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Aula 9 e 10 Técnicas de Análise de DNA, RNA e Proteínas

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Profa. Mariana Dias Moreira
maridias@ufsj.edu.br
Disciplina: Biologia Molecular
Semestre 2017/2
TÉCNICAS DE ANÁLISE DE DNA, 
RNA E PROTEÍNAS
FUNÇÕES DO MATERIAL GENÉTICO
Dogma Central da Biologia Molecular
REPLICAÇÃO
DNA
TRANSCRIÇÃO
mRNA
TRADUÇÃO
Cadeia 
Polipeptídica 
Ou 
Proteína
Armazena a informação genética Transfere a informação genética Executa a função
Relembrando...
Estrutura dos ácidos nucléicos
Relembrando...
Estrutura das proteínas
Obtenção da molécula de interesse
tecidos
células
Homogeneização 
(para romper tecidos e células)
pressão liquefação
Homogeneizado
ou
Extrato bruto
Material de 
partida
Amostra
ultra-som
Detergente
Solventes orgânicos
DNA
RNA
Proteínas
Física
Química 
EXTRAÇÃO
PURIFICAÇÃO
CONCENTRAÇÃO
ANÁLISE
Como analisar DNA, RNA e proteínas ?
DNA
• Eletroforese
• PFGE (eletroforese 
em campo 
pulsado)
• PCR; qPCR
• RFLP
• Southern blot
RNA
• Eletroforese
• RT-PCR; qRT-PCR
• Northern blot
• FISH
• Chips de DNA
Proteínas
• Eletroforese
• Western blot
• Cromatografia
• Espectrometria de 
massas (MALDI-
TOF)
Bioinformática
Extração Purificação Quantificação Detecção
1952, Markham and Smith
 Ao estudarem hidrólise de RNA perceberam que moléculas de 
diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando 
aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico
1955, Smithies
 Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro 
humano
1967, Loening 
 Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda 
moléculas grandes de DNA
1980, Schwartz and Cantor 
 Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes
É hoje impossível imaginar um laboratório de Biologia 
molecular sem eletroforese acontecendo a todo instante...
Vou ali correr 
um gelzinho e 
já volto
Tenho que ir senão 
vou perder meu gel
ELETROFORESE
Histórico
Técnicas de análises de DNA, RNA e 
proteínas
ELETROFORESE
Separação por tamanho
Gel de Agarose ou Poliacrilamida
Técnicas de análises de DNA, RNA 
e proteínas
Taxa de migração:
 Forma
Razão carga/massa
ELETROFORESE Técnicas de análises de DNA, RNA 
e proteínas
Gel de agarose X Gel de poliacrilamida
Polissacarídeo extraído de alga 
marinha
Dissolve em água fervente e 
solidifica quando esfria
Mais utilizada para separação de 
fragmentos longos de ácidos
nucléicos (> 1000 pb)
Cuba horizontal
Mistura de acrilamida + 
bisacrilamida
Observação de fragmentos menores 
(< 1000 pb) ou proteínas
Melhor resolução que a agarose
Desvantagem  neurotóxica
Cuba vertical
Técnicas de análises de DNA, RNA 
e proteínas
1 2 3 4
5678
9 10
Gel de agarose
ELETROFORESE
Técnicas de análises de DNA
A concentração do gel em 3% separam fragmentos de 80 até 500 pb;
0,8% separam fragmentos de 0,5 até 20-30 kb;
0,5% separam fragmentos com até 50 kb (bastante frágeis e o tempo de
corrida é excessivamente demorado!!!);
Como separar fragmentos maiores? Cromossomo de leveduras: 1000
Kb!!!
