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INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL SUPLEMENTAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS EM DIETAS PARA LEITÕES NA FASE DE CRECHE Andréia Donizeti Chagas Vilas Boas Nova Odessa Janeiro - 2014 GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL SUPLEMENTAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS EM DIETAS PARA LEITÕES NA FASE DE CRECHE Andréia Donizeti Chagas Vilas Boas Orientador: Dr.º Fábio Enrique Lemos Budiño Co-orientador: Dr.º Messias Alves Trindade Neto Nova Odessa Janeiro - 2014 Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Produção Animal Sustentável. Ficha catalográfica elaborada pelo Núcleo de Informação e Documentação do Instituto de Zootecnia Bibliotecária: Tatiane Helena Borges de Salles CRB 8/8946 V697s Vilas Boas, Andréia Donizetti Chagas Suplementação de ácidos orgânicos em dietas para leitões na fase de creche./ Andréia Donizetti Chagas Vilas Boas. Nova Odessa, SP: [s.n.], 2014. 69 f.: il. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Zootecnia. APTA/SAA, Nova Odessa. Orientador: Dr. Fábio Henrique Lemos Budinõ Co-orientador: Dr. Messias Alves Trindade Neto 1. Nutrição Animal. 2. Digestibilidade. 3. Ácidos orgânicos 4. Ganho de peso. I. Budinõ, Fábio Henrique Lemos II. Trindade Neto, Messias Alves III. Titulo. CDD 636.4085 GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO ANIMAL SUSTENTÁVEL CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO: SUPLEMENTAÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS EM DIETAS PARA LEITÕES NA FASE DE CRECHE ANDRÉIA DONIZETI CHAGAS VILAS BOAS Orientador: Drº. Fábio Enrique Lemos Budinõ Co-orientador: Drº. Messias Alves Trindade Neto Aprovado como parte das exigências para obtenção de título de MESTRE em Produção Animal Sustentável, pela Comissão Examinadora: Drº. Fábio Enrique Lemos Budinõ (Orientador) Drª. Kelen Cristiane Zavarize BRNova Sistemas Nutricionais Drª. Keila Maria Roncato Duarte Instituto de Zootecnia Data da realização: 24 de Janeiro de 2014. Presidente da Comissão Examinadora Prof. Dr. Fábio Enrique Lemos Budinõ (Orientador) A MINHA FAMÍLIA DEDICO, Aos meus queridos pais, José e Lourdes pelo amor e apoio incondicional. Aos meus amados irmãos José Carlos, Cláudio e Adriana por estarem sempre ao meu lado, sob qualquer circunstância. As minhas cunhadas Gisélia e Polyana, e ao cunhado Rubinho, pelo carinho, amizade e apoio. A sogra Zilda e aos cunhados Juliana, Sebastian e Gabriel pela amizade e o estímulo constante. Aos meus sobrinhos Athos, Gabriel, Giovanni, Daniel, Lucas, Lorenzo, Luigi e as princesas Larissa, Lorena e Maria Rita, por me encherem de carinho e amor. Ao meu filho canino Bob Lee, pelo amor incondicional. A Deus por estar sempre presente em minha vida, guiando meus sonhos. COM TODO AMOR OFEREÇO, Ao meu marido Mauro, pelo amor, carinho, dedicação e paciência de sempre, e por ser além de meu melhor amigo, meu companheiro de todas as horas. AGRADECIMENTOS Ao meu orientador Prof.º Dr.º Fábio Enrique Lemos Budiño, pela oportunidade, confiança e pela paciência constante. Obrigada por gentilmente compartilhar seus conhecimentos. Ao meu Co-orientador Prof.° Dr.° Messias Alves Trindade Neto da FMVZ-USP, pela oportunidade do projeto e pelos conhecimentos transmitidos. A CAPES pela bolsa de estudos que permitiu minha dedicação exclusiva. A Empresa Comércio e Indústria Uniquímica Ltda, especialmente à Alessandra Schmidt pela oportunidade do projeto de pesquisa e auxílio durante todo experimento. A Prof.ª Dr.ª Keila M. R. Duarte e a Dr.ª Kelen C. Zavarize, primeiramente pela atenção e carinho, e também pelas considerações levantadas na defesa que foram de total relevância para finalização da dissertação. Aos Pesquisadores Dr°. Mauro Sartori e Dr. Rosana Possenti, pela participação no exame de qualificação e pela significativa contribuição no trabalho. A funcionária do Instituto de Zootecnia Rosely Bosquero pela ajuda e participação fundamental ao experimento. Aos amigos Renato Monferdini e Júlio Dadalt, e aos pesquisadores Carla Pizzolante e Evandro Moraes (APTA), pela ajuda durante o experimento. Vocês foram incríveis! Ao Marcelo Vinsly da empresa Ceze Rações, por nos ceder gentilmente sua fábrica e pela ajuda durante o processo. As funcionárias do Instituto de Zootecnia Marta Perissinatto (Pós-graduação), e Maria Aparecida Cassimiro (Hospedaria), pelo carinho de sempre! A pesquisadora do Instituto de Zootecnia Drª Ivani Pozar, pelo auxílio com as análises estatísticas. A querida amiga Marisa Manso pela companhia e amizade de sempre, e aos novos amigos que fiz no IZ, vocês são especiais! Ao grande amigo Lauro Lucchesi, por me apresentar ao curso do IZ, e ainda pela amizade e parceria de sempre. E por fim, agradeço a cada um dos 88 leitões utilizados nos experimentos, a eles todo o meu respeito. A grandiosidade de uma nação e o seu progresso moral podem ser medidos pela forma como os seus animais são tratados. (Mahatma Gandhi) O justo olha pela vida dos seus animais. (Provérbios 12:10) SUMARIO LISTA DE TABELAS ............................................................................................................ viii LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................. ix RESUMO ............................................................................................................................... x ABSTRACT .......................................................................................................................... xi 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 12 2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 14 2.1 Alterações do Sistema Digestivo de Leitões ao Desmame ......................................... 14 2.2 Sistema Digestivo dos Leitões .................................................................................... 15 2.3 Uso de Aditivos Antimicrobianos ................................................................................ 18 2.4 Ácidos Orgânicos ....................................................................................................... 20 2.4.1 Características dos Ácidos Orgânicos ..................................................................... 21 2.4.1.1 Acidificação Gástrica ............................................................................................ 22 2.4.1.2 CapacidadeTampão dos Ingredientes e B-value ................................................. 23 2.4.1.3 Efeito Antimicrobiano dos Ácidos Orgânicos ........................................................ 25 2.4.1.4 Digestibilidade e Retenção de Nutrientes ............................................................. 26 2.4.2 Acidificantes Utilizados Na Nutrição e Suínos ......................................................... 27 2.4.2.1 Ácido Fórmico ...................................................................................................... 27 2.4.2.2 Ácido Lático .......................................................................................................... 28 2.4.2.3 Ácido Cítrico ......................................................................................................... 29 2.4.2.4 Estudos com misturas (blends) de ácidos orgânicos ou seus sais. ....................... 29 2.4.2.5 Ácido Butírico e Butirato de Sódio ........................................................................ 30 2.4.2.5.1 Acidificação ....................................................................................................... 31 2.4.2.5.2 Morfologia Intestinal .......................................................................................... 31 2.4.2.5.3 Microbiota Intestinal ........................................................................................... 34 2.4.2.5.4 Desempenho ..................................................................................................... 35 3 MATERIAIS E METODOS ................................................................................................ 36 3.1 Local .......................................................................................................................... 36 3.2 Ensaio de Desempenho ............................................................................................ 36 3.2.1 Delineamento Experimental ..................................................................................... 37 3.2.2 Rações Experimentais ............................................................................................. 38 3.2.3 Variáveis Avaliadas ................................................................................................. 42 3.2.5 Análise Estatística ................................................................................................... 44 3.3 Ensaio de Digestibilidade ........................................................................................... 44 3.3.1 Delineamento e Coleta de Excretas ........................................................................ 45 3.3.2 Análises Estatísticas ................................................................................................ 