bactérias halofílicas extremas não crescem com menos de 15 % de
 
sal.
Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de
 
elétrons.
Componentes necessários às células
 

 
Metais em quantidades muito pequenas (traços) na composição de um meio de cultura:
Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B
► 
Exercem função estrutural em várias enzimas (ativação)
Nem sempre sua adição é
 
necessária
Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra pura podem apresentar deficiências desses
 
elementos.
Ex: Mo
+6 
é necessário para a nitrogenase, a enzima que converte o N
2 
para NH
3 
durante a FBN.
Componentes necessários às células Micronutrientes
Outros aditivos:
Função de aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH:

 
Quelantes
: 
na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos 
EDTA, ácido cítrico, polifosfatos.

 
Inibidores
Ex: produção de ácido cítrico por 
Aspergillus niger
 
 
 
Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido
 
oxálico

 
Água:
- 
Componente absolutamente indispensável
(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas) No laboratório de utiliza água destilada, filtrada e deionizada.
Água e outros aditivos
 

 
Tampões
Carbonato de
 
cálcio
Fosfatos
Proteínas
 
(peptona)
Peptona 
é um tipo de substrato, que pode ser digerido pela
 
enzima
 
tripsina,
secretada
pelo pâncreas. É uma proteína semi digerida que serve como fonte de
 
nitrogênio
Indutores: 
a maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.
Ex: celulose induz a celulase pectina induz a pectinase amido induz a amilase
Antiespumantes: 
cultivos com aeração ocorre a produção de espuma

 
Remoção de células, perda do produto, contaminação

 
Redução do volume do meio
álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis: reduzem a tensão superficial das bolhas
Outros aditivos
Meios de cultura

 
Material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microorganismos

 
Algumas bactérias crescem em qualquer meio

 
Outras 
→ 
necessidade de meios especiais

 
Outras 
→ 
não são capazes de crescer em nenhum meio já desenvolvido
 
crescimento: 
inóculo

 
Microorganismos que crescem e se multiplicam nos meios: 
cultura

 
Critérios a serem considerados:
Nutrientes
 
corretos
Quantidade de água
 
necessária
pH
 
ajustado
Quantidade específica de oxigênio ou
 
ausência
Meio inicialmente
 
estéril
Incubação em T
 
adequada

 
Microorganismos colocado num meio de cultura para iniciar o
Meios de cultura
Meios de cultura

 
Ágar:
Poucos microorganismos podem
 
degradar
Permanece sólido quando adicionado ao meio de
 
cultura
Após solidificação, suporta T de até 100°C (importante para crescimento de bactérias
 
termófilas)
Uso em tubos ou placas de
 
Petri
 
Quimicamente definidos 
(sais, compostos orgânicos purificados, água)
Classes
Complexos
 
(utilizam
 
hidrolisados
 
carne
 
e
 
soja,
 
extratos
 
de
 
levedura,
 
sangue,
 
soro, leite, solo e rúmem de
 
bovino)
Não existe um meio de cultura universal, mas Existem vários tipos meios para diversas finalidades
Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas 
exigências nutricionais
, para que os 
nutrientes 
sejam fornecidos de 
forma e proporção adequada.
Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.
Meios de cultura
Meios quimicamente definidos são utilizados para determinar as
 
necessidades
 
nutricionais
Até 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos.
Robert 
Koch 
introduziu os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas
 
puras).
Meio de cultura solidificado com 1,5 % de ágar
.
Controle é um meio mínimo com apenas glicose e sais.
3 isolados bacterianos sendo testados quanto a necessidade de suplementos orgânicos.
Meio quimicamente definido 
Meio quimicamente definido

 
Fontes de energia e C, N, S, P e todos os fatores orgânicos de crescimento que o organismo não é capaz de sintetizar

 
Composição química exata e conhecida
	Meio para bactéria quimioautotrófica típica: E. coli
	Componente
	Quantidade
	Glicose
	5,0 g
	Fosfato de amônia monobásico (NH4H2PO4)
	1,0 g
	Cloreto de sódio(NaCl)
	5,0 g
	Sulfato de magnésio (MgSO4 . 7H2O)
	0,2 g
	Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)
	1,0 g
	Água
	1 litro
 
Meio complexo

 
Bactérias heterotróficas e fungos

 
Compostos de nutrientes: extrato de levedura, carne ou de certas plantas, produtos de digestão protéica

 
Componente protéico: principal fornecedor de energia, C, N e S

 
Digestão da proteína para que o microorganismo possa aproveitá-la (peptona)

