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Profa. Mariana Dias Moreira maridias@ufsj.edu.br Disciplina: Biologia Molecular Semestre 2017/2 TÉCNICAS DE ANÁLISE DE DNA, RNA E PROTEÍNAS FUNÇÕES DO MATERIAL GENÉTICO Dogma Central da Biologia Molecular REPLICAÇÃO DNA TRANSCRIÇÃO mRNA TRADUÇÃO Cadeia Polipeptídica Ou Proteína Armazena a informação genética Transfere a informação genética Executa a função Relembrando... Estrutura dos ácidos nucléicos Relembrando... Estrutura das proteínas Obtenção da molécula de interesse tecidos células Homogeneização (para romper tecidos e células) pressão liquefação Homogeneizado ou Extrato bruto Material de partida Amostra ultra-som Detergente Solventes orgânicos DNA RNA Proteínas Física Química EXTRAÇÃO PURIFICAÇÃO CONCENTRAÇÃO ANÁLISE Como analisar DNA, RNA e proteínas ? DNA • Eletroforese • PFGE (eletroforese em campo pulsado) • PCR; qPCR • RFLP • Southern blot RNA • Eletroforese • RT-PCR; qRT-PCR • Northern blot • FISH • Chips de DNA Proteínas • Eletroforese • Western blot • Cromatografia • Espectrometria de massas (MALDI- TOF) Bioinformática Extração Purificação Quantificação Detecção 1952, Markham and Smith Ao estudarem hidrólise de RNA perceberam que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico 1955, Smithies Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano 1967, Loening Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA 1980, Schwartz and Cantor Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes É hoje impossível imaginar um laboratório de Biologia molecular sem eletroforese acontecendo a todo instante... Vou ali correr um gelzinho e já volto Tenho que ir senão vou perder meu gel ELETROFORESE Histórico Técnicas de análises de DNA, RNA e proteínas ELETROFORESE Separação por tamanho Gel de Agarose ou Poliacrilamida Técnicas de análises de DNA, RNA e proteínas Taxa de migração: Forma Razão carga/massa ELETROFORESE Técnicas de análises de DNA, RNA e proteínas Gel de agarose X Gel de poliacrilamida Polissacarídeo extraído de alga marinha Dissolve em água fervente e solidifica quando esfria Mais utilizada para separação de fragmentos longos de ácidos nucléicos (> 1000 pb) Cuba horizontal Mistura de acrilamida + bisacrilamida Observação de fragmentos menores (< 1000 pb) ou proteínas Melhor resolução que a agarose Desvantagem neurotóxica Cuba vertical Técnicas de análises de DNA, RNA e proteínas 1 2 3 4 5678 9 10 Gel de agarose ELETROFORESE Técnicas de análises de DNA A concentração do gel em 3% separam fragmentos de 80 até 500 pb; 0,8% separam fragmentos de 0,5 até 20-30 kb; 0,5% separam fragmentos com até 50 kb (bastante frágeis e o tempo de corrida é excessivamente demorado!!!); Como separar fragmentos maiores? Cromossomo de leveduras: 1000 Kb!!! PFGE Eletroforese em campo pulsado (PFGE) Técnicas de análises de DNA Definição: PFGE - pulsed field gel eletrophoresis Eletroforese de campo pulsante ou eletroforese de campos pulsados Schwartz e Cantor (1970) relataram que as moléculas de DNA que foram estiradas pela ação de um campo elétrico demandavam um maior ou menor tempo para o relaxamento dependendo de seu tamanho PFGE utiliza o princípio da alternância periódica do campo elétrico em diferentes direções Eletroforese em campo pulsado (PFGE) Princípio da técnica Quando ocorre troca na direção do campo elétrico, as moléculas de DNA são compelidas à reorientação: quanto mais longa for a molécula de DNA, maior o tempo que necessita para que encontre uma orientação que favoreça o movimento ao longo do gel. Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado (PFGE) P ro c e d im e n to 1) Incorporação das células microbianas em blocos de agarose; 2) Imersão dos blocos de agarose em solução contendo enzimas líticas para rompimento da parede celular; 3) Sucessivas lavagens para remoção de proteínas, lipídeos e outros constituintes celulares; 4) Adição de um agente quelante em alta concentração (EDTA 0,5 M) para proteger o material contra DNAses; 5) Introdução dos blocos contendo os cromossomos em géis de agarose; 6) Eletroforese. 