ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA

Prévia do material em texto

3333333 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL 
DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RROOTTEEIIRROO DDEE AAUULLAASS PPRRÁÁTTIICCAASS DDEE 
 
 
 
 
MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA EE IIMMUUNNOOLLOOGGIIAA 
 R o te i r o d e A ul a s Pr á t i c a s d e Micr o b i o lo g i a e Im u nol og i a 
 
 
 
 
 
Í N D I C E 
 
 
 
I - ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO-------------------------------------------------------- 3 
 
 
II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS -------------------------------------------- 9 
 
 
III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO ----------------------------------------------------16 
 
 
IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS -------------19 
 
 
V – ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO ---------------22 
 
 
VI – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS ----------- 27 
 
 
VII – ASPECTOS MICROSCÓPICOS E MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS -----------------33 
 
 
VIII – REAÇÕES ANTÍGENO ANTICORPO --------------------------------------------------41 
 
 
IX – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------------------------------------50 
 E s t e r i l i za çã o e D es in fecç ã o 3 
 
 
 
I - ESTERILIZAÇÃO E DESINFECÇÃO 
 
 
Esterilização é o processo de destruição por meio de agentes 
físicos ou químicos de todas as formas de vida microbiana 
(vírus, bactérias, fungos e esporos) presentes num material. 
A esterilização pode ser realizada por agentes físicos e 
químicos. 
 
⇒ ESTERILIZAÇÃO POR MÉTODOS FÍSICOS 
 
 
1. Calor Úmido 
2. 
1.1. Autoclavação - É um processo de esterilização pelo 
vapor sob pressão em câmaras conhecidas como “autoclaves” 
onde vapor de água é mantido em temperatura acima de 
100
o
C, pelo emprego de pressão maior que a atmosférica, a 
uma temperatura de 121
o
C. O tempo de exposição depende do 
material a ser esterilizado. Este processo é utilizado 
para esterilizar vidraria, instrumentos cirúrgicos, meios 
de cultivo e outros. 
 
1.2. Tindalização ou esterilização fracionada - Processo 
de esterilização na temperatura de 100
o
C durante 30 
minutos, repetindo-se o aquecimento 2 a 3 dias 
consecutivos. Este processo é usado na bacteriologia para 
 
a esterilização de certos meios de cultura que se alteram 
em temperaturas elevada, como meios contendo açúcares, 
leite etc. 
 
3. Calor Seco 
 
2.1. Forno de Pasteur - Neste processo são empregados 
fornos ou estufas, onde a temperatura pode ser regulada e 
mantida pelo tempo necessário para que haja 
esterilização. É realizada em temperatura de 170-180
o
C, 
em estufas elétricas por 1 a 2 horas. O material a ser 
esterilizado deve ser distribuído de modo uniforme para 
facilitar a distribuição do calor que emana das paredes 
laterais e da base da estufa. Este processo é indicado 
para esterilizar vidraria, instrumentos cirúrgicos 
passíveis de serem oxidados pelo vapor, e materiais 
impermeáveis como ceras, pomadas, pó e óleos. 
 
2.2. Incineração - É um processo usado para materiais 
descartáveis e carcaça de animais utilizados em 
experimentos. 
 
2.3. Flambagem - Aquecimento direto na chama do bico de 
Bunsen utilizado em rotina de laboratório para 
esterilização de alças de platina e bordas da boca de 
tubos e balões. 
 E s t e r i l i za çã o e D es in fecç ã o 4 
 
 
3. Filtração - É um processo usado para esterilização de 
gases e líquidos tais como soros, soluções de enzimas e 
vitaminas, açúcares, que não podem ser submetidos ao 
calor. A filtração consiste em passar o material a ser 
esterilizado por filtros de poros muito pequenos que não 
permitem a passagem de bactérias e fungos. 
 
3.1. Tipos de filtros: 
 
Disco de amianto - Filtro de SEITZ 
Membrana de ester de celulose- Millipore 
Filtros de partículas de ar de alta eficiência (HEPA) – 
removem quase todos os microrganismos maiores que 
0,3μ m de diâmetro. São utilizados para reduzir o 
número de micróbios transmitidos pelo ar. 
 
4. Radiações 
 
4.1. Radiação ultra-violeta (UV) tem sido utilizada na 
esterilização do ar e de ambientes. Na indústria de 
alimentos são aplicados para esterilização de 
superfícies de pães, xaropes, sacos plásticos, garrafas 
de água mineral, carnes mantidas sob refrigeração. 
Porém, seu uso é limitado, devido a seu baixo poder de 
penetração, pois trata-se de radiação não ionizante. 
 
4.2- Raios gama e raios X (radiações ionizantes)têm alto 
poder de penetração. Raios gama têm sido empregados 
na esterilização de certas vacinas e sanitização de 
alimentos embalados. 
 
⇒ MÉTODOS QUÍMICOS 
 
• Glutaraldeído 2% - As soluções de glutaraldeído são 
indicadas para esterilização ou desinfecção de instrumentos 
médicos cirúrgicos sensíveis ao calor, equipamentos de 
anestesia gasosa, fibroscópios,partes ópticas de endoscópios 
etc. Exposição em torno de 18 horas. 
 
• Formaldeído (Solução Alcoólica 8%) - A fórmula alcoólica 
apresenta 8% de Formaldeído. Sua atividade germicida é 
atribuída à inativação de proteínas e ácidos nucléicos 
microbianos. Exposição em torno de 18 horas. 
 
• Formaldeído (solução aquosa 10%) - As soluções aquosas além 
de não liberar vapores irritantes não possuem os 
inconvenientes das soluções alcoólicas sobre lentes de 
equipamentos ópticos e artigos de poliestireno e borracha 
em exposições prolongadas. Exposição em torno de 18 horas. 
 
 
 
 E s t e r i l i za çã o e D e s i nfe cçã o 5 
 
⇒ MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS 
 
• Estes métodos associam o produto químico com o uso de 
equipamentos, garantindo assim a efetividade ao processo e 
a segurança dos profissionais de saúde, sendo utilizado 
para materiais termosensíveis. 
 
• 1 – Esterilização por óxido de etileno: A esterilização é 
realizada à baixa temperatura em torno de 54ºC durante 8 a 12 
horas. Para materiais de implantes e próteses se recomenda uma 
aeração ambiental em torno de 7 dias. 
 
• Esterilização por vapor de formaldeído à baixa temperatura: 
A esterilização por vapor de formaldeído é realizada em 
autoclaves, em concentrações baixas em torno de 2% sob 
forma de vapor, em temperaturas que variam entre 73ºC e 
82ºC durante 90 e 180 minutos. 
 
 
Precauções - As precauções recomendadas para estas soluções 
consistem em utilizar luvas ou pinças para o manuseio de 
artigos nelas imersas e, nos casos das soluções alcoólicas, 
mantê-las em cubas de esterilização fechadas em ambientes 
ventilados. 
 
DESINFECÇÃO E ASSEPSIA 
 
* Desinfecção - A Desinfecção consiste na destruição ou 
redução dos microrganismos na forma vegetativa, presentes 
num material inanimado ou superfícies inertes, mediante a 
aplicação de agentes físicos ou químicos. A desinfecção não 
implica a eliminação de todos microrganismos viáveis, porém 
elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies 
ou local tratado. 
 
* Assepsia - É o termo usado para designar o processo de 
desinfecção de tecidos vivos. Os anti-sépticos são 
preparações contendo substâncias microbiocidas ou 
microbiostáticas podendo ser usadas na pele, mucosas e 
ferimentos. Exemplos: soluções alcoólicas, soluções 
iodadas, soluções de permanganato de potássio, formulações 
à base de sais de prata, iodóforos, etc. 
 
 
 
Observações: 
− Não são recomendados a utilização de iodofóros no recém- 
nascido, pois pode ocorrerabsorção transcutânea de iodo 
com supressão da função tireoideana. 
 
 
 
 
 
 
 
 E s t e r i l i za çã o e D es i nfecç ã o 6 
 
− Para a finalidade de antissepsia, não são permitidas as 
formulações contendo mercuriais orgânicos, acetona, 
quaternários de amônio, hipoclorito a 0,5%, éter e 
clorofórmio. 
 
A desinfecção pode ser realizada por agentes físicos e 
químicos. 
 
• AGENTES FÍSICOS: 
 
1.0. Pasteurização - É um processo empregado na indústria de 
alimentos que elimina microrganismos patogênicos (bacilos 
tíficos, paratíficos e desintéricos, brucelas, 
estreptococos, bacilo da tuberculose) de produtos como o 
leite pasteurizado, vinho, cerveja, submetendo-os a 
temperatura de 63
o
C por 30 minutos ou 75
o
C por 15 
segundos. Os tempos e as temperaturas de pasteurização 
dependem do método e do produto a ser tratado. A 
pasteurização não é um processo de esterilização, uma vez 
que esporos e bactérias não patogênicas podem permanecer 
viáveis. 
 
1.1.Água Fervente - Artigos de pequeno porte, depois de 
lavados com detergente adequado, podem ser desinfetados 
por imersão em água a 100
o
C durante 10 minutos. 
 
 
• AGENTES QUÍMICOS: 
 
Principais compostos utilizados em desinfecção e assepsia: 
 
– Álcoois - soluções a 70% e 80% 
– Fenóis e Derivados - Fenol, Cresóis, Ac. salicílico e Ác. 
Benzóico. 
– Halogênios - Iodo, Iodóforos (Polivinil Piralidona- 
Iodo/PVP-I, cloro, Hipoclorito de Sódio ou cálcio). 
– Metais Pesados - Mercúrio (Mercúrio Cromo,Mertiolato), 
Prata (Nitrato de prata), Cobre (Sulfato de Cobre). 
 