46 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 47 5 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 56 6 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 57 viii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Fórmulas físicas e características químicas de alguns dos ácidos orgânicos utilizados como acidificantes em dietas de leitões................................ 22 Tabela 2. Composição de acidificantes Blend (mistura) e Butirato de sódio utilizado nas dietas experimentais.......................................................................... 38 Tabela 3. Composição centesimal das dietas experimentais, fornecidas na fase Pré I (0 a 10 dias) .................................................................................................. 39 Tabela 4. Composição centesimal das dietas experimentais, fornecidas na fase Pré II (10 a 24 dias) ............................................................................................... 40 Tabela 5. Composição centesimal das dietas experimentais, fornecidas na fase Inicial (24 a 45 dias) .............................................................................................. 41 Tabela 6. Composição nutricional calculada para rações nas fases Pré I (0 a 10 dias), Pré II (10 a 24 dias) e Inicial (24 a 45 dias )................................................ 42 Tabela 7. Médias para peso vivo inicial (P1), peso vivo aos 10 dias (P10), peso vivos aos 24 dias (P24), peso vivo aos 45 dias (P45), e valores obtidos para consumo diário de ração (CDR), ganho de peso diário (GDP) e conversão alimentar (CA), para o período de 0 a 45 dias de experimento........................................................................................................... 48 Tabela 8. Coeficiente de digestibilidade aparente da matéria seca (CDMS%), da proteína bruta (CDPB%), coeficiente de retenção nitrogênio (%), e valores de energia bruta (Kcal/kg), energia digestível (kcal/kg) e energia metabolizável (Kcal/Kg) da dieta Pré I para leitões ..................................................................... 52 Tabela 9. Coeficiente de digestibilidade aparente da matéria seca (CDMS%), da proteína bruta (CDPB%), coeficiente de retenção nitrogênio (%), e valores de energia bruta (Kcal/kg), energia digestível (kcal/kg) e energia metabolizável (Kcal/Kg) da dieta Pré II para leitões .................................................................... 52 Tabela 10. Coeficiente de digestibilidade aparente da matéria seca (CDMS%), da proteína bruta (CDPB%), coeficiente de retenção nitrogênio (%), e valores de energia bruta (Kcal/kg), energia digestível (kcal/kg) e energia metabolizável (Kcal/Kg) da dieta Inicial para leitões .................................................................. 53 Tabela 11. Custo por quilograma de ração (R$/kg ração), custo de ração por quilograma de peso vivo ganho (R$/kg GP) e índice de eficiência econômica, por fase e no período total do experimento ........................................................... 54 ix LISTA DE FIGURAS Figura 1. Animais alojados em baias experimentais do Instituto de Zootecnia, Nova Odessa/SP................................................................................................ 37 Figura 2. Exemplo de características das fezes observadas no experimento: fezes duras (escore 1) e fezes líquidas (escore 4) ............................................. 43 Figura 3. Animais alojados em gaiolas metabólicas durante adaptação........... 45 x Suplementação de ácidos orgânicos em dietas para leitões na fase de creche. RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da inclusão dietética de ácidos orgânicos sobre o desempenho, digestibilidade e viabilidade econômica de leitões na fase de creche. Dois experimentos foram conduzidos, onde no ensaio de desempenho (experimento 1), foram utilizados 64 leitões híbridos com pesos iniciais médios de 5,87±0,31kg, em um delineamento em blocos casualizados, para comparar o efeito de 4 tratamentos com 8 repetições, sendo dois leitões por baia (macho e fêmea). Para o ensaio de digestibilidade (experimento 2), foram utilizados 24 leitões híbridos com pesos iniciais médios de 8,21±0,79kg, em um delineamento em blocos casualizados, para comparar o efeito de tratamentos com 6 repetições cada. Os tratamentos foram: T1 (Controle) - dieta sem acidificantes; T2 (Blend) - controle + 0,5% do Blend (21% ácido lático, 18% de ácido fórmico e 10% de ácido cítrico); T3 (Butirato) - controle+ 0,1% de Butirato de Sódio; T4 (Blend + Butirato) - controle + 0,5% do Blend e + 0,1% de Butirato de Sódio. Não houve efeito dos acidificantes (p>0,05) sobre o consumo diário de ração (CDR), ganho de peso diário (GDP), e índice de conversão alimentar (CA), nos três períodos estudados (0 a 10, 0 a 24, e 0 a 45 dias de experimento). Não houve efeito dos ácidos orgânicos (p>0,05), sobre os coeficientes de digestibilidade aparente da matéria seca, proteína bruta, energia bruta e sobre os valores de energia digestível e metabolizável. Dietas com suplementação de butirato de sódio (T3), apresentou melhor vantagem econômica apenas para o período de 10 a 24 dias de experimento, no entanto, os acidificantes não proporcionaram melhor resultado econômico para as outras fases e também para o período total. Assim, em condições experimentais não ficou evidenciado o efeito dos aditivos acidificantes como promotores de crescimento para leitões desmamados, consumindo dietas complexas altamente digestíveis. Palavras-chave: acidificantes, suínos, aditivos, desempenho, digestibilidade xi Supplementation of organic acids in diets of weaned piglets ABSTRACT The purpose of this work was to evaluate the effects of dietary supplementation of organic acids on performance, digestibility and economical viability of weaning piglets. Two experiments were carried which performance trial (assay 1), it was used 64 piglets with an average weight of 5,87±0,31 kg in a completely randomized block design experiment to compare four treatments, with eight replicates of two pigs (male and female) per pen. In the digestibility trial (assay 2), it was allocated 24 piglets with an average weight of 8,21±0,79 kg in a completely randomized block design experiment to compare four treatments with six replicates each. The treatments were: T1 (Control) – diet without acidifier; T2 (Blend) - control + 0,5% of Blend ( 21% lactic acid, 18% of formic acid and 10% of citric acid); T3 (Butyrate) - control + 0,1% of sodium butyrate (coated butyrate) ; T4 (Blend + Butyrate) - control + 0,5% of Blend + 0,1% of Sodium Butyrate. There were no acidifiers effects (p>0,05) on daily feed intake, average daily weight gain and feed conversion over the three experimental period (from 0 to 10 days, from 0 to 24 days and from 0 and 45 days). There were no significant effects of acidifiers (p>0,05) on apparent digestibility coefficients of dry matter, crude protein, gross energy and the values of digestible and metabolizable energy. Diets containing sodium butirate (T3) provided best economical results only for 10 to 24 days experimental period, however acidifiers did not show economical efficiency for the other phases and also for complete period. Therefore, in the experimental conditions, there was no evidence of organic acids as grow promoter for weaning piglets fed with high digestibility complex diet. Keywords: acidifiers, swine, additives, performance, digestibility 12 1 INTRODUÇÃO A produção de suínos no Brasil apresenta importantes índices produtivos. No país, em 2012 foram produzidas cerca de 3,49 milhões de toneladas de carne suína, e desse total, 581.000 toneladas foram exportadas, configurando o país como o quarto maior produtor e exportador mundial de carne suína (ABIPECS, 2013). Uma das principais características da suinocultura industrial é a produção com alta qualidade e a preços mais competitivos, visto que o consumidor está cada vez mais exigente. A nutrição passa a ser uma ferramenta fundamental para o desenvolvimento da suinocultura industrial e a expansão da cadeia produtiva nacional. Por representar entre 70 a 75% do custo total de produção, os suinocultores buscam alternativas no manejo nutricional, para aperfeiçoar os ganhos no sistema de produção. Dentre as estratégias mais utilizadas na suinocultura industrial está a redução do período de aleitamento, visando máxima produtividade com o maior número de leitões desmamados/porca/ano. Sabe-se que o desmame de leitões entre 21 e 28 13 dias é uma prática muito comum, e esta fase, assim como os dias subsequentes, constitui um período crítico para o desenvolvimento dos leitões. O desmame é caracterizado pela alta taxa de mortalidade e outros fatores também influenciam diretamente o desempenho de leitões: como separação da mãe, formação de novos lotes com outros leitões, mudança de alimentação que favorecem o aparecimento de diarréia pós-desmame, que em geral ocorre normalmente entre três a dez dias após desmame, que debilita o animal, e pode o levá-lo a morte (CORASSA, 2004). Sabe-se que nesta fase, o sistema digestivo do leitão é imaturo. O