Aula 12 peptidases

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI
ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS
1
Katialaine Araújo
CAP – Sala 205 Bl. 6 
katialaine@yahoo.com.br
Bioquímica Tecnológica 
Enzimas industriais: 
Peptidases
Universidade Federal de São João del-Rei
Campus Alto Paraopeba (CAP)
Engenharia de Bioprocessos
Bioquímica Tecnológica
Introdução
• α-Aminoácidos
α
Grupo amino (básico) Grupo carboxílico (ácido)
Caráter anfótero
Introdução
• α-Aminoácidos
- D encontrado em poucos casos
ex: peptidoglicano  parede celular bacteriana
- Normalmente na forma L
• α-Aminoácidos
Classificação 
pelo grupo R
- Ligação 
peptídica
Introdução
- Ligação peptídica
Introdução
- Proteínas
Introdução
- Proteínas (MM >10.000 Da)
+H3N
N
H
CH
C
O
O–
N
H
CH
C
O
R
CH
H
N
C
O
R
CH
C
O
R
N-terminal
C-terminal
aminoterminal
carboxiterminal
Cadeia polipeptídica
- Peptídeos (MM <10.000 Da)
Dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo etc
Oligopeptídeo 
(até 10 aa) 
Polipeptídeo
Introdução
- Funções fisiológicas das proteínas
• Enzimática
• Transporte (ex.: Hb)
• Movimento coordenado (ex.: contração muscular)
• Suporte mecânico (ex.: colágeno)
• Efeito imune (ex.: anticorpos)
• Outros
Introdução
Propriedades tecnológicas das proteínas
Propriedades tecnológicas das proteínas
Propriedades tecnológicas das proteínas
- Viscosidade
Propriedades tecnológicas das proteínas
Mecanismo: absorção de H2O, forma e tamanho, interações prot-solvente
Alimentos: sopas, molhos de carnes, molhos p/ salada, sobremesas
Exemplo tipo proteína: gelatina
- Ligação à H2O
Mecanismo: pontes H, hidratação iônica
Alimentos: Salsichas, bolos, pães
Exemplo tipo proteína: proteínas de carne, ovo e soja.
- Gelificação
Mecanismo: retenção e imobilização de H2O, formação de redes
Alimentos: Carnes, géis, bolos, produtos de panificação, queijo
Exemplo tipo proteína: proteínas de carne, leite e ovo
- Elasticidade
Mecanismo: ligações hidrofóbicas, pontes dissulfeto cruzadas
Alimentos: carnes, produtos de panificação
Exemplo tipo proteína: proteínas de carne e de cereais
- Emulsificação
Mecanismo: formação de películas, adsorção nas interfaces
Alimentos: Salsichas, almôndega, sopa, bolos, molhos
Exemplo tipo proteína: proteínas de carne, leite e ovo
- Formação de espuma
Alimentos: Chantilly, marshmellow, sorvete, bolos, suflês, musses
Exemplo tipo proteína: proteínas de leite e ovo
Mecanismo: formação de películas, adsorção nas interfaces
Propriedades tecnológicas das proteínas
- Formação de massa (glúten)
Farinha de trigo = 7 a 13% proteínas, sendo 85% delas:
Prolaminas (principalmente gliadinas)
Glutelinas (principalmente gluteninas)
Altamente hidrofóbicas
Insolúveis em H2O
Resultado: massa viscoelástica capaz de aprisionar gás durante a fermentação
Amassamento 
(cisalhamento)
H2O S
S
S
S
S
S
Glúten = complexo gliadina-glutenina
Polímeros fibrilares
Pontes H, pontes dissulfeto, interações hidrofóbicas
Gordura
amido 
H2O
Propriedades tecnológicas das proteínas
PEPTIDASES
E.C. 3.4._._
A + H2O  B + C
Hidrolases
Atuam em ligações 
peptídicas
• Características
- Enzimas proteolíticas
Catalisam a hidrólise de ligações peptídicas em proteínas
- Encontrada em todos os tipos de organismos
- Fisiologicamente importante em diversos processos biológicos
Ativação de hormônios peptídicos e neurotransmissores
- Alvo potencial no desenvolvimento de agentes terapêuticos 
contra doenças
Digestão de proteínas (facilita absorção pelas células)
Reciclagem de proteínas intracelulares, turnover
Modificação enzimática - regulação (ex: ativação de zimogênios)
Micro-organismos, plantas e animais
Esporulação, germinação, regulação da expressão gênica (Rao et al. 1998)
PEPTIDASES
• Características
- ~60% das vendas
Rao et al. (1998)
PEPTIDASES
• Classificação
- Exopeptidases (3.4.11 a 3.4.19)
Peptidases que atuam em N-terminal
- Endopeptidases (3.4.21 a 3.4.99)
COOH
H2N
Peptidases que atuam em C-terminal
PEPTIDASES
• Classificação
- Exopeptidases (N-terminal)