– Corantes - Verde brilhante e malaquita. Violeta 
Genciana, Azul de Metileno. 
de 
– Detergentes Sintéticos 
-Aniônicos: laurilsulfato de sódio 
-Catiônicos: cloreto de cetilpiridínio. 
 
– Oxidantes - Água oxigenada, permanganato de potássio. 
– Ácidos, Álcalis - Ác. Sulfúrico, Ác. clorídico, soda 
(NaOH). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 E s t e r i l i za çã o e D es i n fecçã o 7 
 
 
NOTAS: 
As seguintes precauções deverão ser tomadas para evitar 
a sobrevivência de microrganismos contaminantes, falhas de 
esterilização ou a recontaminação dos artigos esterilizados, 
independentes do processo de esterilização. 
 
 
1. A escolha do processo de esterilização 
 
− Processo de esterilização mais eficaz é o vapor saturado 
sob pressão, seguindo-se o calor seco e os esterilizantes 
químicos.A escolha depende da natureza do artigo a ser 
esterilizado. 
 
2. Limpeza prévia 
 
− A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, sangue, pus 
e outras secreções) protege os microrganismos contaminantes 
do contato indispensável com o agente esterilizante. Por 
outro lado, quanto menor for o número de microrganismos 
presentes, maior será a possibilidade de esterilização. 
Assim, é necessário lavar cuidadosamente todos os artigos 
em soluções desencrostantes (hiploclorito de sódio, 
detergentes sintéticos etc), e enxaguá-los abundantemente 
com água corrente e no último enxague com água destilada ou 
deionizada antes de submetê-los a qualquer processo de 
esterilização. 
 
3. Invólucros e pacotes 
 
 
− Os invólucros devem permitir o contato dos artigos com o 
agente esterilizante, bem como mantê-los livres de 
microrganismos durante a estocagem. A permeabilidade ao 
vapor e ao óxido de etileno, a impermeabilidade a 
partículas, a ruptura e a flexibilidade são as 
características mais importantes para a seleção de um 
invólucro. 
 
 
4. Estocagem 
− Após a esterilização, é essencial que os pacotes estejam 
íntegros secos e frios, a fim de conservarem a esterilidade 
dos artigos neles contidos. Se o pacote, ao ser removido da 
câmara ainda estiver quente, o vapor contido no papel 
condensa na temperatura ambiente, criando uma pressão 
negativa que aspira o ar (contaminado) do ambiente através 
do invólucro. Este atua como se fosse um filtro, deixando- 
se penetrar pelo ar e retendo células, partículas 
bacterianas ou não. Se este invólucro não estiver íntegro, 
os artigos no pacote sofrerão recontaminação. A umidade 
além de diminuir a resistência de invólucros de papel, 
facilita rupturas e interfere no mecanismo de filtração do 
ar. Para evitar a contaminação posterior, recomenda-se o 
uso de cestos metálicos. 
 
− Os pacotes esterilizados devem ser manuseados o menos 
possível, sempre com delicadeza e estocados em ambientes 
limpos e secos (30 a 60% de umidade) e temperatura em torno 
de 25
o
C, reesterilizados quinzenalmente quando não 
utilizados. 
 
 
5. Medidas Preventivas 
 
− Uso de luvas, Avental e, se necessário, máscara. 
 
− Materiais contaminados por agentes patógenos devem ser 
esterilizados antes de serem descartados. 
 
− Após o manuseio de materiais contaminados por agentes 
microbianos, lavar cuidadosamente as mãos com sabão ou 
soluções detergentes antissépticas, como soluções aquosas 
de Polivinil Pirrolidona-Iodo (PVP-I) a 10%, cloro-hexidina 
a 4% ou hexaclorofeno a 3% adicionado de 0,3% de 
clorofenol. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 E s t e r i l i za çã o e D es i nfecç ã o 8 
 
Aula Prática - Análise do efeito da ação de antissépticos 
relacionada ao crescimento bacteriano. 
 
Objetivo: Observar o efeito de antissépticos sobre o 
crescimento bacteriano na superfície da pele das mãos. 
 
Materiais: 
 
“Swab” estéril 
Placa com meio de cultura Ágar nutriente. 
Antissépticos: Sabão líquido e Solução álcool-iodado, 
álcool 70% e álcool gel. 
 
Técnica: 
 
1. Abrir a placa rapidamente e colocar a ponta dos dedos, 
sobre a superfície do meio de cultura. Fechar a placa. 
2. Lavar as mãos com água corrente e sabão líquido, deixar a 
água escorrer espontaneamente em seguida colocar a ponta 
dos dedos sobre a superfície do meio de cultura. Fechar a 
placa rapidamente. 
3. Friccionar a ponta dos dedos com solução de álcool iodado 
2%. Esperar secar, em seguida colocar a ponta dos dedos 
sobre o meio de cultura, como item 2. 
4. Friccionar a ponta dos dedos com solução de álcool 70% e 
depois com álcool gel. Esperar secar, em seguida colocar a 
ponta dos dedos sobre o meio de cultura, como item 2. 
5. Incubar a 37ºC por 24 horas. 
 
 
 
 
Resultado: 
 
Ação dos Agentes Crescimento Bacteriano 
Álcool Iodado 
Álcool 70% 
Sabão 
Sem anti-sépticos 
 Téc ni ca s d e C olo r açã o de Ba c té r i a s 9 
 
II – TÉCNICAS DE COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS 
 
 
As técnicas de coloração iniciadas por Paul Erlich e 
Robert Koch (1843-1910) permitiram ao microbiólogo distinguir 
as células bacterianas quanto a sua morfologia, tamanho e 
arranjo celular e diferenciá-las de acordo com as suas 
características tintoriais. Os corantes são divididos em dois 
grupos: os ácidos e os básicos. Os corantes básicos são sais 
com base corada que se unem eficazmente a substratos ácidos, 
tendo uma grande afinidade para corar material nuclear (azul 
de metileno, cristal violeta, fucsina básica, safranina). As 
bactérias comportam-se como material nuclear e desse modo, 
quase todos os corantes utilizados em bacteriologia são 
corantes básicos. Os corantes ácidos tendem a corar mais 
eficientemente os substratos básicos, como o citoplasma. 
 
 
MORFOLOGIA 
 
As células bacterianas são caracterizadas 
morfologicamente pelo tamanho, forma e arranjo. 
 
−Tamanho - as bactérias são microscópicas medindo desde 0,3 
por 0,8μ m até 10 por 25μ m. As espécies de maior 
interesse médico medem entre 0,5 a 1μ m por 2 a 5μ m. 
 
− Forma - as bactérias podem ser classificadas quanto a forma 
em três grupos básicos: 
 
Cocos - células esféricas. 
Bacilos - células cilíndricas, em forma de bastonetes. 
Espirilos - células espiriladas. Algumas delas se comportam 
como bacilos curvos, em forma de vírgula, que podem ser 
denominados víbrios. Ex: Vibrio cholerae. 
 
Arranjos - Grupamentos bacterianos. 
 
Dependendo do plano e do número de divisões através das 
quais as bactérias continuam unidas, podem aparecer os 
seguintes arranjos: 
 
1.Cocos 
Pares: diplococos (ex.: gonococos) 
Cadeias: (ex.: estreptococos) 
Tétrades ou cúbicos (Sarcina) 
Cocos em cachos (ex.: estafilococos) 
 
2.Bacilos e espirilos apresentam-se em geral, como células 
isoladas, porém ocasionalmente, pode-se observar: bacilos 
aos pares (diplobacilos) ou em cadeia (estreptobacilos). 
Após a divisão de algumas bactérias, podem ocorrer 
movimentos característicos, por exemplo: um movimento em 
chicotada pode levar as bactérias a posições paralelas. 
 Téc ni ca s d e C olo r açã o de Ba c té r i a s 10 
 
 
Divisões repetidas e seguidas desses movimentos determinam 
posições semelhantes a letras chinesas características do 
bacilo diftérico. 
 
PREPARAÇÃO DE ESFREGAÇO BACTERIANO PARA COLORAÇÃO 
 
1-Preparação a partir de meio líquido 
 
Usando alça de platina estéril, colocar duas a três 
alíquotas de cultura bacteriana preparada em meio líquido 
sobre a superfície de uma lâmina de microscopia. 
Espalhar sobre a lâmina, fazendo movimentos circulares 
de dentro para fora e deixar o esfregaço secar a temperatura 
ambiente. Em seguida, realizar a fixação passando duas a três 
vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen. 
 
2-Preparação a partir de meio sólido 
 
Colocar uma pequena gota de água destilada numa lâmina. 
Com alça de platina colocar sobre a lâmina uma pequena porção 
do crescimento bacteriano. Espalhar sobre a lâmina e 
prosseguir a preparação como no item anterior. 
 
3-Preparação a partir de material biológico 
 
Usando um swab estéril (zaragatoa), friccionar a 
superfície da mucosa ou lesão oral por exemplo e fazer um 
esfregaço circular na superfície de uma lâmina. Deixar secar 
à temperatura ambiente. Recolocar o swab dentro do tubo de 
ensaio e executar a fixação, como no item anterior. 
 
COLORAÇÃO SIMPLES 
Técnica de coloração caracterizada pelo uso de apenas um 
corante, permitindo a observação da forma, tamanho e 
grupamento da célula bacteriana. Esta técnica de coloração é 
bastante utilizada para a detecção de cocos que causam 
meningite (Neisseria meningitidis), em amostra de líquido 
cefalorraquidiano (LCR). 
 