1 2 4 7 Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado (PFGE) Equipamento Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado (PFGE) Parâmetros gerais de corrida eletroforética Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado (PFGE) Resultado Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado (PFGE) CARIÓTIOPO Importância do controle de temperatura Baixas temperaturas (8 até 15°C) Altas temperaturas (desnaturação do DNA cromossomal) Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado (PFGE) Aplicação da técnica Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado (PFGE) Técnicas de análises de DNA Na década de 60 pesquisadores descobriram que bactérias possuíam enzimas de restrição que “cortam” e “digerem” o DNA protegendo assim a célula bacteriana de invasores A técnica de RFLP utiliza tais enzimas para digestão de DNA e gerar polimorfismo entre diferentes espécies/linhagens Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais) Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela atividade diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica) Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição Variação no tamanho de fragmentos de DNA 5’ – (…) ACTGA (…) – 3’ 3’ – (…) TGACT (…) – 5’ Técnicas de análises de DNARestriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) A. Extração de DNA B. Digestão com endonucleases de restrição (cortam o DNA através do reconhecimento de sequências nucleotídeas específicas) C. Eletroforese D. Visualização de polimorfismos E. Análises de bioinformática Técnicas de análises de DNA ETAPAS Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Técnicas de análises de DNA Interpretação Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Interpretação Técnicas de análises de DNARestriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Técnicas de análises de DNA termociclador PCR (Reação em cadeia da polimerase) Técnicas de análises de DNAqPCR (PCR em tempo real) Ti p o s d e d e te c ç ã o d e se q u ê n c ia s Sonda de ligação (fluoróforos) ao DNA dupla fita Detecção não específica SYBR® Green I Sondas de hidrólise (oligonucleotídeos marcados com fluoróforos) Detecção específica Taqman® Molecular Beacons® Técnicas de análises de DNAqPCR (PCR em tempo real) Baseia-se na propriedade dos ácidos nucléicos de parear suas fitas complementares Utiliza “sondas” para detecção das sequências alvos Sondas = fragmento de ácido nucléico complementar a uma sequência específica, marcado com uma substância reveladora (radioisótopos, enzimas,fluorocromo e anticorpos) Técnicas Blotting Dot-blot FISH Técnicas de análises de DNA, RNA e proteínasHIBRIDIZAÇÃO Hibridização é a formação de duplexes de bases pareadas, sequência-específicas, a partir de qualquer combinação de fragmentos de ácidos nucléicos, usualmente “in vitro”. Técnicas de análisesde DNA, RNA e proteínas HIBRIDIZAÇÃO HIBRIDIZAÇÃO Técnica baseada nas propriedades de hibridização dos ácidos nucléicos (Southern blotting e Northern blotting) e anticorpo específico- proteína (Western blotting) Utilizada para identificar e determinar a localização de sequências específicas de ácidos nucléicos ou aminoácidos nas cadeias polipeptídicas Réplica do DNA, RNA ou proteína de interesse imobilizado em um suporte sólido tal como uma membrana de náilon ou de nitrocelulose Técnicas de análises de DNA, RNA e proteínas “Blotting” B lo tt in g Southern Blotting (DNA) Northern Blotting (RNA) Western Blotting (Proteína) Técnicas de “Blotting” Técnicas de análises de DNA, RNA e proteínas HIBRIDIZAÇÃO DNA hibridiza com uma sonda (estringência semelhante aos primers na PCR). Permite a identificação de fragmentos de DNA com sequência idêntica ou similar à sonda utilizada. O fragmento utilizado como sonda é marcado para posterior visualização da hibridização Técnicas de análises de DNA, RNA e proteínasSouthern Blotting (DNA) Edwin Southern Southern Blotting(DNA) detecção de fragmentos específicos de DNA exógenos integrados ao DNA genômico (OGMs). é possível estimar o número de cópias que foram introduzidas no genoma do organismos receptor Limitação: necessária grande quantidade de DNA genômico (20 a 40 µg); elevado custo de implementação e alta complexidade operacional. HIBRIDIZAÇÃO Técnica de análise de DNA ETAPAS: a) Extração e digestão do DNA genômico com uma ou mais enzimas de restrição; b) Separação dos fragmentos de DNA por eletroforese em gel de agarose; c) Transferência e fixação do DNA presente no gel para uma membrana de nitrocelulose ou náilon; d) Hibridização do DNA presente na membrana com uma sonda