Aminopeptidases (E.C. 3.4.11._) H2N
H2N
H2N
Dipeptidil peptidases (E.C. 3.4.14._)
Tripeptidil peptidases (E.C. 3.4.14._)
PEPTIDASES
• Classificação
- Exopeptidases (C-terminal)
Carboxipeptidases (E.C. 3.4.16._ a 3.4.18._)
serina carboxipeptidase (E.C. 3.4.16._)
metalocarboxipeptidase (E.C. 3.4.17._)
cisteína carboxipeptidase (E.C. 3.4.18._)
Peptidil dipeptidases (E.C. 3.4.15._)
Dipeptidases (E.C. 3.4.13._)
COOH
COOH
COOHH2N
PEPTIDASES
• Classificação
- Endopeptidases:
Serina-endopeptidases (E.C. 3.4.21._)
Cisteína-endopeptidases (E.C. 3.4.22._)
Aspártico-endopeptidases (E.C. 3.4.23._)
Metalo-endopeptidases (E.C. 3.4.24._)
Outras
Endopeptidases c/ mecanismo catalítico desconhecido (E.C. 3.4.99._)
Serina no sitio ativo; ativas em pH neutro e alcalino (ótimo entre 7 e 11)
Ác. aspártico no sitio ativo; ativas em pH baixo (3 a 4)
Cys e His no centro ativo; pH neutro; atividade depende ambiente redutor
Subtilisinas
Papaína
Pepsina, renina
Requerem metal divalente; pH neutro a alcalino
Treonina-endopeptidases (E.C. 3.4.25._)
Colagenase
PEPTIDASES
• Produção: fontes
- Vegetais
- Animais
- Microbianas
Papaína (cisteína protease; pHest 5-9, Test até 80°C) – EC 3.4.22.2
Bromelina (cisteína protease; pHest 5-9, Test <70°C) – EC 3.4.22.32 ou 33
Tripsina (serina protease; pH 6,5-9) – EC 3.4.21.4
Pepsina (aspártico protease acídica; pHótimo ~2 (1,5-4) – EC 3.4.23.1 ou 2
Renina/quimosina (aspártico protease; pHótimo ~4, T~40°C) – EC 3.4.23.4
Neutras (metalo, serina), alcalinas (serina) ou acídicas (aspártico 
proteases)
Bacterianas (Bacillus sp.) ou fúngicas (Aspergillus sp.)
PEPTIDASES
• Produção de proteases microbianas (vide Sumantha et al., 2006)
1. Isolamento de cepas proteolíticas
Produção em quantidades comerciais
Enzimas extracelulares: seleção em placa (halo de hidrólise)
crescimento
caseína, gelatina
inóculo
Relação quantitativa “tamanho do halo–produção” é válida
Meio adequado: sem repressão e com indução, quando necessário
PEPTIDASES
• Produção de proteases microbianas (vide Sumantha et al., 2006)
2. Formulação do meio fermentativo
Meios ricos em N (caseína, gelatina, resíduos soja, água maceração de 
milho etc) – proteinas e peptideos induzem produção em vários m.o.
↑ [carboidratos] reprime a produção de enzima
Aminoácidos livres reprime a produção de enzima
3. Fermentação
Submersa ou em estado sólido
Batelada, batelada alimentada, contínuo
Células livres ou imobilizadas
4. Otimização do processo
Melhoramento de linhagens, engenharia de proteínas
Planejamento experimental (condições de processo)
PEPTIDASES
• Produção de proteases microbianas (vide Sumantha et al., 2006)
5. Purificação
Maior parte é extracelular
6. Determinação da atividade enzimática – exemplo:
Substrato (ex: caseína “Hammarsten”)
TCA
Determinação de 
peptídeos solúveis 
(espectrofotômetro)T, pH, tempo
Enzima
PEPTIDASES
Aplicação industrial das peptidases
• História
- Ilíada de Homero (séc. VIII aC)
Sucos de figo (ficina) para coagular o leite
(Uso de proteases na fabricação de queijos)
- Egípcios ~ 5.000 anos atrás
Estômago de animais como recipiente p/ líquidos
• Detergentes
- Lava-louças, soluções limpadoras p/ lentes de contato e dentaduras
- Remoção manchas de grama, sangue, ovo, chocolate, suor e outras 
secreções
- ~¼ do mercado mundial de enzimas= proteases p/ detergentes
- Detergentes c/ proteases desde 1913 (tripsina)
- Características desejáveis:
Baixa especificidade (ampla atuação em diferentes proteínas)
Estabilidade (T, ↑pH, compatibilidade c/ componentes da 
formula - quelantes, oxidantes etc)
- Hidrolisa proteínas a pept./aa  removidos ou dissolvidos H2O
Aplicação industrial das peptidases
• Detergentes
- A grande maioria são serina-peptidases de Bacillus
Ex: subtilisinas, peptidases alcalinas
Geralmente ativas em pH neutro e alcalino (pHótimo = 7-11)
Fornecedor Nome Origem
Novozymes Alcalase B. licheniformis
Savinase Bacillus sp.
Esperase B. lentus
Durazym Bacillus sp.
Genencor Purafact B. lentus
Gist-Brocades Subtilisin B. alcalophilus
Maxacal Bacillus sp.