MÉTODO 
 
1)Preparar o esfregaço bacteriano em lâminas; 
2)Cobrir toda a lâmina com solução de azul de metileno, aguar 
dar 5 minutos e desprezar o corante na pia; 
3)Lavar a lâmina rapidamente em água corrente, secar com 
papel de filtro ou à temperatura ambiente (sem esfregar) e 
observar em objetiva de imersão. 
 
RESULTADO 
 
Visualizar, descrever a morfologia e arranjo das 
bactérias existente na lâmina. 
 Téc ni ca s d e C olo r açã o de Ba c té r i a s 11 
 
 
COLORAÇÃO DE GRAM (Coloração diferencial) 
 
Este método de coloração foi empiricamente desenvolvido 
pelo bacteriologista dinamarquês, Christian Gram, em 1884, e 
permite distinção entre diferentes bactérias que podem 
mostrar uma morfologia similar, porém com propriedades 
tintoriais diferentes. A coloração de Gram classifica as 
bactérias em dois grupos: Gram positivas e Gram negativas. 
 
TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM 
 
1)cobrir toda a lâmina com solução de cristal violeta, 
aguardar um minuto e desprezar o corante na pia; 
2)cobrir a lâmina com lugol, aguardar um minuto, desprezar o 
lugol na pia; 
3)inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona até que não haja 
desprendimento de corante (cerca de 30 segundos), lavar a 
lâmina rapidamente em água corrente. 
4)cobrir a lâmina com fucsina de Gram e aguardar 30 segundos. 
Lavar, secar e observar em objetiva de imersão. 
 
NOTAS 
 
1)O Cristal violeta só se liga a parede celular bacteriana 
após a adição da solução de lugol (mordente) 
2)O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco. 
3)O material dos corantes empregados na técnica, 
principalmente sedimento do cristal violeta, poderá 
aparecer como artefato. 
4)O descoramento para mais ou menos é resultante da incorreta 
diferenciação pelo álcool-acetona. 
5)A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental 
na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células 
Gram Positivas freqüentemente se tornam Gram Negativas. 
 
Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas 
envelhecidas podem causar danos à parede da célula, como por 
exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes (álcool- 
acetona). Conseqüentemente, o complexo iodo cristal violeta 
poderá ser retirado da célula, nessa fase de coloração. 
 
RESULTADO 
 
Visualizar, desenhar a morfologia e classificar as 
bactérias nas lâminas de acordo com o seu comportamento 
diante dos corantes de Gram: 
Bactérias Gram positivas → coradas em roxo 
Bactérias Gram negativas → coradas em rosa 
 
INTERPRETAÇÃO 
A coloração de Gram classifica as bactérias em Gram 
positivas ou Gram negativas. O mecanismo da coloração de 
Gram, se refere à composição da parede celular, sendo que as 
 Téc ni ca s d e C olo r açã o de Ba c té r i a s 12 
 
Gram positivas possuem espessa camada de peptidoglicano e 
ácido teicóico, e as Gram negativas, uma fina camada de 
peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta 
por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e 
lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o 
tratamento com o álcool(ou álcool-acetona) extrai os 
lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade 
aumentada da parede celular das bactérias Gram negativas. 
Assim, o complexo cristal violeta iodo (CV-I) pode ser 
retirado e as bactérias Gram negativas são descoradas. A 
parede celular das bactérias Gram positivas, em virtude de 
sua composição diferente, torna-se desidratada durante o 
tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade 
é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. 
 
COLORAÇÃO DIFERENCIAL PELO MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN (1882) 
 
A coloração de Ziehl-Neelsen é o método para a pesquisa 
de bacilos álcool ácido resistentes (BAAR) incluindo-se o 
bacilo da tuberculose, o bacilo de Hansen e micobactérias 
atípicas. Este método de coloração se baseia na propriedade 
das micobactérias de se corarem inicialmente pela 
carbolfucsina (a fucsina dissolvida numa solução de fenol- 
álcool-água) e resistirem a uma descoloração por álcool- 
ácido. 
Através desta coloração, podemos visualizar um grupo 
restrito de bactérias que possuem sua parede celular 
constituída de lipídeos em grande concentração, devido a 
presença de cêras e ácidos graxos de cadeia longa(ácidos 
micólicos), que conferem à célula a característica de álcool- 
ácido resistência. 
 
COLETA DO MATERIAL 
 
1- Coletar a amostra, antes da antibioticoterapia. 
2- Obter, de preferência o primeiro escarro da manha antes da 
ingestão de alimentos. 
3- Orientar o paciente para escovar os dentes com água (não 
utilizar pasta dental) e enxaguar a boca varias vezes, 
inclusive com gargarejos. 
4- Respirar fundo, umas oito ou dez vezes, e tossir 
profundamente, recolhendo o materialno frasco de coleta 
estéril. 
5- Quando o material produzido for escasso, coletar amostra 
após nebulização. 
6- Enviar ao laboratório o mais breve possível. 
 
O escarro obtido deve ser purulento. As amostras salivares 
são impróprias para análise bacteriológica, pois não são 
representativas do processo infeccioso. 
 Téc ni ca s d e C olo r açã o de Ba c té r i a s 13 
 
 
PREPARAÇÃO DO ESFREGAÇO 
 
Colocar as amostras em lâminas (novas e desengorduradas) 
com aplicador de madeira. Escolher a partícula mais densa ou 
uma mistura da amostra, quando só existirem pequenas 
partículas purulentas ou mucosas. E com aplicador estirar a 
amostra em 1/3 da lâmina, deixar secar à temperatura ambiente 
e fixar como no procedimento anterior. 
 
Técnica: 
 
1)Cobrir toda a lâmina com fucsina fenicada. 
2)Com auxílio de uma chama, aquecer a lâmina, pela sua parte 
inferior até emitir vapores. Repetir duas vezes esperando o 
corante esfriar. Aguardar 5 minutos, não deixando o corante 
nem ferver nem secar. 
3)Lavar a lâmina com água corrente, suavemente. 
4)Inclinar a lâmina descorar com solução álcool ácido 
clorídrico, até não sair mais corante. 
5)Lavar a lâmina com água corrente. 
6)Cobrir o esfregaço com solução de azul de metileno de 
Loeffler durante 30 segundos. 
7)Lavar a lâmina em água corrente. 
8)Deixar secar e observar ao microscópio, com a objetiva de 
imersão. 
 
 
Notas: 
 
1.Na coloração de Ziehl, o aquecimento não deve ser feito 
muito intenso, a ponto de ferver o corante, mas apenas até 
ligeira emissão de vapores. 
2.A coloração de fundo é feita para corar bactérias e outras 
estruturas que foram diferenciadas, para o efeito 
contrastante ou distinção entre as bactérias e células 
presentes no material. 
 
 
RESULTADO: 
 
Visualizar, esquematizar e classificar as bactérias 
existentes nas lâminas. A classificação deverá ser quanto à 
resistência ou não das bactérias ao descoramento em álcool 
ácido. 
Bactérias álcool ácido resistente (BAAR) permanecem 
coradas de vermelho pela fucsina. 
Bactérias não álcool ácido resistente (BNAAR) não retém 
a fucsina, aparecem coradas pelo azul de metileno. 
 Téc ni ca s d e C olo r açã o de Ba c té r i a s 14 
 
 
BAAR por campo microscópico Resultado 
Nenhum bacilo em 100 campos 
observados 
Negativo 
Menos de 1 bacilo por campo, em 
100 campos observados 
+ 
De 1 a 10 bacilos por campo, em 
50 campos observados 
++ 
Mais de 10 bacilos por campo, em 
20 campos observados 
+++ 
 
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE GRAM 
Preparação do Cristal de Violeta: 
Cristal violeta 1g 
Ácido fênico 2g 
Álcool absoluto 10ml 
Água destilada 100ml 
 
Triturar num gral de vidro o corante e acrescentar o 
álcool. Juntar aos poucos o ácido fênico, misturando sempre, 
de modo a obter uma mistura bem homogênea. Juntar a água 
pouco a pouco, misturando bem. Filtrar após 24 horas de 
repouso, em papel de filtro. 
 
 
 
Preparação do Lugol: 
Iodo 1g 
Iodeto de potássio 2g 
Água destilada 300ml 
 
Triturar o iodo com o iodeto de potássio em gral de 
vidro. Juntar a água e misturar bem. Preparar em quantidade 
que seja usada antes de 30 dias. 
 
Preparação de álcool acetona: 
Álcool 800ml 
Acetona 200ml 
Unir os dois componentes e misturar bem. 
 
Preparação da Fucsina para Coloração de Gram: 
Fucsina 2,5g 
Álcool etílico 100ml 
Água destilada 90ml 
 
A solução estoque (fucsina e álcool etílico) deve ser 
preparada unindo-se os dois componentes e misturando bem. 
Para usar 10ml da solução em 90ml de água destilada, isto é, 
diluir a 10% em água destilada. 
 
 
 
Armazenamento de corantes: 
Os corantes devem ser estocados em frascos de vidro 
 
 
 Téc ni ca s d e C olo r açã o de Ba c té r i a s 15 
 
âmbar em local onde as condições ambientais sejam favoráveis, 
com temperatura entre 20 e 25ºC (T.A.) e sem teor de umidade. 
 
 
TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DOS CORANTES DE ZIEHL-NEELSEN 
Preparação de Fucsina fenicada: 
Fucsina básica 1g 
Álcool a 95% 10ml 
Fenol fundido 5g 
Água destilada 100ml 
 
 
 
Dissolver num gral o corante no álcool. Adicionar aos 
poucos o ácido fênico, misturando sempre, de modo a obter uma 
mistura bem homogênea. Juntar a água pouco a pouco, lavando o 
gral. 
Filtrar após 24 horas de repouso. 
 