PFGE
Eletroforese em campo 
pulsado (PFGE)
Técnicas de análises de DNA
Definição: PFGE - pulsed field gel eletrophoresis
 Eletroforese de campo pulsante ou eletroforese de campos pulsados
 Schwartz e Cantor (1970) relataram que as moléculas de DNA que foram
estiradas pela ação de um campo elétrico demandavam um maior ou
menor tempo para o relaxamento dependendo de seu tamanho
 PFGE utiliza o princípio da alternância periódica do campo elétrico em
diferentes direções
Eletroforese em campo 
pulsado (PFGE)
Princípio da técnica
Quando ocorre troca na direção do campo elétrico, as moléculas de
DNA são compelidas à reorientação: quanto mais longa for a molécula
de DNA, maior o tempo que necessita para que encontre uma
orientação que favoreça o movimento ao longo do gel.
Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado 
(PFGE)
P
ro
c
e
d
im
e
n
to
1) Incorporação das células microbianas em blocos de agarose; 
2) Imersão dos blocos de agarose em solução contendo enzimas líticas para 
rompimento da parede celular; 
3) Sucessivas lavagens para remoção de proteínas, lipídeos e outros 
constituintes celulares;
4) Adição de um agente quelante em alta concentração (EDTA 0,5 M) para 
proteger o material contra DNAses; 
5) Introdução dos blocos contendo os cromossomos em géis de agarose;
6) Eletroforese.
1
2 4
7
Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado 
(PFGE)
Equipamento
Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado 
(PFGE)
Parâmetros gerais de corrida eletroforética 
Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado 
(PFGE)
Resultado
Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado 
(PFGE)
CARIÓTIOPO
Importância do controle de temperatura
Baixas temperaturas (8 até 15°C) Altas temperaturas (desnaturação 
do DNA cromossomal)
Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado 
(PFGE)
Aplicação da técnica
Técnicas de análises de DNAEletroforese em campo pulsado 
(PFGE)
Técnicas de análises de DNA
Na década de 60 pesquisadores
descobriram que bactérias possuíam
enzimas de restrição que “cortam” e
“digerem” o DNA protegendo assim
a célula bacteriana de invasores
A técnica de RFLP utiliza tais
enzimas para digestão de DNA e
gerar polimorfismo entre diferentes
espécies/linhagens
Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP) Polimorfismo de comprimento de fragmento 
de restrição
Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais)
Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela atividade 
diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência 
específica)
Presença de polimorfismo  Perda ou ganho de local de restrição 
Variação no tamanho de fragmentos de DNA
5’ – (…) ACTGA (…) – 3’
3’ – (…) TGACT (…) – 5’
Técnicas de análises de DNARestriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP) 
A. Extração de DNA
B. Digestão com endonucleases de restrição (cortam o
DNA através do reconhecimento de sequências
nucleotídeas específicas)
C. Eletroforese
D. Visualização de polimorfismos
E. Análises de bioinformática
Técnicas de análises de DNA
ETAPAS
Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP) 
Técnicas de análises de DNA
Interpretação
Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP) 
Interpretação
Técnicas de análises de DNARestriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP) 
Técnicas de análises de DNA
termociclador
PCR (Reação em cadeia da 
polimerase)
Técnicas de análises de DNAqPCR (PCR em tempo real)
Ti
p
o
s 
d
e
 d
e
te
c
ç
ã
o
 d
e
 
se
q
u
ê
n
c
ia
s 
Sonda de ligação 
(fluoróforos) ao 
DNA dupla fita
Detecção não 
específica
SYBR® Green I
Sondas de 
hidrólise
(oligonucleotídeos
marcados com 
fluoróforos) 
Detecção 
específica
Taqman®
Molecular 
Beacons®
Técnicas de análises de DNAqPCR (PCR em tempo real)
Baseia-se na propriedade dos ácidos nucléicos de parear suas
fitas complementares
Utiliza “sondas” para detecção das sequências alvos
Sondas = fragmento de ácido nucléico complementar a uma
sequência específica, marcado com uma substância reveladora
(radioisótopos, enzimas,fluorocromo e anticorpos)
Técnicas
 Blotting
Dot-blot
 FISH
Técnicas de análises de DNA, RNA e 
proteínasHIBRIDIZAÇÃO
Hibridização é a formação de duplexes de bases pareadas,
sequência-específicas, a partir de qualquer combinação de
fragmentos de ácidos nucléicos, usualmente “in vitro”.