pH no trato digestivo de leitões recém-desmamados é alto, quando comparado ao de adultos, o que afeta intensamente a fisiologia do animal. A digestão dos nutrientes é reduzida pela baixa atividade enzimática no trato digestivo, resultando em diarréia osmótica, favorecendo a proliferação de micro- organismos patogênicos como Escherichia coli e a Salmonella Spp. (MIGUEL, 2008; VIOLA et al. 2003), além de alterar morfologicamente a estrutura da mucosa intestinal e tornar o animal susceptível a doenças infecciosas (FREITAS, 2005). Nesta fase, a simples redução do pH, via secreção gástrica já controlaria o desenvolvimento de patógenos. Problemas com o pós-desmame podem ser controlados com a utilização de aditivos antimicrobianos, como promotores de crescimento. Ácidos orgânicos, seus sais, bem como as misturas de dois ou mais ácidos, são utilizados em dietas para leitões recém desmamados como alternativas ao uso de antibióticos promotores de crescimento, ou ainda associados aos antimicrobianos. A suplementação de dietas de leitões desmamados com ácidos orgânicos, tem demonstrado importantes ações na redução do pH estomacal, ação bactericida e aumento da atividade enzimática com estimulo a secreções pancreáticas, reduzindo a frequência de diarréia e melhorando o desempenho de leitões, especialmente nas duas primeiras semanas que seguem o desmame (FREITAS, 2005). Nesse sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação de ácidos orgânicos em dietas para leitões desmamados, na avaliação de desempenho, balanço nutricional e viabilidade econômica. 14 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Alterações do Sistema Digestivo de Leitões ao Desmame A fase pós-desmame caracteriza-se como um grande desafio para o leitão. Dependendo dos substratos utilizados na dieta, o sistema enzimático do leitão se completa até a oitava semana de idade. No entanto, com a finalidade de aumentar os índices produtivos da granja como número de partos/porcas/ano e números de leitões desmamados/porca/ano, tem sido comum a desmama precoce com idades iguais ou inferiores a 21 dias de idade (SILVA, 2008). Dentre as características dos leitões nesta fase estão: a insuficiência das enzimas digestivas, a reduzida capacidade de absorção devido a arquitetura dos vilos, a secreção gástrica mal desenvolvida e o baixo consumo de ração, fatores que limitam o crescimento do animal até a fase de terminação (CORASSA, 2004). No período de desmame, o sistema digestivo dos leitões adaptam-se à transição entre alimentos líquidos e os sólidos (WANG et al., 2007), e à transição de refeições pequenas e frequentes (liberação de nutrientes para o intestino delgado 15 lenta e constante), para refeições maiores e com menor frequência(MCDONALDS et al., 2002). Outro fator importante nesta fase de desmame é a retirada do leite materno, que representa a supressão de fatores de crescimento que auxiliam no desenvolvimento e na maturação intestinal (KELLY et al., 1990; MELLOR, 2000), além da perda da imunidade passiva conferida pelas imunoglobulinas quando os leitões ainda não apresentam seu sistema imune totalmente desenvolvido, predispondo-os a doenças entéricas e respiratórias (GASKINS et al., 1995; MELLOR, 2000; SILVA, 2009). O sistema digestivo dos leitões, desde ao nascimento e até o desmame, é adaptado para secretar enzimas que digerem o leite, mas não para alimentos de origem vegetal. Assim, a atividade de lactase é alta e das lípases e proteases são suficientes para agir sobre a gordura e as proteínas do leite. Imediatamente após o desmame, o sistema digestivo do leitão deve-se adaptar à mudança do regime alimentar, com a secreção de enzimas especializadas. Entretanto, as atividades das enzimas pancreáticas sofrem redução imediatamente após o desmame, tendendo a voltar ao padrão normal de desenvolvimento após este período (VIEIRA, 2010). Associadas ao processo de desmame, a mucosa intestinal altera-se, diminuindo as capacidades digestivas e absortivas do intestino delgado (SILVA, 2009). Alterações histológicas e bioquímicas ocorrem no intestino delgado, como atrofia de vilosidades e hiperplasias de criptas, diminuindo a capacidade digestiva e absortiva, estimulando a incidência de diarreia. Quanto mais cedo é realizado o desmame, maiores e mais duradouras são estas alterações (HOTZEL, 2004). Neste sentido, o desmame precoce pode-se associar a distúrbios gastrointestinais e diminuição no crescimento, sendo indicada nesta fase, a formulação de dietas de alto valor biológico, a partir do sétimo ou décimo dia após o nascimento, onde o consumo de ração precoce pode estimular o desenvolvimento do sistema enzimático, favorecendo melhor aproveitamento das dietas (FERREIRA, 2001). 2.2 Sistema Digestivo dos Leitões Os suínos são classificados como animais monogástricos possuem estômago simples e ceco não funcional, o que lhes confere três características digestivas 16 básicas, como pequena capacidade de armazenamento de nutrientes, baixa capacidade de síntese de nutrientes e baixo aproveitamento de fibras (LOVATTO, 2013). No suíno, a digestão realiza-se ao longo de todo o trato gastrointestinal (TGI), iniciando-se na boca e ocorrendo também no intestino grosso, porém com maior eficiência no intestino delgado. Os movimentos peristálticos têm como funções o transporte de materiais ao longo do TGI, a mistura dos sucos digestivos com o alimento e proporcionar o contato dos nutrientes digeridos com a membrana da mucosa intestinal para sua absorção. Existem diversas secreções que são escoadas para o interior do TGI, sendo que muitas destas contêm enzimas que hidrolisam os diferentes componentes dos alimentos (MORAIS, 2009). Ao nascer, o leitão está apto para digerir as proteínas do leite que sofrem a ação da renina, enzima secretada no estômago de leitões jovens. Os níveis de proteinases intestinal são baixos até 28 dias de vida do leitão (LOVATTO, 2013). O estômago é o local onde se inicia a digestão proteica, devendo apresentar pH baixo (2,0 a 3,5), para que ocorra a ativação das proteases gástricas (PARTANEN, 2001). O suco gástrico contém água, pepsinogênio, sais inorgânicos, mucos, ácido clorídrico e o fator intrínseco que promove a eficiente absorção de vitamina B12. De maneira geral a presença do alimento aumenta o pH no estomago, e através de estímulos nervosos e hormonais, induz a secreção de ácido clorídrico (HCl), que reduz o pH, eliminando microrganismos patogênicos, que protege os animais contra infecções entéricas, além de estimular a ação de enzimas para hidrólise de proteínas e disponibilização de minerais (BRAZ, 2008). No caso de leitões, seu estômago produz uma quantidade limitada de ácido clorídrico e pepsinogênio, e também produz quimosina, que faz a quebra parcial e a aglutinação da caseína do leite. O leite coagula no estômago, e a pequena secreção de ácido clorídrico é compensada com a produção de ácido láctico pelos Lactobacillus que fermentam a lactose. Isto assegura que o pH decresça aos níveis que favorecem a eficiente hidrólise das proteínas e que inibem as bactérias patogênicas (MORAIS, 2009). A lactose é facilmente hidrolisada por leitões jovens a partir do primeiro dia de vida, é o mais importante dissacarídeo presente no leite, além de ser o carboidrato 17 que é prontamente hidrolisado no trato digestivo dos leitões. Em particular é um bom nutriente para Lactobacillus que quando presente em grandes quantidades, inibe a proliferação da E. coli. Os níveis de lactase em leitões lactentes são elevados nas primeiras 3 semanas de vida (LOVATTO, 2013). Animais adultos conseguem ajustar o pH gástrico por intermédio da secreção de HCl, mas como a fase de desmama é caracterizada pela baixa capacidade secretora, o pH neste período é mais alto devido a pequena quantidade de HCl produzida. O pH elevado, no início da vida é necessário para que as imunoglobulinas passem intactas, pois em condições ácidas adequadas, a ação das peptidases gástricas é mais intensa. Mas para leitões desmamados, a incapacidade de manter o pH gástrico baixo nas primeiras semanas pode estar relacionado ao baixo ganho de peso, má absorção de nutrientes e distúrbios intestinais que ocorrem nesta fase (BIAGI et al., 2007; BOUDRY et al., 2004). Como consequência, o período pós-desmame é caracterizado ainda por redução do consumo e redução das taxas de crescimento. As alterações intestinais mais frequentes neste período incluem modificações na morfologia das vilosidades/criptas e na atividade das enzimas no rebordo das vilosidades, bem como, implicações nos patógenos entéricos, que diminuem a atividade das enzimas digestivas no intestino (TONEL, 2009; MROZ et al., 2003; PLUSKE et al., 1997). De acordo com HERDT (1999), os enterócitos das criptas têm alta capacidade mitótica regenerando com rapidez. À medida que as células das criptas se multiplicam, migram até à base das vilosidades e vão empurrando as outras células para a extremidade das mesmas. Enquanto migram sofrem uma maturação, de células relativamente indiferenciadas, ao nível das criptas, para células especializadas de absorção, nas vilosidades. Na extremidade da vilosidade ocorre descamação devido à idade das células e à sua exposição ao conteúdo intestinal, sendo o que determina o comprimento das vilosidades a relação entre descamação/substituição. Em média, o tempo de reposição de um enterócito é de 4 a 7 dias, variando com a espécie e estado fisiológico (MORAIS, 2009; HERDT, 1999). No período pós-desmama ocorre normalmente atrofia das vilosidades em decorrência do maior aumento na taxa de descamação epitelial por consequência do 18 início do consumo da ração sólida, do baixo consumo de ração, de toxinas bacterianas e da adesão de bactérias aos enterócitos (OETTING et al., 2006; CERA et al., 1988). Nesse processo ocorre o incremento da profundidade da cripta para assegurar a adequada taxa de renovação celular e garantir a reposição das perdas de células da região apical. Nesse sentido, quanto maior a altura de vilosidades, e menor a profundidade das criptas, melhor a absorção de nutrientes e menores as perdas energéticas com a renovação celular (OETTING et al., 2006). Nesse período também podem ocorrer à colonização da superfície epitelial por patógenos, como a Escherichia coli enterotoxigênica, SalmonellaTyphimurium e Clostridium spp, provocando diarreias (UTYAMA et al., 2006). 