de DNA que seja complementar à sequência alvo do DNA; e) Revelação da hibridização por autoradiografia ou calorimetria. Southern Blotting Técnica de análise de DNA Baseado no fato que fragmentos de DNA aderem a membranas de nitrocelulose ou Nylon: A membrana é colocada acima de um gel de agarose e abaixo de um material absorvente. Com o tempo os fragmentos de DNA se transferem do gel para a membrana por capilaridade. Após a transferência, a membrana é lavada e os fragmentos expostos a UV ou calor para fixação. A membrana torna-se uma imagem do DNA presente no gel. membrana Tranferência do DNA para a membrana Técnica de análise de DNASouthern Blotting Northern Blotting (RNA) Utiliza RNA em vez de DNA, propiciando estudos de expressão gênica Protocolo: 1) Extração de RNA total; 2) Separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose; 3) Transferência e fixação do RNA para membrana; 4) Hibridação com uma sonda de DNA ou RNA marcada que possui homologia a sequência alvo; 5) Revelação da hibridização. Técnica de análise de RNA Estima em que tecidos ou condições experimentais os genes são expressos Detecta a presença de mRNA específico Permite a investigação do peso molecular de um mRNA e avaliar quantidades relativas de mRNA em diferentes amostras Neste protocolo o gel é tratado com formaldeído para evitar a formação de estruturas secundárias do RNA que podem impedir a hibridização com as sondas Northern Blotting (RNA) Técnica de análise de RNA Utilização da técnica de Southern blot na identificação de polimorfismos, que determinam a alteração do padrão de clivagem, devido a mutações pontuais em sítios de restrição (RFLP) Estes diferentes padrões são detectados utilizando-se a própria região potencialmente polimórfica como sonda. Padrões de RFLP, obtidos com uma determinada sonda, podem ser utilizados no estabelecimento de uma “impressão digital de DNA” (DNA fingerprint) que permite a diferenciação entre dois indivíduos quais- quer. Técnicas de análises de DNADNA fingerprint Técnica bastante útil em medicina forense, na identificação de suspeitos ou em testes de paternidade. 39 Teste de paternidade Pai: 9 e 4 Mãe: 11 e 6 Fo1: 9 e 6 F02: 11 e 7 Regiões polimórficas, geralmente presentes em regiões não codificantes. Juntas estas regiões representam uma característica distintiva típica de uma pessoa. São herdadas 50% do pai e 50% da mãe DNA fingerprint 40 Investigação criminal DNA fingerprint Técnicas de análises de DNA Teste de paternidade DNA fingerprint FISH (Hibridação Fluorescente in situ) Permite que as sequências de ácidos nucléicos sejam examinadas dentro das células sem alterar a morfologia celular. técnica citogenética usada para detectar e localizar a presença ou a ausência de determinadas sequências de DNA em cromossomos através de sondas específicas. Técnicas de análises de DNA e RNA Podem usar marcadores radioativos ou fluorescentes Técnicas de análises de DNA e RNAFISH (Hibridação Fluorescente in situ) FISH (Hibridação Fluorescente in situ) Técnicas de análises de DNA e RNA Aplicação FISH (Hibridação Fluorescente in situ) Técnicas de análises de DNA e RNA FISH (Hibridação Fluorescente in situ) Técnicas de análises de DNA e RNA FISH (Hibridação Fluorescente in situ) Monitorar dinâmica de populações em amostras ambientais Caracterizar a diversidade filogenética de um habitat Localizar genes em cromossomos grande aplicabilidade e rapidez de diagnóstico para aneuploidias Técnicas de análises de DNA e RNA Aplicações • Bactérias do grupo alvo aparecem em vermelho. • Restantes bactérias aparecem em azul FISH (Hibridação Fluorescente in situ) Aplicações Técnicas de análises de DNA e RNA Microarrays ou chips de DNA Técnicas de análises de RNA Os microarrays (microarranjos) são pequenos suportes sólidos aos quais genes, ou fragmentos são ligados; Esses microarrays são utilizados na hibridização ao mRNA e então analisados para determinar os padrões de expressão gênica; A hibridização entre um mRNA específico e o DNA corresponde no chip indicam que o gene foi transcrito Os chips são submetidos à varredura e analisados em computador Transcriptoma S. cerevisiae Microarray ou chips de DNA Técnicas de análises de RNA Separação de proteínas Características físico-químicas Tamanho Massa Densidade Carga elétrica Hidrofobicidade Solubilidade Interação