Ácido clorídrico 
Álcool 95% 100ml 
Ácido clorídrico (dens. 1,19) 1ml 
 
Azul de Loeffler 
A)Azul de metileno 10,3g 
Álcool a 95% 30ml 
B)Solução de hidrato de sódio a 0,01% 1ml 
Água destilada 100ml 
 
Misturar A) e B). Diluir 10 vezes em água destilada. 
M ei o s de C ul t i v o Bac t e r ia n o 16 
 
 
III – MEIOS DE CULTIVO BACTERIANO 
 
 
Meios de cultivo é uma mistura de nutrientes, sais 
minerais e água que propiciam o crescimento in vitro 
de bactérias. A constituição de um meio de cultivo é 
bastante variada, pois os micro-organismos apresentam uma 
ampla diversidade metabólica. Portanto os meios de cultivo possuem 
componentes nutricionais variados promovendo o crescimento de 
micro-organismos mais exigentes e menos exigentes. 
Até 1880 os micro-organismos eram cultivados em meios 
líquidos, quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios 
sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas 
(culturas puras) separando-as de espécies contaminadas. 
Os meios de cultivo são utilizados para o isolamento e 
identificação de micro-organismos, teste para controle de 
esterilização ambiental, análise de alimentos e de água, etc. A 
maioria das bactérias cresce em meios de cultura. Exceto as 
riquétsias e clamídias por serem parasitas intracelulares 
obrigatórios só se desenvolvem in vitro em meios celulares (cultivo 
celular). 
Basicamente, um meio de cultivo deve conter além de 
extrato de carne para o fornecimento de proteínas, 
carboidratos e sais, peptona e Cloreto de Sódio. 
 
 A preparação dos meios de cultivo pode ser realizada no 
laboratório de microbiologia de duas formas: 
(1)a partir de seus ingredientes básicos. 
(2)a partir dos desidratados disponíveis comercialmente, ou 
podem ser comprados prontos para uso em tubos de ensaio ou placas 
de Petri. 
Didaticamente, os meios de cultivo cultivo podem ser 
classificados quanto à consistência, quanto à 
procedência, quanto à composição, e quanto à função. 
 
a) Quanto à consistência: os meios podem ser líquido, semi-sólido e 
sólido. 
− Meio líquido: é aquele em que os nutrientes estão 
dissolvidos em aquosa. São os caldos (“broth). É utilizado para 
ativação das culturas, repiques de micro-organismos, provas 
bioquímicas dentre outros. 
− Meio semi-sólido: Esse meio possui na sua composição além dos
 nutrientes, ágar (polissacarídeoextraído de algas 
marinhas) na concentração de 0,075% a 0,5%. É usado para 
− Meio sólido: É um meio que possui na sua composição 
nutrientes e uma concentração de 1,0 a 2,0% de Agar e distribuído 
em placas,tubos em vertical ou inclinados. 
 
 b)Quanto a procedência: os meios podem ser:naturais, 
artificiais sintéticos, ou artificiais complexos. 
 
 - Meios naturais: São aqueles de origem vegetal (batata,pão) 
 Animal( gema de ovo, carne, cérebro etc.) 
 - Meios artificiais sintéticos: São aqueles de composição química 
definida. Ex: Glicose 
 - Meios artificiais complexos: São aqueles que se desconhece a 
exata composição química. Ex:Extrato de carne. 
 
c) Quanto à função: O meio de cultivo pode ser enriquecedor, 
seletivo, diferenciador e de manutenção. 
− Meio enriquecedor ou enriquecido:É aquele que t e m s u a 
c a p a c i d a d e n u t r i c i o n a l , p e r m i t i n d o o 
c r e s c i m e n t o d e m i c r o - o r g a n i s m o s e x i g e n t e s . 
E x : B H I , Á g a r s a n g u e , A g a r c h o c o l a t e . 
 
− Meio seletivo: É aquele que contém substâncias que inibem o 
crescimento de certos micro-organismos, sem impedir o crescimento 
de outros. 
 Ex: Ágar SS,(Salmonella , Shigella) 
 
− Meio diferenciador ou indicador: É empregado para detectar 
colônias bacterianas com propriedades distintas. As 
bactérias acidogênicas são conhecidas pela ação da cor do 
indicador ácido-base adicionado ao meio. 
 As bactérias que hidrolisam o amido podem ser conhecidas pelas 
zonas claras produzidas nos meios contendo suspensões de amido. 
Bactérias hemolíticas são visualizadas pelas 
alterações produzidas no ágar sangue. 
 Os produtores de gás sulfídrico formam uma zona escura de sulfito 
de ferro no meio contendo excesso de ferro. Ex: Ágar EMB, Ágar 
sangue. 
 
- Meio de manutenção: É um meio utilizado para estocagem de baixo 
teor nutritivo para evitar a rápida morte celular, devido a 
eliminação de substâncias tóxicas resultantes do metabolismo dos 
micro-organismos. Ex: Ágar nutriente. 
 
- Meio para crescimento anaeróbico: Como os anaeróbios não 
sobrevivem na presença de oxigênio são utilizados meios 
especiais denominados meios redutores, esses meios contém 
ingredientes como o tioglicolato de sódio, que se combinam 
quimicamente com o oxigênio dissolvido e o eliminam do meio de 
cultura. 
Outros métodos: Jarra de anaerobiose, estufas de dióxido de 
carbono. 
 
 
Preparação: 
Um fator que influencia na preparação do meio de cultivo é a 
temperatura. Ao preparar um meio de cultivo não podemos manter à 
 temperatura ambiente uma solução não estéril por 
mais de uma hora devido à possibilidade de evaporação da 
água de crescimento microbiano. 
Alguns componentes são utilizados pelos microrganismos e os 
demais, pelo efeito d o crescimento microbiano.Alguns 
componentes são utilizados pelos micro-organismos e os 
demais, pelo efeito da evaporação,se concentram. Após preparados 
os meios devem ser esterilizados pelo processo de esterilização 
adequada. 
 
 
 
Técnica: 
 
Preparação de meio líquido: Meio de B.H.I. (Brain-Heart- 
Infusion). 
Componentes do meio: 
Infusão de coração ................... 250g 
Infusão de cérebro ................... 200g 
Peptona ............................... 10g 
Dextrose................................ 2g 
Cloreto de Sódio ....................... 5g 
Fosfato de Sódio ..................... .2,5g 
Água destilada ....................... 100ml 
 
Execução: 
 
a)Adicionar 100ml de água destilada aos ingredientes 
previamente pesados; 
b)Dissolver o meio aquecendo em chama de bico de Bunsen 
ou forno de microondas; 
c)Distribuir o meio em tubos 16x16 aproximadamente 10ml 
por tubo. Colocar tampão de algodão em cada tubo; 
d)Autoclavar (121ºC por 15 a 20 minutos). 
 
Preparação de meio sólido: Meio Ágar nutriente (Ágar Base) ou 
Ágar Gelose. 
Componentes do meio: 
Extrato de Carne ....................... 3g 
Peptona ................................ 5g 
Ágar .................................. 15g 
Água destilada ...................... 1000ml 
M ei o s d e C ul t i v o Bac te r ia n o 18 
 
 
Conservação dos meios de cultivo 
 
Após preparados, os meios devem ficar à temperatura 
ambiente até o esfriamento total. Quando a quantidade de meio 
preparado for pequena e de uso imediato (uma semana), deve 
ser armazenado em geladeira dentro de sacos plásticos para 
evitar desidratação. Quando a quantidade de meio for grande e 
não de uso imediato, deve ser distribuído em frascos com 
rolha, selados com tampas de alumínio e logo após 
autoclavados. 
A maioria dos meios de cultura na forma desidratada pode 
ser conservada à temperatura ambiente durante anos e outros 
que contenham substâncias termolábeis em sua composição são 
guardados em geladeiras. 
Para usar frascos de meio líquido, abrimos o selo de 
alumínio, retiramos a rolha de borracha com cuidados 
assépticos e, em ambiente estéril, transferimos o meio para 
tubos estéreis (através de pipetas). 
Para usar frascos de meio sólido, fundimos o ágar 
imergindo o frasco fechado, em banho-maria fervente ou forno 
de microondas a temperatura de 100
o
C. Após a fusão do ágar 
abrimos o selo de alumínio, retiramos a rolha de borracha e 
transferimos o meio para tubos (através de pipetas estéreis) 
ou para placas de Petri e deixamos solidificar a temperatura 
ambiente. 
 
 
TÉCNICAS DE SEMEIO 
 
OBJETIVOS 
 
- Identificação das técnicas de semeadura mais empregadas na rotina 
bacteriológica. 
- Cultivo de bactérias com finalidade de obtenção de cultura pura, 
ou seja, uma população onde todas as bactérias se originam de uma 
única célula bacteriana. 
 
 Toda manipulação de culturas bacterianas, meios e instrumental 
necessário deve ser feita seguindo-se procedimentos básicos de 
assepsia visando evitar qualquer tipo de contaminação. 
 
A) Meio inclinado 
-Estria sinuosa- semear com alça de platina, em zigue-zague partindo 
da base para a extremidade da superfície inclinada do meio, este 
tipo de semeadura permite a obtenção de melhor massa de micro-
organismos. 
-Em estria reta- semear com agulha de platina, em estria reta, 
partindo da base para a extremidade da superfície inclinada do meio, 
ou em profundidade e superfície, este tipo de semeio é utilizado em 
provas bioquímicas para identificação bacteriana. 
 