2.3 Uso de Aditivos Antimicrobianos De acordo com MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2009), os aditivos são definidos como produtos destinados à alimentação animal, e podem ser: substância, micro-organismo ou produto formulado, que são adicionados aos produtos, que podem ou não ter valor nutritivo, melhorar as características dos produtos, o desempenho dos animais sadios e atender às necessidades nutricionais ou ainda ter efeito anticoccidiano. Dentro da classificação de aditivos, estão os aditivos zootécnicos que incluem os ácidos orgânicos, probióticos, prebióticos, simbióticos, nutracêuticos, enzimas e os antibióticos promotores de crescimento. Os aditivos antimicrobianos (antibióticos e quimioterápicos) são utilizados desde a década de 50 como promotores do crescimento na produção animal (OETTING et al., 2006). O uso de antimicrobianos, com função de melhorar o desempenho, em dosagens subterapêuticas, agem no controle de doenças subclínicas, aumentando a digestibilidade e a absorção de nutrientes e reduzindo o “turnover” dos enterócitos, em decorrência da redução da ação de toxinas bacterianas (RUTZ e LIMA, 2001). O mecanismo de ação dos promotores de crescimento ainda não está completamente elucidado, mas sabe-se que sua atuação é na microbiota intestinal, provavelmente, inibindo o metabolismo bacteriano e reduzindo a competição entre a bactéria e o hospedeiro (FARIA et al., 2009). 19 No entanto, o uso destes medicamentos como promotores de crescimento, especialmente os antimicrobianos, preocupa a comunidade científica e a opinião pública, devido a possível presença de resíduos em alimentos de origem animal que pode prejudicar a saúde do consumidor, e o uso de antimicrobianos nos animais de produção, teoricamente pode contribuir para o aumento da incidência/prevalência de resistência microbiana na medicina humana (MAPA, 2006). Apesar da comprovada capacidade de melhorar o desempenho nos animais, como aves e suínos, o uso de antimicrobianos como promotores do crescimento está sendo progressivamente restringido. A Comunidade Europeia baniu em 2006 o uso de antimicrobianos como promotores de crescimento (PENZ JUNIOR et al. 2010; FRANCO, 2009). No Brasil foram estruturados dois grupos de pesquisa pelo MAPA em 2004 e 2006, formado por especialistas para avaliarem a proibição de moléculas como bacitracina de zinco, fosfato de tilosina, avilamicina, monensina, dentre outras. Estes especialistas entenderam que estes princípios ativos não deveriam ser excluídos no Brasil, por não apresentarem riscos à saúde do homem, conforme os conhecimentos atuais sobre a toxicidade e resistência bacteriana (MAPA, 2006). No Brasil, o DIPOA (Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal) ligado ao MAPA, é o órgão responsável pela fiscalização das normas estabelecidas pelo Codex Alimentarius (2013), que define padrões de qualidade e de uso de produtos na produção animal ou no processamento da carne, e quais são os limites máximos permitidos e prazos de carência para o seu uso (BRIDI, 2010). Alguns indicadores de produção no Brasil têm sugerido que a retirada destas moléculas promotoras de crescimento pode aumentar o custo de produção em valores significativos, comprometendo o poder de compra das famílias de baixa renda na aquisição de alimentos de origem animal (MAPA, 2004). Outro ponto importante é que atualmente o MAPA autoriza o uso de aditivos promotores de crescimento, desde que o produto esteja devidamente registrado, e o seu modo de uso, dosagem e período de carência sejam respeitados. Porém, não autoriza o uso de aditivos combinados sem que a associação esteja previamente aprovada e registrada, desde a publicação do Oficio Circular 16/2007, que trata dos procedimentos para o registro de associação/combinação de aditivos zootécnicos 20 antimicrobianos e de anticoccidianos em produtos destinados à alimentação animal (PENZ JUNIOR et al. 2010). O uso de antibióticos promotores de crescimento associados era uma prática comum nas granjas brasileiras visando o controle de duas categorias de micro- organismos (Gram+ e Gram-), o que atualmente é proibido pela legislação. Uma opção é a escolha de um promotor de crescimento, aliado a outros tipos de aditivos zootécnicos (como ácidos orgânicos, probióticos, prébioticos, dentre outros), visando a promoção da saúde intestinal e melhoria do desempenho animal. 2.4 Ácidos Orgânicos Ácidos orgânicos são substâncias que contém uma ou mais carboxilas em sua molécula, de estrutura geral R-COOH, gerando grupos ou compostos conhecidos como derivados dos ácidos carboxílicos, como os aminoácidos, os ácidos graxos, coenzimas e metabólitos intermediários (VIOLA, 2006; SOLOMONS; FRYHLE, 2002). Em nutrição animal normalmente referem-se a ácidos fracos de cadeia curta, aqueles associados com atividade antimicrobiana, com um a sete átomos de carbono na molécula (C1-C7), e que produzem menor quantidade de prótons por molécula ao se dissociarem (SINDIRAÇÔES, 2005). Estão amplamente distribuídos na natureza como constituintes normais de plantas ou tecidos animais e constituintes naturais de diversos alimentos, podendo ocorrer no trato digestivo e produtos do metabolismo intermediário de animais (PARTANEN et al., 1999; BARBOSA, 2009). Apresentam efeitos fisiológicos relacionados com o sistema imune, com o esvaziamento gástrico e motilidade intestinal, absorção de minerais e água. São constituintes naturais de diversos alimentos, ocorrem no trato digestivo e produtos do metabolismo intermediário dos animais (SINDIRAÇÔES, 2005). O uso de ácidos orgânicos e seus sais como aditivos não é uma prática recente, os efeitos favoráveis em diferentes características como segurança alimentar, processos digestivos, desempenho animal e qualidade de produtos são conhecidos há longo tempo, e aplicáveis através do uso em diferentes sistemas via ração e/ou água de bebida (PARTANEN; MROZ, 1999; TSILOYIANNIS et al. 2001; WENK, 2002; BIAGI et al., 2007). 21 A utilização de ácidos orgânicos nas dietas de leitões contribui para a redução do pH estomacal, aumenta a atividade de enzimas, melhora a digestibilidade de alguns nutrientes e reduz o crescimento de microrganismos (PENZ JUNIOR, 1991; BOCKLOR et al., 2007;). 2.4.1 Características dos Ácidos Orgânicos Os ácidos orgânicos apresentam diferentes formas físicas, os ácidos fumárico, cítrico e sórbico estão sob a forma de pó, enquanto o HMTBA (2-hydroxy- 4-methithio butanóico), butírico, fórmico, propiônico e acético são líquidos, onde os três últimos devido sua característica corrosiva são de difícil manuseio. Uma forma de facilitar seu manuseio é utilizá-los na forma de sais, que estão sob a forma de pó, facilitando a sua inclusão na dieta. Além da função ácida, eles ainda são fontes de nutrientes como cálcio e sódio (SINDIRAÇÔES, 2005). Alguns ácidos orgânicos têm sabor e cheiro fortes, sendo importante observar a aceitabilidade de dietas acidificadas. Partanen (2001) cita que em estudo realizado com dietas oferecidas aos leitões para livre escolha, uma sem acidificante e a outra acidificada com mistura a base de ácido cítrico e fumárico, os animais tiveram preferência pelas dietas sem acidificação. Além disso, condições de forte acidificação gástrica não são indicadas, pois podem resultar no desenvolvimento de úlceras gástricas. Algumas propriedades físicas e químicas dos ácidos orgânicos utilizados na acidificação de dietas de leitões são apresentados naTabela 1. 22 Tabela 1. Fórmulas físicas e características químicas de alguns dos ácidos orgânicos utilizados como acidificantes em dietas de leitões. Ácido Formula MM1 (g/mol) Forma pKa2 Formico HCOOH 46.03 Líquido 3.75 Acetico CH3COOH 60.05 Líquido 4.76 Propionico CH3CH2COOH 74.08 Líquido 4.88 Butirico CH3CH2CH2COOH 88.12 Líquido 4.82 Latico CH3CH(OH)COOH 90.08 Líquido 3.83 Fumarico COOHCH:CHCOOH 116.07 Solido 3.02 / 4.38 Cítrico COOHCH2C(OH)(COOH) CH2COOH 192.14 Solido 3.13/ 4.76/ 6.40 1MM – massa molecular expressa em gramas. 