molecular Cromatografia de afinidade Cromatografia; Eletroforese •agarose •poliacrilamida; Espectrometria de massas TÉCNICAS DE ANÁLISES DE PROTEÍNAS ELETROFORESE em gel de poliacrilamida Técnicas de análise proteínas Western Blotting (Proteína) Técnica de análise de Proteínas Basea-se na separação das proteínas em gel de poliacrilamida desnaturante e posterior transferência para uma membrana de nitrocelulose ou náilon; Técnica que combina a resolução da eletroforese com uma especificidade da detecção imunológica (anticorpo-proteína) Ligação anticorpo específico marcado com: - enzima - radioativo - fluorescente Western Blotting (Proteína) Detecta proteínas que foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e transferidas para uma membrana. Revelação por calorimetria ou radiografia. Permite detectar a presença ou ausência de uma proteína que reage com o anticorpo; determinar a sua dimensão e avaliar os níveis relativos de expressão em diferentes amostras. Técnica de análise de ProteínasWestern Blotting (Proteína) Técnica de análise de ProteínasWestern Blotting (Proteína) Técnica de análise de ProteínasWestern Blotting (Proteína) ELETROFORESE em gel depoliacrilamida Separação de Proteínas – Eletroforese 1D SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) SDS desnatura as proteínas e cobre a sua superfície com cargas negativas a carga variável da proteína é “mascarada” pelo detergente separação apenas pelo tamanho (como para DNA e RNA). Técnicas de análise proteínas Separação de Proteínas – Eletroforese 1D Fixação com ácido acético (a ligação das proteínas ao gel é fraca) Coloração com Azul de Coomassie ou com Nitrato de Prata Descoloração do gel, permanecendo apenas a coloração das bandas de proteína Determinação do tamanho molecular utilizando um padrão Técnicas de análise proteínas ELETROFORESE em gel de poliacrilamida Separação das proteínas por carga e massa Separação de Proteínas – Eletroforese 2D Segunda dimensão separação por massa O gel da focalização isoelétrica é colocado em um gel SDS SDS desnatura a proteína e elimina carga movimento somente devido a massa Primeira dimensão separação por ponto isoelétrico Gel com um gradiente de pH imobilizado Corrente elétrica leva as proteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico Técnicas de análise proteínas ELETROFORESE em gel de poliacrilamida Separação de Proteínas – Eletroforese 2D Técnicas de análise proteínas ELETROFORESE em gel de poliacrilamida Separação de Proteínas – Eletroforese 2D Técnicas de análise proteínas ELETROFORESE em gel de poliacrilamida Mesma massa Mesmo pI Proteômica Consiste na ionização de átomos ou moléculas de uma amostra, na separação destes átomos ou moléculas em função da sua relação massa/carga (m/z) e em seguida sua identificação e quantificação; Procedimento rápido e os resultados são obtidos em minutos; Utilizada com sucesso na investigação e identificação de proteínas e peptídeos, na identificação taxonômica de microrganismos, na genotipagem e análise de polimorfismos no DNA, na investigação de modificações pós-transcricionais no RNA, dentre inúmeras outras aplicações; Técnicas de análise proteínasMALDI-TOF Definição: MALDI (Matrix Assisted Lazer Desorption Ionization) e TOF (Time of flight) Matriz – fornecer prótons (ionização) ácido α-ciano-cinamínico ácido sinapínico Técnicas de análise proteínasMALDI-TOF detector Procedimento Técnicas de análise proteínasMALDI-TOF Técnicas de análise proteínasMALDI-TOF Procedimento Solução orgânica Produz um espectro de proteínas típicas de cada espécie “fingerprinting” Espectros são comparados a bancos comerciais: BIOTYPER (Bruker Daltonics, Alemanha) SARAMIS (Shimadzu Corporation ,Japão). Técnicas de análise proteínas Bioinformática Definição: Conjunto das técnicas advindas da matemática, estatística, e computação aplicados a análise de dados em biologia molecular Necessidade de sistemas computacionais (softwares – Systat e Bionumerics) para análise de dados e interpretação dos resultados. Comparação com bancos de dados (GenBank, RDP, EMBL) Sequenciamento Frederick Sanger, 1975 Era das Ômicas Técnicas de análises de DNA, RNA e proteínas Genômica gene Transcriptômica mRNA Proteômica proteínas METABOLÔMICA metabólitos Fenótipo Genótipo 2ª Avaliação
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