B) Meio em pé (camada alta) 
- Em picada: com agulha de platina fazer o inóculo penetrar de 0,5 a 
1,0 cm no centro do meio de cultura. 
 Este tipo de semeadura é bastante utilizado para conservação de 
bactérias no meio de cultura e quando o meio de cultura é semi-
sólido é utilizado para a verificação de motilidade. 
 
C) Em placa de Petri 
 
C.1 Em superfície 
- Estrias múltiplas ou esgotamento: Fazer o inóculo em um ponto da 
superfície do meio, flambar a alça, deixar esfriar e daí semear em 
zigue-zague em toda superfície do meio. 
 Este tipo de semeadura é empregado para isolamento bacteriano, 
obtenção de u.f.c. isolados. 
 
- Por distensão: Com pipeta estéril, colocar no centro da superfície 
do meio 0,1 ml da suspensão e espalhar uniformimente com Swab ou 
Alça de Drigalski. Com swab obteremos crescimento confluente e com 
alça de Drigalski, utilizamos para contagem. Usa-se para 
determinados testes e antibiogramas. 
 
C.2 Em Profundidade ou Disseminação 
- Por Plate: Depositar na placa de Petri 0,1 ml ou 1,0 ml da 
suspensão bacteriana . Adicionar 10 ml do meio fundido em tubo de 
ensaio e resfriado a 45-50ºC. Homogeneizar com movimentos giratórios 
da placa sobre uma superfície plana. Utilizado para isolamento, 
contagem, identificação bacteriana, conforme o meio de cultura 
utilizado. 
 
D) Repique por pescaria: Colônia em placa de Petri retirada através 
de uma agulha para um meio de cultura líquido ou sólido. Método 
empregado para isolamento bacteriano. 
 
 
I s o l am ent o e Ide nt i f i c açã o d e Ba c té r ia s G r am Po s i t i va s 19 
 
 
IV – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS 
 
 
Em se tratando de material clínico para ser submetido a 
exame bacteriológico este deve ser colhido antes da 
administração de antimicrobianos, porque se a bactéria for 
sensível àquele antibiótico, dificilmente ela crescerá nos 
meios de cultura. A bactéria poderá estar morta no momento da 
colheitaou então ter o seu crescimento inibido pelo 
antimicrobiano presente no material clínico. 
 
 
 
1- ISOLAMENTO - As bactérias podem ser cultivadas in vitro em 
meios de cultura que lhes forneçam todas as condições 
nutricionais e ambientais necessárias ao seu crescimento. 
As culturas são feitas pela semeadura dos materiais 
clínicos em meios sólidos distribuídos em placa de Petri, em 
tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos. 
Depois de semeados os meios devem ser incubados em 
temperatura e atmosfera adequadas. O período de incubação 
varia de acordo com a velocidade de crescimento da bactéria. 
A grande maioria das bactérias pode ser cultivada em 24 a 48 
horas. Exceções são feitas para o cultivo de Neisseria (14- 
16hs) e Mycobacterium (até 21 dias). 
 
Material para colheita e isolamento: 
Abaixador de língua 
"Swab" 
Ágar sangue 
 
Procedimento: 
Transferir a amostra colhida com o "Swab" para um ponto 
da superfície do meio distribuído em placa e semear pela 
técnica de estrias. Incubar a placa a 37ºC por 24h e fazer a 
identificação bioquímica e diferenciação de atividade 
hemolítica e enzimática. 
 
 
 
2- IDENTIFICAÇÃO: 
 
2-1 Gênero: Streptococcus 
 
As espécies de maior interesse clínico são: 
Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, 
Streptococcus pneumoniae. 
I s o l am ent o e Ide nt i f i c açã o d e Ba c té r ia s G r am Po s i t i va s 20 
 
 
Os Streptococcus são identificados de acordo com: 
 
1) Atividade hemolítica 
a)-hemolíticos: quando lisam completamente as hemácias 
(in vitro) liberando hemoglobina e formando uma zona clara 
ao redor da colônia. 
b)-hemolíticos: quando causam lise incompleta das 
hemáceas com liberação de pigmento verde (redução da 
hemoglobina) promovendo uma zona esverdeada ao redor da 
colônia. 
c)-hemolítico: ausência de atividade hemolítica. 
 
2) Morfologia celular: 
Corados pelo método de Gram, aparecem como Gram 
positivos esféricos ou lanceolados, de tamanho variável, 
isolados ou em grupos formando cadeias curtas ou longas. 
 
3) Diferenciação bioquímica: 
 
 São utilizados testes com antimicrobianos para 
diferenciação de Streptococcus alfa, beta e gama 
hemolíticos, como também são realizados testes 
presuntivos para pesquisa de enzimas produzidas 
pelos isolados. 
 
4) Composição antigênica 
Os estreptococos-hemolíticos elaboram carboidratos que 
são utilizados em reações de precipitação com anti-soro 
específico, que possibilita a separação dos grupos. Rebeca 
Lancefield padronizou a classificação deste gênero de acordo 
com esta composição grupo específicos antigênica da parede 
celular. 
 
Estreptococos-hemolíticos 
 
Utilizar o Teste de sensibilidade a Optoquina para 
diferenciar o Streptococcus pneumoniae (sensível a optoquina) de 
estreptococos viridescentes (resistente a optoquina), e o Teste 
de Solubilidade em Bile. As bactérias solúveis em Bile são da 
espécie Streptococcus pneumoniae, as bactérias insolúveis em 
Bile são de estreptococcos viridescentes. 
 
 
Teste de optoquina 
Finalidade: 
A optoquina (etil-hidrocupreínahidroclorídrica) é um 
farmaco solúvel em água que se difunde rapidamente em meio 
de cultura sólido. Para este teste, em geral, utiliza-se o 
disco de optoquina de6 mm contendo 5 µg da droga. O teste 
tem sensibilidade maior que 95%, sendo considerado de 
baixo custo e simples de ser realizado. 
Procedimento: 
 Preparar uma suspensão do isolado em solução salina a 
0,85% estéril com densidade ótica de 0,08 a 0,1 ao 
comprimento de onda de 625 nm, ou correspondente a 0,5 da 
escala de McFarland; 
 Semear a suspensão em uma placa de ágar sangue de carneiro 
5% de forma a obter crescimento confluente; 
 Após a absorção da suspensão pelo meio de cultura, colocar 
um disco de optoquina na superfície do meio semeado, com o 
auxílio de uma pinça; 
 Incubar a 35±2ºC e 5 - 7% de CO2 por 18 - 24 h; 
 Fazer a leitura do halo de inibição do crescimento 
bacteriano. 
Interpretação: 
Presença de halo ≥ 14 mm indica que a cultura é sensível à 
optoquina, sendo identificado Streptococcus pneumoniae. 
 
 Estreptococos β-hemolíticos 
Teste da Bacitracina 
Finalidade: 
O teste tem a finalidade de diferenciar S. pyogenes de outras 
cepas do grupo A de outros grupos de Streptococcus β-
hemolíticos (Grupo B, C e G). 
Procedimento: 
 Um disco de 0,04 U de bacitracina é aplicado a uma placa 
de ágar sangue de carneiro que tenha um inóculo com 4 ou 5 
colônias puras de Streptococcus spp., a ser testado. 
 Incubar 12 horas (overnight) a 35± 2ºC. 
Interpretação: 
A presença de halo de 10mm inibição ao redor do disco é 
interpretado como sensibilidade a bacitracina e indicativo 
de S. pyogenes. 
 
 
 
 
 I s o l am ent o e Ide nt i f i ca çã o de Bac té r ia s G r am Po s i t i va s 22 
 
Teste de Camp 
O teste visa a identificação de linhagens de S. 
agalactiae (grupo B). Estas linhagens produzem o fator 
CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) que atua 
sinergicamente com a β-hemolisina produzida pelo 
Staphylococcus aureus em ágar sangue. 
Procedimento: 
 Semear um inóculo de Staphylococcus aureus ATCC 25923 (ou 
cepa de S. aureus com duplo halo de hemólise) de um ponto 
a outro da placa de ágar sangue; 
 Semear perpendicularmente (90°) a colônia 
de Streptococcus β-hemolítico a ser testada, sem que haja 
o contato com a estria de Staphylococcus aureus; 
 Incubar a 35±2ºC em atmosfera de 5% de CO2 por 48 h. 
Interpretação: 
 A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para 
o S.aureus na intersecção do crescimento das duas 
bactérias indica que o teste é positivo e indicativo 
de S.agalactiae; 
 Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é 
negativo e a cepa não pertence ao grupo B de Lancefield. 
 
 
I s o l am ent o e Ide nt i f i c açã o d e Ba c té r ia s G r am Po s i t i va s 23 
 
 
2-2 Gênero Staphylococcus 
As três espécies de maior interesse clínico são: 
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, 
Staphylococcus saprophyticus. 
 
Morfologia celular 
 
São cocos Gram positivos que podem apresentar-se 
isolados ou em pares, em pequenas cadeias ou aglomerados em 
cachos. 
 