2pKa- constante de dissociação Adaptado de Partanen et al., 1999. 2.4.1.1 Acidificação Gástrica As condições de acidificação gástrica são consideradas essenciais para a prevenção da sobrevivência de patógenos no estomago para que eles não possam ter acesso ao intestino delgado. As doenças podem resultar também do aumento do número de bactérias que colonizaram o intestino antes do desmame (PARTANEN, 2001). Os níveis de acidez no trato gastrointestinal estão normalmente entre pH 2-4 no estômago, elevando-se para pH 5-6 no intestino delgado, e acima de 7 no intestino grosso. Valores acima de 6, aumenta a probabilidade de redução da eficiência de enzimas e da proliferação de bactérias patogênicas. Ácidos orgânicos como propiônico, fórmico, cítrico, lático e fumárico podem ser adicionados a dieta auxiliando na resposta caso ocorra o aumento de pH no estomago, principalmente em momentos de estresse dos leitões (WHITTEMORE, 1993). A manutenção de baixo pH gástrico é essencial a eficiente digestão de proteínas. Pepsinogênios são rapidamente ativados em pH 2, e lentamente em pH 4. Os produtos finais da digestão da pepsina e o baixo pH da digesta entram no duodeno e são envolvidos na estimulação da secreção pancreática de enzimas e 23 bicarbonato, atuando na regulação do esvaziamento gástrico. Condições ácidas são necessárias para prevenir a passagem de potenciais microrganismos nocivos para o intestino delgado (PARTANEN; MROZ, 1999). Outro fator importante na regulação de pH é a capacidade tampão da dieta, onde dietas ricas em proteínas e minerais podem resistir a mudanças no pH (PARTANEN, 2001). Existe dificuldade em demonstrar “in vivo” que dietas com ácidos orgânicos reduzem pH. Isso devido a obtenção de dados, como por exemplo, o tempo entre a última refeição e o momento da coleta da digesta para medidas de pH, local onde são feitas as amostragens e também devido o fato de que as amostras são colhidas, em geral, logo após o abate, em animais com mais de 60 dias de idade com sistema digestivo já desenvolvido. 2.4.1.2 Capacidade Tampão dos Ingredientes e B-value Para maximizar o aproveitamento de nutrientes pelos leitões na fase de desmama, outro fator extremamente importante para acidificação do trato digestivo além da utilização de ácidos orgânicos, é a escolha adequada de ingredientes com menor capacidade tamponante, para favorecer a digestão de nutrientes (BUNZEM, 2006). A capacidade tamponante (CT) de uma solução é sua resistência à troca de pH e tem sido definida em nutrição animal como a capacidade em suspensão aquosa de um alimento em permitir a mudança de pH em decorrência da adição de uma solução ácida ou básica (BOCKOR et al. 2007). Diversos métodos têm sido adotados para medir essa capacidade tamponante dos alimentos para animais, também chamado de B-value, valor B ou valor tampão, que indica a quantidade de ácido necessária para diminuir o valor do pH de dado alimento balanceado. Makkink (2002), descreve B-value como a quantidade (mEq) de HCL 1,0 M necessária para acidificar um quilograma de alimento até pH 4 ou 5. O método usualmente utilizado para suínos é a partir da titulação até o pH 5 de 10 gramas de ingrediente suspenso em 90 ml de água destilada. A quantidade de ácido requerida (ml) representa a capacidade tampão. 24 Diferentes nutrientes na alimentação animal aumentam a capacidade tampão do alimento, fator muito importante na alimentação de leitões. O B-value de um alimento é importante, pois pode afetar o curso da digestão. Fornecendo uma ração com elevado B-value significa que este pode absorver grandes quantidades de H+ e que o pH do estomago e do trato digestivo proximal irão permanecer elevados (LEVIC et al., 2005). A manutenção do pH gástrico baixo é importante por várias razões. Primeiro, a pepsina, enzima proteolítica do estomago só é ativada a um pH baixo (pH 2 a 4). Se o pH gástrico permanece alto, altera a degradação de proteínas no estomago, afetando não só a facilidade de digestão e utilização de nitrogênio, como também de minerais (MAKKINK, 2002; MROZ et al., 1997). Também é essencial para controle da população de bactérias patogênicas no estomago, como Salmonella, E. coli e espécies de Klebsiella. Já espécies benéficas de bactérias como Bifido e Lactobacillus são mais tolerantes a valores mais baixos de pH (LEVIC et al., 2005; MAKKINK, 2002). No caso de animais jovens como leitões, os valores de B-value elevados podem causar problemas à saúde desses animais principalmente devido a menor capacidade dos mesmos de secretar ácido gástrico. Os valores ótimos de B-value na dieta variam devido a diversos fatores, como ingredientes, espécie animal, nível de desenvolvimento, dentre outros. Mas a escolha adequada dos ingredientes e níveis de inclusão podem contribuir de maneira significativa no efeito da capacidade tamponante. Levic et al. (2005), ao avaliarem a capacidade tamponante de 22 ingredientes utilizados em rações, verificaram que fontes de proteínas (grão soja, farinha de peixe, leite em pó), geralmente possuem elevada capacidade tamponante, e cereais (milho, trigo, cevada) possuem baixo valor de B-value. Os suplementos minerais possuem valores elevados de B-value, principalmente devido ao carbonato de cálcio, normalmente usado como veículo. Portanto, dietas com elevadas concentrações de proteínas e minerais tendem a ter valores de B-value maiores, e estas características são típicas de dietas para leitões jovens, recém desmamados. Aumentar o conteúdo mineral de uma dieta de leitões de 0 para 4% promove como resultado o triplo de aumento do valor do B- value (MAKKINK, 2002). 25 Redução dos níveis de inclusão de ingredientes proteicos e minerais e a utilização de estratégias com o uso de aditivos como ácidos orgânicos, contribuem para redução do pH gástrico e redução do efeito tampão. A escolha adequada de ingredientes da dieta e sua composição é extremamente importante, pois pode influenciar inclusive na eficácia dos ácidos orgânicos (PARTANEN et al., 2002). A adição de ácidos orgânicos é mais efetiva quando realizada em dietas simples, à base de cereais e farelo de soja, que em rações de maior complexidade, com proteínas de origem animal e produtos lácteos (SILVA et al. 2008). No leitão em fase de desmama, a lactose derivada dos produtos de leite é convertida a ácido lático (BOCKOR et al, 2007), criando mudanças desejáveis no desenvolvimento gástrico e também reduzindo a eficácia da acidificação (PARTANEN, 2001). O uso da lactose e sua fermentação a ácido lático reduz a necessidade de acidificação da dieta (PARTANEN e MROZ, 1999; SILVA et al. 2008). 2.4.1.3 Efeito Antimicrobiano dos Ácidos Orgânicos Na ração os ácidos orgânicos podem reduzir o crescimento de micro- organismos pela redução de pH ou por efeito antimicrobiano específico (WENK, 2002; PARTANEN, 2001). Sabe-se que todos os microrganismos tem um pH ótimo de desenvolvimentoe um intervalo de pH onde fora dele fica inviável o crescimento. As bactérias entéricas, como Escherichia e Salmonella crescem em pH próximos da neutralidade (neutrófilos), devido a natureza logarítmica da escala de pH, uma diminuição de 1 ou 2 unidades (equivalente a um aumento de 10 ou 100 vezes a concentração de prótons), tem um efeito drástico sobre a proliferação destes micro-organismos (PALENZUELA, 2000). No entanto, sabe-se que algumas bactérias como Escherichia e Salmonella têm evoluído com mecanismos complexos contrários que permitem se reproduzirem em condições extremamente ácidas (PARTANEN, 2001). Os níveis para eficácia dos ácidos orgânicos dependem do tempo de exposição, da concentração do ácido e do tipo de ácido utilizado. Bactérias gram-negativas são sensíveis aos acidificantes com menos que oito carbonos, enquanto que as gram-positivas mostram-se mais 26 sensíveis com o aumento do comprimento da cadeia e da molécula, tornando-se mais lipofílicas. A eficácia de um ácido em inibir micro-organismos é dependente do seu valor de pKa (relacionado a constante de dissociação de um ácido), que é a capacidade de um ácido orgânico estar dissociado em solução aquosa. Portanto, cada ácido orgânico tem seu valor de pKa, quando este ácido está presente em uma solução aquosa com o mesmo valor em pH, significa que nesse momento 50% desse ácido estará dissociado e 50% indissociado, ou seja, as formas ionizadas e não ionizadas estão na mesma concentração em equilíbrio. Este conceito de pKa proporciona uma medida da força do ácido. Os ácidos fortes tendem a valores próximos a 1, onde a maioria dos ácidos orgânicos tem valores entre 3 e 5 (PARTANEN, 2001; PALENZUELA, 2000). Ácidos orgânicos com elevado valor de pKa são mais efetivos como preservativos e sua eficácia antimicrobiana é geralmente melhorada com o aumento do comprimento da cadeia e grau de insaturação (CORASSA, 2004). Os ácidos orgânicos indissociados (ou não dissociados), são lipofílicos e podem difundir-se passivamente através da parede celular das bactérias (PARTANEN, 2001), dissociar-se quando o pH interno é superior a constante de dissociação (pKa), e promover a diminuição do pH interno. Os íons de H+ reduzem o pH interno, sendo incompatível com bactérias que não toleram um gradiente significativo de pH em ambos os lados da membrana. Os prótons são bombeados para fora da bactéria, por ação da bomba de ATPase, consumindo energia e esgotando completamente a bactéria. A síntese de ácido nucleico é interrompida, bloqueando as reações enzimáticas e alterando o transporte através da membrana (CHIQUIERI et al., 2009; GAUTHIER, 2005). 