Técnicas de análisesde DNA, RNA e 
proteínas
HIBRIDIZAÇÃO
HIBRIDIZAÇÃO
Técnica baseada nas propriedades de hibridização dos ácidos
nucléicos (Southern blotting e Northern blotting) e anticorpo específico-
proteína (Western blotting)
Utilizada para identificar e determinar a localização de sequências 
específicas de ácidos nucléicos ou aminoácidos nas cadeias
polipeptídicas
Réplica do DNA, RNA ou proteína de interesse imobilizado em um
suporte sólido tal como uma membrana de náilon ou de nitrocelulose
Técnicas de análises de DNA, RNA 
e proteínas
“Blotting”
B
lo
tt
in
g
Southern Blotting
(DNA)
Northern Blotting
(RNA)
Western Blotting
(Proteína)
Técnicas de “Blotting”
Técnicas de análises de DNA, RNA 
e proteínas
HIBRIDIZAÇÃO
DNA hibridiza com uma sonda (estringência semelhante aos primers na
PCR). Permite a identificação de fragmentos de DNA com sequência 
idêntica ou similar à sonda utilizada.
O fragmento utilizado como sonda é marcado para posterior
visualização da hibridização
Técnicas de análises de DNA, RNA 
e proteínasSouthern Blotting (DNA)
Edwin Southern
Southern Blotting(DNA)
 detecção de fragmentos
específicos de DNA exógenos
integrados ao DNA genômico
(OGMs).
 é possível estimar o número
de cópias que foram
introduzidas no genoma do
organismos receptor
Limitação: necessária grande
quantidade de DNA genômico
(20 a 40 µg); elevado custo de
implementação e alta
complexidade operacional.
HIBRIDIZAÇÃO Técnica de análise de DNA
ETAPAS:
a) Extração e digestão do DNA genômico com uma
ou mais enzimas de restrição;
b) Separação dos fragmentos de DNA por
eletroforese em gel de agarose;
c) Transferência e fixação do DNA presente no gel 
para uma membrana de nitrocelulose ou
náilon;
d) Hibridização do DNA presente na membrana
com uma sonda de DNA que seja
complementar à sequência alvo do DNA;
e) Revelação da hibridização por autoradiografia
ou calorimetria.
Southern Blotting Técnica de análise de DNA
Baseado no fato que fragmentos de DNA aderem a membranas de nitrocelulose ou
Nylon:
A membrana é colocada acima de um gel de agarose e abaixo de um material
absorvente.
Com o tempo os fragmentos de DNA se transferem do gel para a membrana por
capilaridade.
Após a transferência, a membrana é lavada e os fragmentos expostos a UV ou
calor para fixação.
 A membrana torna-se uma imagem do DNA presente no gel. 
membrana
Tranferência do DNA para a membrana
Técnica de análise de DNASouthern Blotting
Northern Blotting (RNA)
Utiliza RNA em vez de DNA, propiciando estudos de expressão gênica
Protocolo:
1) Extração de RNA total;
2) Separação dos fragmentos
por eletroforese em gel de
agarose;
3) Transferência e fixação do
RNA para membrana;
4) Hibridação com uma sonda
de DNA ou RNA marcada
que possui homologia a
sequência alvo;
5) Revelação da hibridização.
Técnica de análise de RNA
 Estima em que tecidos ou condições experimentais os genes são expressos
 Detecta a presença de mRNA específico
 Permite a investigação do peso molecular de um mRNA e avaliar
quantidades relativas de mRNA em diferentes amostras
 Neste protocolo o gel é tratado com formaldeído para evitar a formação de
estruturas secundárias do RNA que podem impedir a hibridização com as
sondas
Northern Blotting (RNA) Técnica de análise de RNA
 Utilização da técnica de Southern blot na identificação de 
polimorfismos, que determinam a alteração do padrão de clivagem, 
devido a mutações pontuais em sítios de restrição (RFLP)
Estes diferentes padrões são detectados utilizando-se a própria região 
potencialmente polimórfica como sonda.