Identificação e diferenciação 
 
a)Atividade enzimática 
 
Prova de coagulase: 
 
A 0,5ml de plasma de coelho, adicionar 0,1ml de cultura 
em caldo. Incubar em banho-maria a 37ºC e verificar a 
intervalos de 30 minutos, se há formação de coágulo. O 
Staphylococcus aureus é produtor de coagulase. 
 Staphylococcus epidermidis, não produtor de coagulase, é 
usualmente considerado não patogênico mas pode estar 
envolvido em certas situações clínicas: endocardite 
bacteriana, em cirurgia com prótese, em transplante de medula 
e em cateterismo venoso. 
 
b)Sensibilidade a novobiocina 
 
Teste de novobiocina 
 
Preparar uma suspensão em caldo e semear em ágar. Colocar 
um disco de novobiocina (5mg), incubar a 37ºC por 24 horas 
e verificar a formação de um halo de inibição de 14mm. 
Esse teste diferencia o S. saprophyticus (resistente ao 
farmacoa) do S. epidermidis (sensível a droga). O S. 
saprophyticus é causa relativamente freqüente de infecção do 
trato urinário em pacientes jovens. 
 
 C) Teste de Fermentação do Manitol 
Finalidade: 
 
Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o 
manitol contendo 7,5% de cloreto de sódio. 
Procedimento: 
 Fazer pequenos círculos no ágar com a colônia suspeita; 
 Incubar a 35±2ºC por 18 - 24 h. 
Leitura: 
Formação dehalo amarelo ao redor das colônias. 
Interpretação: 
 Formação de halo amarelo ao redor das colônias, 
identifica Staphylococcus aureus; 
 Meio permanece inalterado ao redor das colônias, 
identifica Staphylococcus coagulase negativa. 
 
Obs.: Outras espécies de estafilococos, com pouca frequência, 
também podem produzir ácido a partir do manitol, portanto também 
devem ser testados quanto à produção de coagulase. 
 
 
 
d) Teste da Catalase 
 
 
O teste da catalase é utilizado para diferenciar os 
estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase 
negativa). Entretanto, existem relatos na literatura 
de Staphylococcus aureus catalase negativa relacionados a 
processos infecciosos, embora raros, descritos em vários países, 
inclusive no Brasil. 
Procedimento: 
 
Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) 3% 
sobre uma lâmina; 
Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo 
na gota de peróxido de hidrogênio. 
 
INTERPRETAÇÃO 
 
Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de 
efervescência indica a conversão do H2O2 em água e oxigênio 
gasoso. 
 
Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência. 
 
RECOMENDAÇÕES 
Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrócitos 
podem produzir reação fraca de catalase. 
Para controle utilizar outra linhagem de Staphylococcus para o 
controle positivo e como controle negativo Streptococcus spp. 
Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 22 
 
 
V – ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO 
 
 
Introdução: 
A análise da sensibilidade das bactérias aos agentes 
antimiccrobianos está relacionada à várias técnicas ou 
métodos laboratoriais in vitro utilizados para determinar a 
sensibilidade e a resistência de determinado microrganismo a 
antimicrobianos. 
 
DETERMINAÇÃO DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS EM BACTÉRIAS 
 
A identificação de bactérias isoladas de espécimens 
clínicas necessita de teste complementar para determinar o 
perfil de sensibilidade daquela espécie frente a 
quimioterápicos antimicrobianos (Antibiograma). As drogas 
disponíveis no combate àquela infecção, são estudadas por 
grupos (aminoglicosídeos, betalactâmicos, fluorquinolonas, 
macrolídeos, peptídeos e sulfas) e em concentrações 
padronizadas (proporcionais às concentrações atingidas no 
soro de pacientes em tratamento) obtidas por estudo "in 
vitro". Drogas que mostraram-se inibidoras para determinado 
isolado bacteriano são selecionadas pela seletividade tóxica, 
efeitos secundários, facilidade de administração (oral e 
parenteral), e pelos custos do tratamento. Várias técnicas 
foram desenvolvidas mas a metodologia desenvolvida por Kirby, 
Bauer & Turck (1966) é utilizada mundialmente por apresentar 
resultados rápidos e seguros. 
Um segundo tipo de teste de sensibilidade é realizado 
utilizando-se espécies não patogênicos, para fins de pesquisa 
básica, quando se deseja estudar mecanismos de ação das 
drogas ou modelos de resistência antimicrobiana ou ainda para 
marcar uma população. Neste caso, são determinados os grupos 
de drogas e a concentração mínima inibitória (CMI) por método 
quantitativo. 
Objetivos: 
1) Avaliação da atividade e 
agentes antimicrobianos; 
do espectro de ação de novos 
2) Nos estudos de populações 
padrão de sensibilidade 
bacterianas, para estabelecer o 
sob o efeito seletivo de 
antimicrobianos; 
3) Como marcadores epidemiológicos. 
 
Fundamento: Substâncias antimicrobianas são incorporadas ao 
meio de cultivo (líquido ou ágar), em concentrações 
inibitórias para aqueles organismos sensíveis. A concentração 
é dada em μ g/ml ou Unidades Internacionais(UI). 
 
 
 
Métodos: 
Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 23 
1.Qualitativo - Pesquisa que grupos de drogas antimicrobianas 
são bactericidas para determinada espécie bacteriana numa 
determinada concentração. Ex.: Técnica de Kirby 
Bauer(1966). 
2.Quantitativo - Pesquisa que concentração de determinada 
droga antimicrobiana é inibitória para uma espécie 
bacteriana isolada. Determinação da concentração mínima 
inibitória (CMI). 
 
Método de difusão com disco (Técnica Kirby Bauer): 
Difusão da droga, sob forma de disco ou comprimido na 
superfície do meio sólido. 
1. Padronização do inóculo bacteriano: 
A partir da placa original da cultura bacteriana do 
microrganismo a ser testado são transferidas 4 a 5 colônias 
para um meio de cultura líquido (Caldo-Soja-Caseína, Caldo 
BHI, caldo Mueller-Hinton). Em seguida, incuba-se durante 2 a 
4 horas. A densidade do inóculo deve ser comparada com a 
escala de turbidez de McFarland (ácido sulfúrico + cloreto de 
bário), equivalente a 10
4 
bactérias por ml de meio. 
 
2. Semeio: Realizado através de “swab” estéril embebido no 
inóculo bacteriano e passado em toda a área da superfície do 
meio ágar Mueller-Hinton (crescimento confluente). Deixar 
secar por 2 minutos. 
Com auxílio de uma pinça estéril colocar sob a 
superfície do meio inoculado os discos de antibióticos em 
pontos eqüidistantes (30 mm). 
Incubar a temperatura ideal para o crescimento daquela 
população bacteriana por 18-24h. 
 
 
Leitura: Observar halo de inibição em torno do disco de 
antimicrobiano. O diâmetro deste halo é medido em mm 
(halômetro) e comparado com a tabela recomendada pelo C L S I 
(Clinical L ab or at or y S tandards Institute, 2010). Para cada
 agente antimicrobiano, o diâmetro do halo poderá ser 
interpretado como sensível (S), resistente (R) ou 
intermediário (I). 
 
 
Utilização de Drogas de baixa difusão: moléculas grandes e 
polarizadas. Considerar pequenos halos como sensíveis. 
 
Drogas de alta difusão: moléculas pequenas e apolares. 
Considerar halos com maiores diâmetros que os padrões. 
Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 24 
 
Considera-se uma população sensível a determinada droga 
quando esta população é inibida por concentração três ou mais 
vezes inferior a concentração que a substância atinge no 
sangue. Amostras resistentes são inibidas por concentrações 
intermediárias. 
Ex.: Droga X atinge concentração sérica de
 32μ g/ml. Populações que são inibidas por
 8μ g são consideradas sensíveis e aquelas inibidas 
por concentrações acima de 16μ g 
consideradas resistentes. 
 
Fatores Intervenientes capazes de alterar a interpretação: 
1.Utilização de meio muito ricos ou muito pobres em 
composição de "simular" falsos microrganismos resistentes ou 
sensíveis. 
2.Utilização de inóculos muito concentrados (densos) e 
formação de tapetes de células mortas entre bactérias vivas e 
a droga. 
3.Para algumas infecções como difteria (C. diphteriae), 
meningite meningocócica não são realizados antibiogramas. 
Utilizam-se drogas de escolha. 
4.Devido a variabilidade de marcas de resistência a 
drogas devem ser realizados sempre nas bactérias 
Enteropatogênicas (Salmonella, Shigella, E. coli 
soropatogênicas e para Mycobacterium tuberculosis). 
5.Observar a concentração da droga que impregna o papel 
de filtro que compõe o disco ou comprimido. 
6.Observar prazo de validade das drogas ensaiadas. 
 
Seleção de substâncias antibióticas: 
Bactérias gram positivas: Penicilina, Eritromicina, 
Clindamicina, Gentamicina e Tetraciclinas. Para 
Staphylococcus não precisa testar Ampicilina e Carbenicilina 
(Produtores de betalactamases). A meticilina representa 
betalactâmico (penicilina) não degradada pela betalactamase. 
 
Bactérias gram negativas(Enterobacteriaceae): 
Ampicilina, Cefalosporinas, Gentamicina, Tetraciclinas, 
Cloranfenicol, Trimetoprim + Sulfametoxisazol e Amoxacilina. 
 
Infecções urinárias: Ampicilina, Ac. Nalidíxico, 
Nitrofurantoínas, Cefalosporinas, Sulfas e Fluorquinolonas. 
 
Para infecções por Pseudomonas sp.: Carbenicilina, 
Gentamicina, Tobramicina, Pipraciclina e Amicacina. 
 
Para infecções por cêpas de Anaeróbios: Bacteróides, 
Peptococos, Fusobactérias e Clostrídios: Clindamicina, 
Metronidazol, Rifampicina, Vancomicina e Tetraciclinas. 
 
Microrganismos de referência 
Mantenha culturas-estoques de S. aureus (ATCC25923) e E. 
coli (ATCC25922). 
Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 25 
 
Teste esses microrganismos de referência, pelo método 
que foi descrito, usando discos de antibióticos 
representativos daqueles a serem empregados no teste de 
isolados clínicos. 
 