2.4.1.4 Digestibilidade e Retenção de Nutrientes Dietas para leitões suplementadas com uso de ácidos orgânicos podem aumentar a digestibilidade total aparente e retenção de nutrientes em dietas para leitões (PARTANEN, 2001; PARTANEN; MROZ, 1999). Em particular, os ácidos orgânicos exercem uma pequena, mas positiva influência na retenção de proteína bruta e energia, locais onde a influência de outros nutrientes são menos consistentes. 27 2.4.2 Acidificantes Utilizados Na Nutrição e Suínos 2.4.2.1 Ácido Fórmico O ácido fórmico é um líquido transparente, incolor, com odor pungente. Ingerido o ácido fórmico é rapidamente absorvido através das membranas das mucosas. Na forma indissociada pode rapidamente difundir-se através da membrana, onde o mecanismo de absorção é similar a outros ácidos orgânicos de cadeia curta. É um efetivo acidulante, mas pode inibir descarboxilases microbianas e enzimas como as catalases. A atividade antimicrobiana é primeiramente contra leveduras e algumas bactérias, sendo efetivo em pequenas concentrações (21.7 mM) contra E. coli, e no tratamento de rações contaminadas por Salmonella, mas bactérias láticas e fungos são relativamente resistentes ao seu efeito (PARTANEN; MROZ, 1999). Em um trabalho realizado in vitro, Franco et al. (2004), testaram o efeito da adição dos ácidos fórmico, lático e fumárico e suas combinações sobre a população microbiana do estomago de leitões desmamados, para diferentes pH (3 e 4). Os resultados mostraram que todas as combinações reduziram o número de coliformes a menos 102 por ml, independente do pH médio. No entanto, o número de Lactobacilos (bactérias benéficas) foram reduzidas para os tratamentos com presença de ácido fumárico e intermediário para os tratamentos com os ácidos lático e fórmico, em relação ao tratamento sem acidificante. Gomes et al. (2007), ao estudarem o efeito do ácido fumárico isoladamente e sua combinação com ácido butírico e fórmico em dietas para leitões recém- desmamados aos 15 dias de idade, verificaram efeito significativo apenas para animais tratados com ácido fumárico, e as associações de fumárico (1,0%) e fórmico (0,5%) diminuiu o ganho de peso diário dos leitões e, fumárico (1,0%), butírico (0,1%) e fórmico (0,5%) causaram prejuízos na altura das vilosidades do duodeno nas primeiras três semanas pós-desmame. Em um estudo realizado por Corassa et al. (2006), com a inclusão de ácido fórmico na dieta de leitões de 21 a 48 dias de idade, verificaram que dietas contendo ácido fórmico, devem ser suplementadas com ácido fólico (0,64mg/ kg de ração), pois os suínos possuem níveis extremamente baixos da enzima responsável pela 28 oxidação do formiato no fígado, reduzindo as reservas hepáticas de folato e gerando deficiência de ácido fólico, e ainda limitando a capacidade de oxidação do formiato. De acordo com Partanen e Mroz (1999), certos ácidos como tartárico e fórmico tem um sabor e cheiro fortes e um aumento nos níveis de acidificação da dieta é geralmente associado com redução na ingestão alimentar, e como reflexo o baixo ganho diário. 2.4.2.2 Ácido Lático O ácido lático é líquido, e tem odor semelhante ao do soro de leite. É produzido por muitas espécies de bactérias, principalmente aquelas do gênero Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus e Leuconostoc. É um constituinte natural de alguns ingredientes e está entre os mais antigos conservantes. No estomago e no intestino delgado, o ácido lático é produzido como produto final da fermentação de açúcar (PARTANEN; MROZ, 1999). Acidificantes de água de bebida ou ração líquida com elevado conteúdo de ácido lático pode ser mais efetivo na redução do pH gástrico, pois mais ácido é ingerido que na ração seca (PARTANEN, 2001). Freitas et al. (2006), ao avaliarem os efeitos da inclusão crescente de misturas de ácidos orgânicos a base de ácido lático (além de fórmico, fosfórico e acético), concluíram que a utilização de 0,84% de inclusão na dieta proporcionou melhor conversão alimentar em leitões no período de 21 a 35 dias, além de melhor consistência de fezes e controle de E. coli e Streptococus sp, também na inclusão de 0,63% no período de 36 a 49 dias. Sabe-se que o ácido lático além da atividade antimicrobiana, contribui para modificação da microbiota intestinal, mediante a produção de um meio favorável para bactérias láticas, promovendo benefícios ao organismo do animal. Tsiloyiannis et al. (2001a), avaliaram em leitões o efeito da suplementação de ácidos orgânicos na eficácia do controle da síndrome de diarréia pós-desmame, causado principalmente pela E.coli. Foram suplementados com os níveis de ácidos: lático (1,6%), propiônico (1,0%), fórmico (1,2%), málico (1,2%), cítrico (1,5%) e fumárico (1,5%), em comparação ao grupo controle sem antibiótico ou com uso de dieta medicada com lincomicina (44ppm) e espectinomicina (44ppm). Em todos os parâmetros avaliados, os ácidosorgânicos reduziram a incidência e severidade de 29 diarréia e o desempenho foi significativamente melhor que o grupo controle, sem o uso de antibióticos. 2.4.2.3 Ácido Cítrico O ácido cítrico é produzido por fermentação, apresenta-se cristalino e inodoro, com sabor azedo agradável, sendo geralmente menos efetivo como agente antimicrobiano que outros ácidos orgânicos, particularmente porque muitos microrganismos podem metabolizá-lo e também devido ao baixo pKa (PARTANEN et al., 1999). O ácido cítrico é metabolizado através do ciclo do ácido cítrico e pode atuar como uma fonte de energia (PARTANEN; MROZ, 1999). O ácido cítrico é disponível comercialmente na forma monohidratado ou anidro. Ajuda a preservar a textura, coloração, o aroma e o conteúdo de vitaminas dos alimentos, sendo particularmente usual como agente quelante (VIOLA, 2006). Em outro estudo, Tsiloyiannis et al. (2001b), ao avaliarem em leitões desmamados, a doença do edema causada por E. coli, os animais foram suplementados com ácido lático (1,6%), ácido cítrico (1,5%) ou antibiótico enrofloxacina (50ppm). Os resultados mostraram que todos os grupos suplementados tiveram baixa mortalidade em relação ao grupo controle e apresentaram melhor desempenho para crescimento e conversão alimentar. 2.4.2.4 Estudos com misturas (blends) de ácidos orgânicos ou seus sais. Braz et al. (2011), avaliaram diferentes combinações de acidificantes contendo ácido fórmico, fosfórico, lático, e butirato de sódio foram testadas em comparação a tratamento com colistina e dieta controle, para leitões desmamados em torno de 24 dias. Os resultados mostraram que misturas contendo lático mais butirato de sódio proporcionaram melhores resultados para peso aos 14 dias e ganho diário de peso e melhor conversão que outros tratamentos, além de apresentar menores valores de profundidade de cripta do jejuno e maior relação altura de vilosidade:profundidade de cripta do jejuno que outros tratamentos. No estudo realizado por Miguel et al. (2011), em rações para leitões desmamados aos 21 dias de idade, foram avaliadas a suplementação dos acidificantes ácido fumárico, butírico, benzóico e diformiato de potássio em 30 comparação ao tratamento controle sem a presença dos ácidos. Observou-se efeito significativo somente para o tratamento com ácido fumárico (1,0%), que propiciou aumento no consumo do alimento e ganho de peso. Mais estudos ainda precisam ser realizados a respeito da utilização dos ácidos orgânicos isolados, combinados e de seus sais. A ação dos ácidos orgânicos não está totalmente elucidada, e seus efeitos ainda são bastante contraditórios. Chiqquieri et. al. (2009), no estudo com a inclusão de 0,2% de uma mistura de ácidos orgânicos constituído de benzóico, fumárico, cítrico e fosfórico em comparação ao antibiótico neomicina na dieta de leitões desmamados aos 21 dias de idade, não observaram diferença no consumo e na altura de vilosidades, podendo estar associado principalmente ao fato dos animais terem sido criados em um ambiente de baixo desafio sanitário. Quando Silva et al. (2008), avaliaram os efeitos da suplementação dietética de maltodextrina em substituição parcial a lactose e de uma mistura de acidificantes (propiônico, fórmico, acético, cítrico e fosfórico), sobre o desempenho de leitões desmamados aos 21 dias, não verificaram interação e efeito do acidificante sobre o desempenho de leitões. No entanto, perceberam um melhor resultado econômico das rações testadas com utilização da combinação de maltodextrina e acidificantes. Costa et al. (2011) não evidenciaram qualquer efeito significativo sobre o desempenho, digestibilidade e pH do conteúdo digestório, para dietas complexas e altamente digestivas, com uso de butirato de sódio (1500ppm) e aditivos fitogênicos microencapsulados (500ppm), em comparação ao sulfato de colistina (40ppm). 