 
Extratos: vitaminas e outros fatores de crescimento orgânico
Meio complexo

 
Meio complexo na forma líquida: 
caldo nutriente

 
Adição de ágar: 
ágar nutriente
Meio complexo
	Meio complexo para bactéria heterotrófica
	Componente
	Quantidade
	Peptona (proteína parcialmente digerida)
	5,0 g
	Extrato de carne
	3,0 g
	Cloreto de sódio
	8,0 g
	Ágar
	15,0 g
	Água
	1 litro
 
Meios de
 
cultura

 
Embora não existam meios específicos para todos os microrganismos, existem centenas de formulações para inúmeras finalidades.
Alguns são meios gerais
: permitem o crescimento de muitas espécies 
Outros são meios específicos
: servem para identificação de espécies, por ex.
 
Escherichia coli 
e 
Shigella sonnei 
em meio MacConkey
 
Microplacas com diferentes meios de cultura para identificação de enterobactérias.
Meio complexo para heterotróficas
Meio definido para heterotróficas
Meio definido para quimioautotróficas

 
Normalmente imitam o habitat normal
Ex.
Se a
 
bactéria
 
prefere
 
os
 
nutrientes
 
encontrados
 
no
 
sangue,
 
então
 
o
 
sangue
 
é
 
adicionado
 
no
 
meio
 
de cultura.
Meios de cultura para bactérias
 
Geralmente são utilizados meios ricos contendo grande variedade de compostos orgânicos providos pela peptona e extratos de carne ou soja.
Também são utilizadas maiores concentrações de açúcares (4%) e pH menor (3,8 a 5,6) do que os meios para bactérias.
Essa combinação permite inibir o crescimento de bactérias.
Todos 
os fungos são
 
heterotróficos
Meios de cultura para fungos
não possui capacidade de produzir seu alimento a partir da fixação de dióxido de carbono e por isso se alimenta a partir dos outros compostos inorgânicos ou
 
orgânicos.
Tetrahymena pyriformis 
não é patogênico mas é utilizado em pesquisas médicas e biológicas.
Os protozoários são heterotróficos aeróbios com exigências
 
nutricionais
complexas
Muitos não são cultivados 
in vitro
.
Os
 
que
 
são
 
necessitam
 
muitos
 
complementos,
 
como
 
emulsões
 
de
 
tecidos
 
cerebrais,
 
soro
 
fetal, infusão de fígado e células
 
bacterianas.
Ex: 
Tetrahymena pyriformis 
necessita de um meio contendo 10 aminoácidos, 7 vitaminas e sais inorgânicos.
Meios de cultura para protozoários
 
Algas unicelulares
Maré vermelha.
Algas que produzem toxinas.
Ao contrário dos meios para bactérias e fungos, existem poucos meios prontos para algas.
Preparar um meio definido para algas marinhas pode ser muito trabalhoso, pois muitos sais contidos na água do mar poderão ser necessários.
As algas utilizam luz como energia, dióxido de carbono, água e íons inorgânicos solúveis. São
 
fotoautotróficos.
Meios de cultura para algas
obtém seus nutrientes com a ajuda da luz do sol, nos seus cloroplastos : algas, plantas e cianobactérias.
Meios e metodologia para
crescimento de anaeróbios

 
Contato com o oxigênio 
→ 
morte

 
Uso de meios especiais: redutores
Contém reagentes como tioglicolato de sódio 
→ 
combina-se com o oxigênio e o elimina do meio de
 
cultura
Tubos: 
tampas
 
seladoras
Placas de Petri: jarras
 
especiais
Uso da enzima oxirase: reduz oxigênio em
 
água
 
Meios de cultivo seletivo

 
Meio seletivo: 
Favorece 
o crescimento de bactéria de interesse e impede o crescimento de
 
outras

 
Ágar sulfeto de bismuto 
→ 
isolamento da bactéria causadora do tifo: 
Salmonella typhi
, a partir das fezes
Sulfeto de bismuto: inibe crescimento de bactérias Gram-positivas e maioria das Gram-negativas presentes no
 
TI
Meios de cultivo diferencial

 
Meio diferencial: 
fácil identificação da colônia de interesse quando existem outras bactérias crescendo na mesma placa

 
Ágar Sabouraud dextrose: 
pH 5,6 
→ 
crescimento de fungos (pelo pH baixo)

 
Agar sangue: 
identificação de microorganismos capazes de destruir células sanguíneas (
Streptococcus pyogenes
) 
→ 
formam um anel claro em torno da colônia
 
Agar sangue
Agar Sabouraoud dextrose
Meios de cultivo seletivo e diferencial
Meios de cultivo seletivo e
diferencial