Comparações de resultados para os microrganismos- 
controle de teste para teste oferecem uma verificação na 
reprodutibilidade do processo do teste e na credibilidade dos 
discos-teste. 
 
Limitações do método 
O método de interpretação descrito aqui se refere a 
patógenos de crescimento rápido e não deve ser aplicado a 
microrganismos de crescimento lento, para os quais os 
critérios dos halos não são apropriados. E para antibióticos 
que se difudem lentamente em ágar, ex: polimixina B. 
 
 Método Quantitativo 
 
E-test: Teste epsilométrico, método de difusão mais avançado 
que permite estimar a concentração mínima inibitória (CMI), a mais 
baixa concentração de antibiótico que impede o crescimento 
bacteriano. Uma tira revestida de plástico contendo um gradiente de 
concentração do antimicrobiano, e a CMI pode ser lida em uma escala 
impressa na tira. 
 
Etapas para realização da técnica: 
 
As etapas iniciais são semelhantes à técnica de Kirby Bauer, como a 
preparação do inoculo bacteriano e semeio. As fitas do E-test 
consiste numa fita plástica fina, inerte e não porosa de 5mm largura 
e 50mm de comprimento. Um lado da fita é marcado com uma escala de 
leitura de CIM em mcg/ml. Um código de letras designa a identidade 
do antibiótico. Um gradiente exponencial pré-definido do fármaco 
seco e estabilizado é mobilizado no outro lado da fita, com uma 
concentração máxima em "a" e mínima em "b", como demonstrado na 
Figura abaixo. 
 
 
Antibacteriano 
 
Símb. 
 
Conc. 
disco 
Zonas de inibição (em mm) 
Resistente Interme 
diário 
Sensível 
Amicacina AM 30mcg 14 ou menos 15-18 17 ou mais 
Ampicilina ao 
testar 
microrganismos 
Gram-negativos e 
enterococos 
 
 
AP 
 
 
10mcg 
 
 
11 ou menos 
 
 
12-13 
 
 
14 ou mais 
Ampicilina ao 
testar 
estafilococos e 
microrganismos 
sensíveis à 
penicilina G 
 
 
AP 
 
 
10mcg 
 
 
20 ou menos 
 
 
21-28 
 
 
29 ou mais 
Ampicilina ao 
testar Haemophilus 
sp. 
 
AP 
 
10mcg 
 
19 ou menos 
 
20 ou mais 
Bacitracina BC 10un. 8 ou menos 9-12 13 ou mais 
Carbenicilina ao 
testar Proteus sp. 
E E. coli. 
 
CR 
 
100mcg 
 
17 ou menos 
 
18-22 
 
23 ou mais 
Carbenicilina ao 
testar Pseudomonas 
aeruginosa 
 
CR 
 
100mcg 
 
13 ou menos 
 
14-16 
 
17 ou mais 
Cefalotina ao 
relatar 
sensibilidade a 
todas as 
cefalosporinas 
 
 
CF 
 
 
30mcg 
 
 
14 ou menos 
 
 
15-17 
 
18 ou mais 
Clindamicina ao 
relatar 
sensibilidade à 
clindamicina e à 
lindomicina 
 
 
CL 
 
 
2mcg 
 
 
14 ou menos 
 
 
15-16 
 
 
17 ou mais 
Cloranfenicol 
Colistidina 
Eritromicina 
Estreptomicina 
Gentamicina 
Konanilcina 
Nalidíxico, ácido 
Neomicina 
Nitrofurantoína 
Novoblocina 
Oxocilina 
CO 
CL 
EL 
ET 
GN 
KN 
AN 
NO 
NT 
NV 
OX 
30mcg 
10mcg 
15mcg 
20mcg 
20mcg 
30mcg 
30mcg 
30mcg 
300mcg 
30mcg 
6mcg 
12 ou menos 
8 ou menos 
13 ou menos 
11 ou menos 
12 ou menos 
13 ou menos 
13 ou menos 
12 ou menos 
14 ou menos 
17 ou menos 
9 ou menos 
13-17 
9-10 
14-17 
12-14 
13-14 
14-17 
14-18 
13-16 
15-16 
18-21 
10-13 
18 ou mais 
11 ou mais 
18 ou mais 
15 ou mais 
15 ou mais 
18 ou mais 
19 ou mais 
17 ou mais 
17 ou mais 
22 ou mais 
14 ou mais 
Penicilina G. ao 
testar 
Estafilococos 
 
PN 
 
10un. 
 
20 ou menos 
 
21-28 
 
29 ou mais 
Penicilina G. ao 
testar outros 
microrganismos 
 
PN 
 
10un. 
 
11 ou menos 
 
12-21 
 
22 ou mais 
Penicilina G. PL 50un. 8 ou menos 0-11 12 ou mais 
Sulfazotrin 
(Sulfatomoxazol + 
Trimetoprin) 
 
SFT 
 
25mcg 
 
10 ou menos 
 
11-15 
 
16 ou mais 
Sulfonamidas 
Tetraciclina 
Tobramicina 
Vancomicina 
SF 
TT 
TB 
VC 
300mcg 
30mcg 
10mcg 
30mcg 
12 ou menos 
14 ou menos 
12 ou menos 
9 ou menos 
13-16 
15-18 
13-14 
10-11 
17 ou mais 
19 ou mais 
15 ou mais 
12 ou mais 
 
Antibiograma: Técnicas de Preparação e Interpretação 26 
 
 
Tabela 1. 
Limites para interpretação do antibiograma com 24 
antibacterianos de uso corrente na terapêutica clínica. 
I s o l am ent o e Ide nt i f i c açã o d e Ba c té r ia s G r am N eg at i v a s 27 
 
 
VI – ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS 
 
 
As bactérias gram-negativas incluem vários gêneros de 
bacilos fermentadores de carboidratos (Enterobactérias; 
família Enterobacteriaceae ) ou não fermentadores de 
carboidratos (Ex.: Pseudomonas, Acinetobacter). As 
enterobactérias (Ex: Escherichia coli, Klebsiella, 
Enterobacter, Hafnia, Shigella, salmonella, Proteus, 
Serratia, etc.)são os bacilos mais freqüentemente isolados 
de amostras clínicas em laboratórios de microbiologia. Esses 
bacilos estão amplamente distribuídos na natureza e são 
encontrados principalmente no trato intestinal do 
homem e de animais. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae 
e Pseudomonas aeruginosa são as bactérias gram-negativas mais 
envolvidas em infecções hospitalares. 
A identificação das bactérias Gram- 
 negativas baseiam-se principalmente em reações bioquímicas 
que ocorrem nos meios de cultura, resultantes do metabolismo 
bacteriano. 
 
 
 
1 - ISOLAMENTO 
Para o isolamento dos bacilos gram-negativos são 
utilizados principalmente meios seletivos diferenciais. 
 
a) Meios de isolamento 
Ágar salmonella Shigella (SS), Ágar Hektoen (HE), Ágar 
MacConkey, Ágar Verde Brilhante, Ágar Eosina Azul de Metileno 
(EMB), Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e Ágar Bismuto 
Sulfito, etc. 
 
b) Técnica de semeio para isolamento 
Transferir o inóculo bacteriano para um ponto da 
superfície do meio de cultivo distribuído em placa e semear 
pela técnica de estrias utilizando a alça de platina 
flambada. Incubar a placa a 37oC por 18-24h e fazer a 
diferenciação e identificação bioquímica. 
 
2 - IDENTIFICAÇÃO (Provas bioquímicas) 
 
2-1. Fermentação de carboidratos (lactose, sacarose, 
glicose) 
 
Nos sistemas de provas bacteriológicas o processo de 
fermentação é detectado por observação visual das mudanças de 
cor dos indicadores de pH do meio quando os produtos ácidos 
são formados pelas bactérias. 
 
a) Princípio 
Os testes de fermentação de carboidratos determinam a 
capacidade de um microrganismo em hidrolizar determinado 
I s o l am ent o e Ide nt i f i c açã o d e Ba c té r ia s G r am N eg at i v a s 28 
 
açúcar, incorporado numa concentração de 0,5 a1,0% em meio 
base de vermelho de fenol, produzindo ácidos com ou sem gás. 
Todas as enterobactérias fermentam a glicose pela via Embden-
Meyerhof, formando ácido pirúvico. 
 
b) Meio: base de vermelho de fenol 
Indicador de pH: Vermelho de fenol 
Ácido (cor amarela) - pH < 6,8 
Alcalino(cor vermelha)-pH >8,4 
Neutro (cor laranja) - pH = 7,4 
 
c) Técnica 
Transferir, com alça de platina estéril, uma colônia 
bacteriana isolada para o meio líquido vermelho de fenol 
adicionado do carboidrato a ser fermentado. Incubar a 37oC 
por 18-24h. 
 
d) Resultado 
POSITIVO: cor amarela -- presença de ácido (carboidrato 
fermentado) 
NEGATIVO: cor vermelha -- ausência de ácido (Carboidrato 
não fermentado) 
 
2-2 Teste TSI (Ágar Tríplice-açúcar-ferro) 
 
a) Princípio 
No meio TSI distribuído em tubos de ensaio observa-se a 
fermentação ou não dos açúcares (lactose, glicose e sacarose) 
pelas bactérias Gram-negativas, com produção ou não de gás 
CO2. Também pode se observar a formação de H2S (gás sulfídrico 
ou sulfeto de hidrogênio) pela sua reação com o sulfato 
ferroso (presente no meio TSI), resultando num precipitado de 
sulfeto ferroso que se manifesta por uma reação visível de 
cor negra. 
 