2.4.2.5 Ácido Butírico e Butirato de Sódio O ácido butírico é um ácido orgânico de cadeia curta, saturado, líquido em temperatura ambiente, sendo seu sal solúvel, o butirato de sódio (CH3-(CH2)2- CO2Na), um pó branco estável até 250°C. Pode ser obtido da fermentação microbiana anaeróbica a partir de resíduos endógenos ou dietéticos no intestino grosso, como enzimas e descamações do epitélio, oligossacarídeos não digestíveis, amidos resistentes e polissacarídeos não amidicos (MAKINSK, 2008). De maneira geral o butirato de sódio tem mostrado melhorar o desempenho de leitões desmamados (BIAGI et al., 2007; PIVA et al., 2002), fornecendo fonte de energia disponível pela fermentação de bactérias, particularmente dos colonócitos 31 (PARTANEN, 2001). Tem também uma importante função regulatória no que se refere a proliferação celular, diferenciação, inibição da apoptose, induzindo a absorção de água e sódio e ainda modula a microbiota do trato gastrointestinal, dependendo da adaptação da bactéria a variações na acidez química (MAZZONI et al. 2008, LU et al., 2008; CLAUS et al., 2008; BIAGI et al., 2007). O acidificante apresenta efeito na integração do epitélio intestinal e na regulação do IGF-I (fator de crescimento semelhante a insulina), e em animais o butirato pode aumentar a produção de anticorpos e promover mudanças no conteúdo da albumina e da proteína do sangue (LEANDRO, 2010; MAZANILLA et al., 2006; JANSSENS et al., 2002). A suplementação com butirato promove o aumento da conversão alimentar nas primeiras duas semanas pós-desmame, se administrado por seis semanas pós- desmame pode não afetar o desempenho (MAZZONI et al., 2008). 2.4.2.5.1 Acidificação Substâncias acidificantes promovem normalmente uma queda do pH na parte proximal do estômago, tendo contudo um efeito de menor amplitude na parte distal do mesmo (TONEL, 2009). No trabalho realizado por Biagi et al., (2007), a introdução de butirato de sódio, mostrou um efeito contraditório, visto que não afetou o pH do estômago nem do intestino delgado, mas somente o pH do ceco sofreu um aumento, o que dificilmente ocorre, pois ácidos orgânicos raramente chegam ao intestino grosso. Durante outro estudo in vitro realizado por Piva et al. (2002), o uso de blends (mistura de ácidos orgânicos contendo fumárico, málico, cítrico e fosfórico), aumentou a fermentação fecal e reduziu a concentração de amonia. Mostrando que ácidos orgânicos podem ter diferentes efeitos na produção cecal de gás e concentração de amônia, dependendo da concentração dos ácidos orgânicos e da concentração do produto usado na dieta (BIAGI et al., 2007). 2.4.2.5.2 Morfologia Intestinal No período pós-desmame há normalmente atrofia das vilosidades em decorrência da taxa de descamação epitelial por consequência do início do consumo 32 de ração sólida, de toxinas bacterianas e da adesão das bactérias aos enterócitos. O aumento da descamação resulta em incremento da profundidade da cripta. Assim, quanto maior a altura das vilosidades e menor a profundidade das criptas, melhor a absorção de nutrientes e menores as perdas energéticas com o turnover celular (OETTING et al.,2006). O butirato fornecido no alimento poderá reduzir alguns dos efeitos negativos do desmame, providenciando à mucosa ileal e à mucosa da parte posterior do intestino, uma fonte preferencial de energia, visto o butirato ser considerado um nutriente importante para a integridade do epitélio ao longo do trato gastrointestinal. Parece haver uma preferência dos colonócitos para o metabolismo de butirato, que contribui diretamente como fonte de energia para estas células, podendo representar ate 70% de seu consumo energéticoO suprimento de butirato ajuda a manter a integridade da mucosa, desempenhando importante papel na manutenção de um fenótipo celular normal e redução do risco de carcinomas colonicos (GOMES, 2009; SWANSON; FAHEY, 2007). A absorção do butirato é acoplada à reabsorção de sódio e água, e pode, assim, proporcionar um efeito antidiarreico. Isso é apoiado por evidências obtidas em ratos desnutridos, em que a ausência de produção de butirato induziu a "diarreia de inanição" porque a reabsorção de água e sódio foi diminuída. A alimentação dos enterócitos e colonócitos pelos ácidos graxos de cadeia curta conduzem a uma hipertrofia da mucosa intestinal, aumento de seus peso e superfície, o que otimiza a digestibilidade dos nutrientes por uma expansão da sua superfície de absorção (BORGES et al. 2011). Claus et al. (2007) verificaram que o uso do butirato de cálcio protegido (29 g/kg) aumentou a capacidade digestiva e de absorção no intestino delgado de leitões. O mecanismo provavelmente foi um efeito específico na mitose dos enterócitos o qual conduziu ao aumento do tamanho da dobra pela fissão da cripta. Lu et al. (2008) com o objetivo de testarem os efeito do uso do butirato de sódio no desempenho, morfologia e microflora intestinal de leitões desmamados aos 21 dias, verificaram que os animais suplementados com 1000 mg/kg de butirato de sódio melhoraram o desempenho, com aumento de altura de vilos e da relação vila:cripta, além de reduzirem a contagem intestinal de Clostridium e Escherichia coli. 33 De acordo com Manzanilla et al (2006), os enterócitos apresentam uma função secretora quando estão na cripta, e uma função de absorção quando migram para a vilosidade, o que implica que a absorção líquida no intestino delgado depende da razão entre a altura das vilosidades e da profundidade das criptas (AV/PC). O decréscimo nesta razão após o desmame prejudica a absorção e incrementa o risco de diarreias (PLUSKKE et al., 1997). No estudo de Manzanilla et al. (2006) nos animais que ingeriram butirato de sódio, ocorreu um decréscimo da relação AV/PC, devido a um aumento da profundidade da cripta, no entanto, essa alteração isoladamente não foi considerado um fator de risco para os leitões, além disso nos animais suplementados com butirato de sódio, os linfócitos interepiteliais (LIE) não sofreram qualquer alteração e as células de Goblet aumentaram no íleo, não mostrando um efeito negativo. Não está amplamente elucidado se o butirato de sódio pode estimular a fisiologia padrão da mucosa gástrica como observado para o colón e a proliferação celular do jejuno. Além disso, foi mostrado recentemente que a suplementação com butirato de sódio em dietas para leitões muito jovens de 3 a 10 dias de idade pode afetar o desenvolvimento da mucosa do jejuno e íleo (MAZZONI et al. 2008). Le Gall et al. (2009) verificaram o efeito da administração oral de butirato de sódio em leitões, sob os parâmetros de crescimento e maturação do trato gastrointestinal, antes (5 a 28 dias de idade) e após o desmame (28 a 40 dias de idade). Os resultados mostraram que de maneira geral, a suplementação com butirado de sódio foi mais eficiente no período pré-desmama, estimulando o crescimento e a ingestão de alimento no pós-desmama, pela redução do esvaziamento gástrico e peso da mucosa intestinal e pelo aumento da digestibilidade da ração. No caso do ensaio de Biagi et al. (2007) o butirato de sódio, não teve um efeito significativo na morfologia intestinal, isso pode ter ocorrido devido ao fato da concentração de butirato de sódio ao longo do intestino não ter sofrido um aumento, sugerindo uma rápida metabolização antes de chegar ao jejuno, e o fato das amostras da mucosa intestinal serem colhidas no final do ensaio, somente seis semanas após o desmame, logo em leitões com um TGI quase totalmente desenvolvido. 34 Fatores como aumento da concentração do acidificante no estômago, absorção do acido na parte esofágica, rápida metabolização e conversão do butirato para substâncias como o acetato, podem influenciar os resultados no uso do acidificante (TONEL, 2009; MAZANILLA et al., 2006). 2.4.2.5.3 Microbiota Intestinal A microbiota intestinal contribui para a proteção contra os micro-organismos patogênicos através da competição pelos locais de ligação ao intestino, da regulação da resposta imunitária, competição pelos nutrientes e pela produção de substâncias anti-microbianas (tais como bactericidas). Ainda podem criar um ambiente restritivo ao crescimento, através da acidificação do meio pela produção de ácido láctico e de ácidos graxos de cadeia curta pelo processo de fermentação dos Lactobacillus (TONEL, 2009). Castillo et al. (2006) observaram que dietas com butirato de sódio promoviam uma elevada diversidade na microflora do trato gastrointestinal, em particular nas partes caudais do intestino. Biagi et al. (2007), mostraram que o BS influenciou a atividade da microflora cecal no estudo in vitro, reduzindo a produção total de gás, mas com aumento na concentração de amônia. As bactérias lácticas contabilizadas no jejuno, não sofreram qualquer influência por parte do butirato de sódio. As concentrações de Enterobecteriaceae e Clostridia no jejuno estavam abaixo do limite de detecção e portando não puderam ser determinadas. Biagi et al. (2007) ao avaliarem o uso in vitro e in vivo sobre a microbiota, desempenho e vilosidades de leitões, verificaram que o uso do butirato de sódio não alterou desempenho dos animais, mas utilizando o sistema in vitro, a microbiota do