 
Em alguns casos: uso de meio seletivo e diferencial combinados
Isolamento de 
Staphylococcus aureus
: tolerante a altas concentrações de NaCl e fermenta o manitol, formando
 
ácido
Meio agar sal manitol: 
7,5% de NaCl (nessa concentração impede crescimento de outros microorganismos competidores) 
→
 
seleção
Também 
contém indicador de pH que altera a cor quando manitol é fermentado a ácido 
→ 
diferenciação 
de colônias que não fermentam
 
Meios de cultivo seletivo e
diferencial
Agar sal manitol
amarelo:
 
+
vermelho:
 
-
Meios de cultivo seletivo e
diferencial

 
Agar MacConkey – 
seletivo e diferencial

 
Contém sais biliares e cristal violeta (inibidores de Gram-positivas)

 
Também 
contém lactose 
→ 
diferencia de Gram- negativas que produzem ácido a partir do metabolismo desse
 
açúcar
destinado ao crescimento de bactérias Gram negativas e indicar a fermentação de lactose. Colónias bacterianas que fermentam lactose tornam o meio rosa choque e as bactérias que não são fermentadoras de lactose tornam o meio amarelo claro.
 
Agar MacConkey Bactérias não fermentadoras
de lactose – colônias incolores
Agar MacConkey Bactérias fermentadoras de lactose – colônias vermelhas ou rosas
Agar MacConkey
Meios de cultivo seletivo e diferencial
Meio de enriquecimento

 
Isolamento de bactéria presentes em pequeno n°

 
Empregada em amostras de fezes e solo

 
Normalmente o meio é líquido e contém todos os nutrientes

 
Pode ser considerado um meio seletivo
 
Meio de enriquecimento

 
Isolamento de um microorganismo de solo:
Capaz de crescer utilizando fenol, mas que está presente em menor n° que as outras
 
espécies
Amostra de solo 
→ 
colocada num meio de enriquecimento líquido com fenol (única fonte de C e
 
energia)
Microorganismos que não são capazes de utilizar fenol não crescerão
Meio de enriquecimento

 
Isolamento de um microorganismo de solo:
O meio será incubado por alguns
 
dias
Posteriormente, pequena quantidade será inoculada em outro tubo contendo o mesmo
 
meio
Após algumas transferências de inóculos 
→ 
presença da bactéria que for capaz de metabolizar
 
fenol
RESUMO: Meios de cultura
	TIPO
	FINALIDADE
	Quimicamente definido
	Crescimento de quimioautotróficos e autotróficos e análises microbiológicas
	Complexo
	Crescimento da maioria dos microorganismos quimio-heterotróficos
	Redutor
	Crescimento de anaeróbicos obrigatórios
	Seletivo
	Impedir crescimento de microorganismos não desejados, favorecer o crescimento do organismo de interesse
	Diferencial
	Diferenciar as colônias do organismo de interesse dos outros microorganismos
	Enriquecimento
	Semelhante ao seletivo, mas com a característica de aumentar o n° da bactéria de interesse tornando-
	
	a detectável
Obtenção de culturas puras

 
Proveniente de amostras de materiais infecciosos: pus, escarro, fezes, urina

 
Amostras de solo, água ou alimentos

 
Semeadura dessas amostras: crescimento de várias colônias

 
Colônias microbianas: apresentam características morfológicas distintas que permitem diferenciação
 
Obtenção de culturas puras

 
Método de esgotamento
:
Alça de inoculação estéril→ 
mergulhada na cultura mista
Semeadura na placa de meio nutriente
 
sólido
Espalhar a bactéria na superfície do
 
meio
Final da semeadura: poucas células ainda na alça 
→ 
nova semeadura colônias isoladas
Obtenção de culturas puras
 
Preservando culturas bacterianas

 
Refrigeração – curtos períodos

 
Longos períodos:
Congelamento em baixas
 
temperaturas
Liofilização
Preservando culturas bacterianas

 
Congelamento em baixas temperaturas:
Culturas puras colocadas num líquido de
 
suspensão
Congeladas rapidamente em
 
T entre -50°C a
-95°C
Permanecem viáveis por
 
anos
 
Preservando culturas bacterianas

 
Liofilização:
Suspensão microbiana é rapidamente congelada em T entre - 54°C a
 
-72°C
Remoção imediata da água utilizando alto vácuo
 
(sublimação)
Selamento das ampolas – chama de alta
 
T que derrete o vidro
Resíduo = pó, contendo microrganismos
 
viáveis
Recuperação pela adição de meio líquido nutriente ao
 
resíduo