Padrões de RFLP, obtidos com uma determinada sonda, podem ser 
utilizados no estabelecimento de uma “impressão digital de DNA” (DNA
fingerprint) que permite a diferenciação entre dois indivíduos quais-
quer.
Técnicas de análises de DNADNA fingerprint
Técnica bastante útil em medicina forense, na 
identificação de suspeitos ou em testes de paternidade.
39
Teste de paternidade
Pai: 9 e 4
Mãe: 11 e 6
Fo1: 9 e 6
F02: 11 e 7
Regiões polimórficas, geralmente presentes em regiões não codificantes. Juntas estas regiões
representam uma característica distintiva típica de uma pessoa. São herdadas 50% do pai e 50% da mãe
DNA fingerprint
40
Investigação criminal
DNA fingerprint
Técnicas de análises de DNA
Teste de paternidade
DNA fingerprint
FISH (Hibridação 
Fluorescente in situ)
Permite que as sequências de ácidos 
nucléicos sejam examinadas dentro das 
células sem alterar a morfologia celular.
técnica citogenética usada para detectar e 
localizar a presença ou a ausência de 
determinadas sequências de DNA em 
cromossomos através de sondas específicas.
Técnicas de análises de DNA e RNA
Podem usar 
marcadores 
radioativos
ou fluorescentes
Técnicas de análises de DNA e RNAFISH (Hibridação 
Fluorescente in situ)
FISH (Hibridação 
Fluorescente in situ)
Técnicas de análises de DNA e RNA
Aplicação
FISH (Hibridação Fluorescente 
in situ) Técnicas de análises de DNA e RNA
FISH (Hibridação 
Fluorescente in situ)
Técnicas de análises de DNA e RNA
FISH (Hibridação 
Fluorescente in situ)
Monitorar dinâmica de populações em 
amostras ambientais
Caracterizar a diversidade filogenética de 
um habitat
Localizar genes em cromossomos
grande aplicabilidade e rapidez de diagnóstico 
para aneuploidias
Técnicas de análises de DNA e RNA
Aplicações
• Bactérias do grupo alvo
aparecem em vermelho. 
• Restantes bactérias
aparecem em azul
FISH (Hibridação 
Fluorescente in situ)
Aplicações
Técnicas de análises de DNA e RNA
Microarrays ou 
chips de DNA
Técnicas de análises de 
RNA
Os microarrays (microarranjos) são
pequenos suportes sólidos aos quais genes,
ou fragmentos são ligados;
Esses microarrays são utilizados na
hibridização ao mRNA e então analisados
para determinar os padrões de expressão
gênica;
A hibridização entre um mRNA específico
e o DNA corresponde no chip indicam que o
gene foi transcrito
Os chips são submetidos à varredura e
analisados em computador
Transcriptoma S. cerevisiae
Microarray ou chips de DNA
Técnicas de análises de RNA
Separação de 
proteínas
Características 
físico-químicas
Tamanho
Massa
Densidade
Carga elétrica
Hidrofobicidade
Solubilidade
Interação 
molecular
Cromatografia 
de afinidade
Cromatografia;
Eletroforese
•agarose
•poliacrilamida;
Espectrometria de 
massas
TÉCNICAS DE ANÁLISES DE 
PROTEÍNAS
ELETROFORESE
em gel de poliacrilamida
Técnicas de análise proteínas
Western Blotting
(Proteína)
Técnica de análise de Proteínas
Basea-se na separação 
das proteínas em gel 
de poliacrilamida
desnaturante e 
posterior transferência 
para uma membrana 
de nitrocelulose ou 
náilon; 
Técnica que combina a resolução da eletroforese com uma 
especificidade da detecção imunológica (anticorpo-proteína)
Ligação anticorpo específico marcado com:
- enzima
- radioativo
- fluorescente 
Western Blotting
(Proteína)
 Detecta proteínas que foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e
transferidas para uma membrana. Revelação por calorimetria ou radiografia.