Maxatase Bacillus sp.
Solvay Enzymes Optimase B. licheniformis
Gupta et al. 2002
Aplicação industrial das peptidases
• Alimentos
- Queijos:
1. Quimosina (renina)
Amargor  relacionado à (elevada) hidrofobicidade de peptídeos 
liberados durante hidrólise não específica de algumas proteínas
Estômago de bezerros, ovelha, cabra
Hidrolisa Phe105-Met106 da κ-CN
Enzimas microbianas (OGM ou não)  substituição à animal
2. Outras proteases podem ser utilizadas, mas muita proteólise 
pode ↓efeito da coagulação, ↓rendimento, ↓qualidade
4. Proteases das bactérias láticas: importantes para aroma, sabor e 
textura de queijos
3. Proteases (ex: Pseudomonas fluorescens) hidrolisam peptídeos 
responsáveis pelo gosto amargo
Remoção de amargor em queijos e hidrolisados proteicos
Aplicação industrial das peptidases
Micela de caseína www.food-info.net/images/caseinmicelle.jpg
submicela
κ-CN, parte 
hidrofílica
κ-CN
fosfato
fosfato de 
cálcio
Estabilidade =
1. Repulsão 
eletrostática
2. Impedimento 
estérico
3. Interações 
hidrofóbicas
4. Camada H2O 
hidratação
Aplicação industrial das peptidases
• Alimentos
- Coagulação enzimática do leite:
Phe105 Met106
Quimosina (renina)
Para-κ-caseína Glicomacropeptídeo (hidrofílico)
Ca2+
Para-caseinato de cálcio (ppt)
Aplicação industrial das peptidases
• Alimentos
- Carnes:
Amacimento de carne
- Cervejaria:
Evitam turvação
Principalmente papaína
Remoção de carne dos ossos e processamento de refugos
Aplicação industrial das peptidases
• Alimentos
- Panificação - ex:
Perda da propriedade viscoelástica (hidrólise extensa, Bacillus sp)
Preferível em crackers, biscoitos, pizza etc.
Hidrólise controlada pode promover extensibilidade da massa, ↑Vpão
- Outros
Desproteinização de resíduos de crustaceos para produção de quitina
Produção de extrato de levedura (ingrediente – sabor)
Aplicação industrial das peptidases
• Ração animal
- Degradação de proteínas, tornando digestão facilitada
- Minimiza efeitos dos fatores antinutricionais
quebra de proteína = + fácil de digerir
• Couro
- Remoção de pelos em peles de animais
Enzimas estáveis em condições alcalinas (pH 12) de curtume
Alternativa ambientalmente correta à depilação química 
Menor quantidade de resíduos 
- Maior maciez ao couro
Aplicação industrial das peptidases
• Indústria farmacêutica, medicina 
- Síntese de peptídeos
Colagenase: remoção de restos de úlceras cutâneas e queimaduras
• Química fina
• Outros
- Recuperação de prata na indústria fotográfica (hidrólise gelatina)
- Tratamento de efluentes, etc (vide Gupta et al. 2002, Sumantha et al. 2006)
Ex: aspartame (dipeptídeo L- ác. Aspártico-L-fenilalanina)
Auxiliar digestivo em algumas síndromes (deficiência de enzimas)
Inibidores de proteases: agentes terapêuticos no controle de diversas 
doenças (malária, AIDS, hepatite, desordens inflamatórias, etc)
Aplicação industrial das peptidases
• Proteínas
- Diversas propriedades tecnológicas nos alimentos
• Peptidases
- Classificação baseado na reação e mecanismo
- Hidrólise de ligações peptídicas em proteínas
- Produção microbiana
• Aplicações industriais
- Remoção/degradação de compostos proteicos
- Hidrólise de proteínas
- Síntese de peptídeos
RESUMINDO....
DÚVIDAS?
1. Damodaran, S.; Parkin, K.L.; Fennema, O.W. Química de alimentos 
de Fennema. 4a Ed. Artmed. 2010. Cap. 5.
2. Rao, M.B.; Tanksale, A.M.; Ghatge, M.S.; Deshpande, V.V. Molecular 
and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology
and Molecular Biology Reviews. 62(3):597-635, 1998.
3. Sumantha, A.; Larroche C.; Pandey A. Microbiology and industrial 
biotechnology of food-grade proteases: a perspective. Food
Technology and Biotechnology. 44(2):211-220, 2006.
4. Bon, E.P.S.; Ferrara, M.A.; Corvo, M.L. Enzimas em Biotecnologia: 
Produção, Aplicação e Mercado. Ed. Interciência. 2008. Cap. 11, 12.
5. Gupta, R.; Beg, Q.K.; Lorenz P. Bacterial alkaline proteases: 
molecular approaches and industrial applications. Applied
Microbiology and Biotechnology. 59:15–32, 2002.
Bibliografia
Créditos:
Estas aulas foram originalmente criadas pelo professor Juliano 
Bicas e posteriormente adaptadas pelas professoras Isabel 
Braga e Katialaine Araújo