ceco foi influenciada. No estudo realizado por Mazanilla et al. (2006), suplementando leitões com o uso de butirato de sódio ou o antibiótico avilamicina, o perfil bacteriano mostrou importantes diferenças entre os tratamentos, promovendo uma elevada biodiversidade na microflora do trato gastrointestinal, particularmente na região caudal do trato. A diversidade microbiana é medida pela quantidade de diferentes microrganismos detectados e tem sido proposto como um indicador de estabilidade da microbiota intestinal. Uma elevada biodiversidade pode produzir um efeito 35 benéfico no desempenho do animal, pois evita a proliferação de grupos bacterianos simples. Este benefício pode ser verificado no estudo de Mazanilla et al. (2006), quando o uso do butirato de sódio estimulou a diversidade de microrganismos, verificando a importância de diferentes fatores afetando as exigências de energia e proteína para o crescimento de leitões precocemente desmamados. No estudo realizado com frangos por Hu et al. (2007), para investigar o efeito do uso do butirato de sódio no intestino e no desempenho dos animais (nos níveis 500, 1000, 2000 mg/kg), a suplementação influenciou positivamente a conversão alimentar, mas não influenciou a função absortiva do jejuno. A razão altura de vilosidade e profundidade de cripta aumentou linearmente, mas a contagem de Lactobacillus caiu linearmente com o aumento da inclusão do BS. 2.4.2.5.4 Desempenho Bosi et al.(2009) ao avaliarem dietas com uso de butirato de sódio livre (2g/kg), protegido (0,6 g/kg) ou ainda de uma mistura comercial de butirato de sódio protegido (2g/kg) em leitões inoculados ou não com E. coli, verificaram que de um modo geral, o crescimento, altura de vilosidade e níveis de sobrevivência foram afetados positivamente quando animais foram suplementados. Costa et al. (2011), ao avaliarem os efeitos de aditivos fitogênicos e butirato de sódio como alternativas aos antimicrobianos promotores de crescimento com uso de dietas complexas e altamente digestíveis, sobre o desempenho,digestibilidade, pH do conteúdo digestório e frequência de diarreia de leitões recém-desmamados, não observaram influencia dos tratamentos sobre o desempenho dos leitões. Weber et al. (2007), conduziram dois experimentos para determinar os efeitos da suplementação de butirato de sódio no desempenho e na resposta de lipossacarídeos para Escherichia coli em leitões desmamados. Os dados indicaram que a dieta suplementada com butirato de sódio não melhorou o desempenho dos animais, mas pode regular a resposta aos estímulos inflamatórios em leitões desmamados. 36 3 MATERIAIS E METODOS 3.1 Local Foram conduzidos dois ensaios no Setor de Suinocultura, no Instituto de Zootecnia em Nova Odessa/SP. Inicialmente foi conduzido ensaio de Desempenho (Ensaio I), entre os dias 21 de Maio de 2012 a 05 de Julho de 2012 e o ensaio de Digestibilidade (Ensaio 2), entre os dias 11 de Julho de 2012 a 10 de Agosto de 2012. 3.2 Ensaio de Desempenho O ensaio de desempenho foi realizado em galpão de creche, com 2 salas das seguintes dimensões: Sala 1 (9,50m x 7,80m); Sala 2 (9,50m x 8,32m). Cada sala possuindo 18 baias suspensas, com três fileiras de seis baias cada. Foram utilizadas em cada sala 16 baias (2,0 x 1,0 metros cada), suspensas a 0,83m do chão, equipadas com bandeja de alumínio na parte inferior da baia para coletas de sobras de ração. As baias eram equipadas com bebedouro tipo chupeta, 37 ventilação nas laterais do galpão e comedouro com piso de madeira ripado abaixo, com pisos vazados de material plástico no restante da baia, visando facilitar a limpeza. Em cada sala, a temperatura foi controlada através de 2 aparelhos de ar condicionado e mantidas com temperatura e umidade, respectivamente: Sala 1, temperatura com máxima de 24,3°C e mínima de 20,7°C, umidade mantida entre 70% e 88%; Sala 2, com temperatura máxima em 29,9°C e mínima 20,9 e umidade ente 73% e 88%. Figura 1. Animais alojados em baias experimentais do Instituo de Zootecnia, Nova Odessa/SP. 3.2.1 Delineamento Experimental Foram utilizados 64 leitões híbridos, com idade inicial de 21 dias, desmamados e peso médio de 5,87±0,31 kg. O delineamento utilizado foi em blocos ao acaso, com 4 tratamentos e oito repetições, onde cada baia (unidade experimental), continha dois animais, sendo um macho e uma fêmea. Os blocos foram formados de acordo com o peso e sexo dos animais. Foram testados quatro tratamentos, sendo um com dieta basal, e o restante com utilização de dieta basal e adição dos acidificantes. Para o teste, foram utilizados ácidos orgânicos, através de misturas de acidificantes comerciais (blends) e acidificante encapsulado, formulados de acordo com a tabela abaixo (Tabela 2). 38 Tabela 2. Composição de acidificantes Blend (mistura) e Butirato de sódio utilizado nas dietas experimentais. Acidificantes Composição (%) Garantia Blend (mistura) Ácido Lático mínimo 21% Ácido Fórmico mínimo 18% Ácido Cítrico mínimo 10% Butirato Butirato de sódio (encapsulado) mínimo 30% Nas rações experimentais, os produtos avaliados foram adicionados às dietas substituindo o caulim. Os tratamentos avaliados foram os seguintes: - Tratamento 1(Controle) : dieta basal, sem acidificantes; -Tratamento 2 (Blend): dieta basal + 0,5% do Blend (21% ácido lático, 18% de ácido fórmico e 10% de ácido cítrico); -Tratamento 3 (Butirato): dieta basal + 0,1% de Butirato de Sódio; -Tratamento 4 (Blend e Butirato): dieta basal + 0,5% do Blend (21% ácido lático, 18% de ácido fórmico e 10% de ácido cítrico), + 0,1% de Butirato de Sódio. 3.2.2 Rações Experimentais Para o estudo, foram utilizados três tipos de rações, de acordo com cada fase, sendo a Ração Pré I, de 1 a 10 dias de experimento; Ração Pré II de 10 a 24 dias de experimento e Ração Inicial, de 24 a 45 dias de experimento. As rações foram formuladas de acordo com exigências nutricionais de Rostagno et al. (2005), e as composições das dietas formuladas para as rações Pré I, Pré II e Inicial, encontram-se nas Tabelas 3, 4 e 5. A composição nutricional das rações estudadas encontra-se na Tabela 6. 39 Tabela 3. Proporção de ingredientes das dietas experimentais, fornecidas na fase Pré I (0 a 10 dias). Descrição T1 Controle T2 Blend T3 Butirato T4 Blend + Butirato Milho grão 7.5 % 33,21 33,21 33,21 33,21 Soja Farelo (46%) 20,00 20,00 20,00 20,00 Blend 0,000 0,500 0,000 0,500 Butirato de Sódio 0,000 0,00 0,100 0,100 Caulim 0,600 0,100 0,500 0,000 Arroz Farinha Gelatinizado 10,00 10,00 10,00 10,00 Plasma Sanguíneo 2,00 2,00 2,00 2,00 Óleo Soja 1,20 1,20 1,20 1,20 Leite em Pó Integral 10,00 10,00 10,00 10,00 Açúcar 4,00 4,00 4,00 4,00 Soro Leite 16,0 16,60 16,60 16,60 Fosfato Bicálcico 0,900 0,900 0,900 0,900 DL-Metionina 0,310 0,310 0,310 0,310 L-Lisina 78% 0,500 0,500 0,500 0,500 L-Tryptofano 98% 0,025 0,025 0,025 0,025 L-Treonina 98% 0,200 0,200 0,200 0,200 Colina 60% - Cloreto 0,050 0,050 0,050 0,050 Colistina 80 0,050 0,050 0,050 0,050 Antioxidante (1) 0,010 0,010 0,010 0,010 Aromatizante (2) 0,025 0,025 0,025 0,025 Palatabilizante (3) 0,050 0,050 0,050 0,050 Sulfato de Cobre 35% 0,075 0,075 0,075 0,075 PX VIT Pré Inicial (4) 0,100 0,100 0,100 0,100 PX MIN Pré Inicial (4) 0,100 0,100 0,100 0,100 TOTAL 100,00 100,00 100,00 100,00 (1)Produto Comercial Endox 5X; (2) Produto Comercial Cream Sicle; (3) Produto Comercial Powersweet; (4) Níveis nutricionais por kg de ração: Vit. A - 10000 UI; Vit. D3 – 1650 UI; Vit. E 60mg; Vit. K – 20 mg; Vit. B1 – 1,19 mg; Vit.B2 – 4 mg; Vit.B6 – 2,19 mg; Vit. B12 – 22 µg; Ac. Folico – 0,39 mg; Ac. Pantotenico – 18 mg; Biotina – 0,15 mg; Niacina - 29,84 mg; Colina – 1113,74mg; Cobre – 273,10 mg; Ferro – 90 mg; Iodo – 1,10mg; Manganês – 40,20 mg; Selênio – 0,36 mg; Zinco: 117,8 mg. 40 Tabela 4. Proporção de ingredientes das dietas experimentais, fornecidas na fase Pré II (10 a 24 dias). Descrição T1 Controle T2 Blend T3 Butirato T4 Blend + Butirato Milho grão 7.5 % 50,90 50,90 50,90 50,90 Soja Farelo (46%) 24,00 24,00 24,00 24,00 Blend 0,000 0,500 0,000 0,500 Butirato de Sódio 0,000 0,000 0,100 0,100 Caulim 0,600 0,100 0,500 0,000 Plasma Sanguíneo 1,50 1,50 1,50 1,50 Óleo Soja 1,50 1,50 1,50 1,50 Açúcar 5,00 5,00 5,00 5,00 Soro Leite 13,50 13,50 13,50 13,50 Fosfato Bicálcico 1,40 1,40 1,40 1,40 Sal Refinado Sem Iodo 0,050 0,050 0,050 0,050 DL-Metionina 0,250 0,250 0,250 0,250 L-Lisina 78% 0,670 0,670 0,670 0,670 L-Tryptofano 98% 0,023 0,023 0,023 0,023 L-Treonina 98% 0,200 0,200 0,200 0,200 Colina 60% - Cloreto 0,050 0,050 0,050 0,050 Colistina 80 0,050 0,050 0,050 0,050 Antioxidante (1) 0,010 0,010 0,010 0,010 Aromatizante (2) 0,025 0,025 0,025 0,025 Palatabilizante (3) 0,050 0,050 0,050 0,050 Sulfato de Cobre 35% 0,030 0,030 0,030 0,030 PX VIT Pré Inicial (4) 0,100 0,100 0,100 0,100 PX MIN Pré Inicial (4) 0,100 0,100 0,100 0,100 TOTAL 100,00 100,00 100,00 100,00 (1)Produto Comercial Endox 5X; (2) Produto Comercial Cream Sicle; (3) Produto Comercial Powersweet; (4) Níveis nutricionais por kg de ração: Vit. A - 10000 UI; Vit. D3 – 1650 UI; Vit. E 60mg; Vit. K – 20 mg; Vit. B1 – 1,19 mg; Vit.B2 – 4 mg; Vit.B6 – 2,19 mg; Vit. B12 – 22 µg; Ac.
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