 Permite detectar a presença ou ausência de uma proteína que reage com o
anticorpo; determinar a sua dimensão e avaliar os níveis relativos de expressão em
diferentes amostras.
Técnica de análise de ProteínasWestern Blotting
(Proteína)
Técnica de análise de ProteínasWestern Blotting
(Proteína)
Técnica de análise de ProteínasWestern Blotting
(Proteína)
ELETROFORESE
em gel depoliacrilamida
Separação de Proteínas – Eletroforese 1D
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
SDS desnatura as proteínas e cobre a sua superfície com cargas negativas 
a carga variável da proteína é “mascarada” pelo detergente  separação 
apenas pelo tamanho (como para DNA e RNA).
Técnicas de análise proteínas
Separação de Proteínas – Eletroforese 1D
Fixação com ácido acético (a ligação 
das proteínas ao gel é fraca)
Coloração com Azul de Coomassie
ou com Nitrato de Prata
Descoloração do gel, 
permanecendo apenas a coloração 
das bandas de proteína
Determinação do tamanho 
molecular utilizando um padrão
Técnicas de análise proteínas
ELETROFORESE
em gel de poliacrilamida
Separação das proteínas por 
carga e massa
Separação de Proteínas – Eletroforese 2D
Segunda dimensão  separação por massa
 O gel da focalização isoelétrica é colocado em 
um gel SDS
SDS desnatura a proteína e elimina carga 
movimento somente devido a massa
Primeira dimensão separação por ponto isoelétrico
Gel com um gradiente de pH imobilizado
Corrente elétrica leva as proteínas carregadas a 
mover até alcançar o ponto isoelétrico 
Técnicas de análise proteínas
ELETROFORESE
em gel de poliacrilamida
Separação de Proteínas – Eletroforese 2D
Técnicas de análise proteínas
ELETROFORESE
em gel de poliacrilamida
Separação de Proteínas – Eletroforese 2D
Técnicas de análise proteínas
ELETROFORESE
em gel de poliacrilamida
Mesma 
massa
Mesmo pI Proteômica
Consiste na ionização de átomos ou moléculas de uma amostra, na separação
destes átomos ou moléculas em função da sua relação massa/carga (m/z) e em
seguida sua identificação e quantificação;
Procedimento rápido e os resultados são obtidos em minutos;
Utilizada com sucesso na investigação e identificação de proteínas e peptídeos,
na identificação taxonômica de microrganismos, na genotipagem e análise de
polimorfismos no DNA, na investigação de modificações pós-transcricionais no
RNA, dentre inúmeras outras aplicações;
Técnicas de análise proteínasMALDI-TOF
Definição: MALDI (Matrix Assisted Lazer Desorption Ionization) e TOF (Time of 
flight)
Matriz – fornecer prótons (ionização)
ácido α-ciano-cinamínico 
ácido sinapínico 
Técnicas de análise proteínasMALDI-TOF
detector
Procedimento 
Técnicas de análise proteínasMALDI-TOF
Técnicas de análise proteínasMALDI-TOF
Procedimento 
Solução 
orgânica
Produz um espectro de 
proteínas típicas de cada 
espécie “fingerprinting”
Espectros são 
comparados a bancos 
comerciais: 
BIOTYPER (Bruker
Daltonics, Alemanha)
SARAMIS (Shimadzu
Corporation ,Japão).
Técnicas de análise proteínas
Bioinformática
Definição: Conjunto das técnicas advindas da
matemática, estatística, e computação
aplicados a análise de dados em biologia
molecular
Necessidade de sistemas computacionais
(softwares – Systat e Bionumerics) para análise de
dados e interpretação dos resultados.
Comparação com bancos de dados (GenBank,
RDP, EMBL)
Sequenciamento
Frederick Sanger, 
1975
Era das Ômicas Técnicas de análises de DNA, RNA e 
proteínas
Genômica
gene
Transcriptômica
mRNA
Proteômica
proteínas
METABOLÔMICA
metabólitos
Fenótipo
Genótipo
2ª Avaliação

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