b) Meio TSI 
Neste meio, além do ágar e das fontes de carbono e de 
nitrogênio, também estão presentes o tiossulfato de sódio que 
é uma fonte de enxofre para a produção de H2S e o indicador 
de pH vermelho de fenol,que já foi visto no tópico anterior. 
 
c) Técnica 
Transferir a colônia bacteriana isolada para o meio TSI, 
utilizando-se a agulha de platina flambada. A inoculação 
deverá ter a profundidade de 2/3 do meio em uma única picada. 
Em seguida, fazem-se estrias na superfície inclinada. Incubar 
a 37oC por 18-24h. 
 
d) Resultado e interpretação 
O resultado é obtido pela visualização da mudança de cor 
no pico (superfície inclinada) e no fundo (profundidade) do 
tubo de ensaio contendo o ágar TSI: 
I s o l am ent o e Ide nt i f i c açã o d e Ba c té r ia s G r am N eg at i v a s 29 
 
• Pico alcalino/fundo alcalino - Ausência de fermentação dos 
açucares. Ex: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter. 
• Pico alcalino/fundo ácido - Fermentação apenas da glicose. 
Ex: Shigella. 
• Pico alcalino/fundo ácido e negro - Fermentação da glicose 
e produção de H2S. Ex: Salmonella, Proteus, Citrobacter. 
• Pico ácido/fundo ácido - Fermentação dos três açucares. Ex: 
Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia e outros 
componentes do grupo coliforme. 
 
2-3. Teste de Motilidade 
 
a) Princípio e meio 
O meio de cultivo apropriado para teste de motilidade 
bacteriana deve ser semi-sólido (0,5% de agar) para permitir 
a difusão de bactérias móveis. O meio SIM (S= H2S,I=Indol, 
M=Motilidade)é um dos meios utilizados para o teste de 
motilidade, como também para o teste de indol que será visto 
em seguida. 
 
b) Técnica 
Inocular em uma única picada a colônia bacteriana 
isolada no meio, utilizando-se a agulha de platina estéril. 
Incubar a 37oC por 18-24h. 
 
c) Resultado 
A motilidade bacteriana é detectada pelo exame 
macroscópico do meio para se observar uma zona de crescimento 
difuso (turbidez) que parte da linha de inoculação feita com 
a agulha de platina. 
 
 
 
2-4. Teste do Citrato 
 
a) Princípio 
Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o 
citrato como única fonte de carbono para seu metabolismo e 
crescimento. Se o citrato for utilizado, o nitrogênio 
(do fosfato de amônia) presente no meio também será, havendo 
liberação da amônia com a conseqüente alcalinização do meio. 
 
b) Meio: Ágar Citrato de Simmons 
Este é um meio sólido no qual a única fonte de carbono é 
o citrato de sódio (obs: não contém proteínas ou carboidratos 
que são fontes de carbono,tendo como indicador de pH o azul 
de bromotimol. 
 
c) Técnica 
A bactéria em estudo é inoculada na superfície do ágar 
inclinado em tubo fazendo-se estrias na superfície do meio, 
utilizando-se a alça de platina flambada. Incubar a 37oC por 
18-24h ou até 3 dias, se necessário. 
 
d) Resultado 
POSITIVO: meio azul (alcalino) - Utilização do citrato 
NEGATIVO: meio verde (neutro) - Não utilização do citrato 
 
2-5. Teste da lisina descarboxilase 
 
a) Princípio 
Determinar a habilidade enzimática de uma determinada 
bactéria em descarboxilar o aminoácido lisina, com a 
subsequente alcalinização do meio devido a formação de amina 
alcalina (cadaverina). 
 
b) Meio LIA (Ágar lisina ferro) 
Este meio contém como indicador o púrpura de 
bromocresol: 
 
 
 
c) Técnica 
Ácido: cor amarela -- pH < 5.2 
Neutro a básico: cor púrpura -- pH = 6.8 
A bactéria teste é inoculada em uma única picada no meio 
LIA em tubo de ensaio, utilizando-se uma agulha de platina 
estéril. Em seguida, fazem-se estrias na superfície 
inclinada. Incubar a 37oC por 24h. 
 
d) Resultado 
POSITIVO: meio púrpura (alcalino) - Ocorreu a descarboxilação 
da lisina e conseqüente formação de aminas. 
 
NEGATIVO: meio amarelo (ácido) - Não ocorreu a descarboxilação 
da lisina. A acidificação do meio ocorre porque a bactéria 
fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio. 
 
 
2-6. Teste de Indol 
 
a) Princípio 
Determinar a habilidade do organismo em produzir o indol 
(benzil pirrol) a partir da molécula de triptofano ou 
outros aminoácido presentes no meio SIM. Quando ocorre a 
degradação deste aminoácido por bactérias que possuem a 
enzima triptofanase ocorre a formação de: Indol, 
ácido pirúvico e amônia. Este teste é útil para diferenciar a 
E.coli (indol positiva) de outras enterobactérias. 
 
b) Meio e reativo 
• Meio SIM 
• Reativo de Kovac ou Reativo de Ehrlich Composição: p- 
dimetilaminobenzaldeído, HCL concentrado, álcool 
isoamílico (Kovac), álcool etílico absoluto (Ehrlich). 
 
c) Técnica 
Inocular com agulha de platina o meio SIM com a 
bactéria em estudo e incubar a 37oC por 18-24h. 
Em seguida, adicionar gotas do reativo Ehrlich ou de Kovac 
no tubo. 
d) Resultado 
I s o l am ent o e Ide nt i f i c açã o d e Ba c té r ia s G r am N eg at i v a s 31 
 
O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfície do 
meio após a adição do reativo indica a presença de indol e 
uma prova positiva. A cor vermelha aparece na camada de 
álcool quando o indol produzido reage com o p- 
Dimetilaminobenzaldeído presente nos reativos de Ehrlich ou 
de Kovac. 
 
 
2-7. Teste de urease 
 
a) Princípio 
Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar 
enzimaticamente a uréia pela urease com a formação de duas 
moléculas de amônia (NH3), resultando na alcalinização do 
meio. 
 
b) Meio caldo uréia 
Este meio tem como indicador de pH o vermelho de fenol, 
já visto anteriormente. 
 
c) Técnica 
Inocular o caldo uréia com uma alça de platina carregada 
de cultura pura do organismo em estudo. Incubar a 37oC por 
18-24h, ou até 48h se necessário. 
 
d) Resultado 
POSITIVO: meio rosa (alcalino) - Presença de urease 
NEGATIVO: meio amarelo (neutro) - Ausência de urease 
 
3 – MÉTODOS RAPIDOS DE IDENTIFICAÇÃO 
 
3-1. Sistema API 20E (bio Mérieux) – Identificação de 
Enterobactérias 
 
O sistema de identificação API 20E consiste em tiras 
plásticas com 20 compartimentos miniaturizadas que contêm os 
substratos desidratados (meio de identificação bioquímica) e 
uma câmara plástica de incubação com tampa frouxa. Cada 
compartimento possui um pequeno orifício superior através do 
qual a suspensão bacteriana diluída em solução salina ou água 
destilada estérilpode ser inoculada com uma pipeta. A ação 
bacteriana sobre o substrato produz mudança de cor que é 
interpretada visualmente em 24 horas a 35ºC. O fabricante 
fornece folhas de trabalho para registro das interpretações 
visuais das reações coloridas, que em seguida são convertidas 
em número do biótipo de 7 dígitos, levando a identificação da 
espécie bacteriana. 
Os 20 substratos incluídos para identificação de 
enterobactérias são: ONPG, arginina diidrolase, lisina 
descarboxilase, ornitina descarboxilase, citrato, sulfeto de 
hidrogênio, urease, triptofano desaminase, indol, Voges- 
I s o l am ent o e Ide nt i f i c açã o d e Ba c té r ia s G r am N eg at i v a s 32 
 
Proskauer, gelatina, glicose, manitol, inositol, sorbitol, 
ramnose, sacarose, melibiose, amigdalina, arabinose. 
Pelo sistema API 20E são identificadas mais de 100 
espécies de bactérias gram-negativas. Esse sistema é um dos 
mais utilizados nos laboratórios clínicos e de pesquisa. 
Obs: Também são comercializados outros sistemas API para 
identificação de bactérias Gram-positivas. 
 
3-2. Sistema VITEK (SISTEMA AUTOMATIZADO) 
O sistema VITEK (bio Mérieux) é um sistema 
computadorizado que consiste em um módulo gerador de vácuo, 
leitor-incubador, computador-impressora e um monitor de 
computador. Este sistema é utilizado com cartões de teste 
VITEK para identificação bacteriana e provas de 
susceptibilidade a antibióticos, totalmente automatizadas. 
Este sistema permite a identificação de enterobactérias em 8 
horas, sendo aceito como um método confiável para 
identificação rápida de bacilos gram negativos nos 
laboratórios de microbiologia clínica. 
Cada cartão de identificação possui 30 testes 
bioquímicos que não necessita adição de reagentes, evitando 
erros. VITEK é capaz de detectar mais de 300 espécies de 
microrganismos (bactérias gram-negativas e gram-positivas e 
leveduras). 
 
 
 
Tabela de Identificação Bioquímica de Enterobactérias 
 
 
Indol + -/+ - - - -/+ - - - - + - + + + 
Citrato de Simmons - - d + + + + + +/- + d + - + - 
H2S (TSI) - - + + +/- - - - - - + + - - - 
Urease - - - - d
w 
+
w 
 +
w 
 - - d
w 
+ + + + - 
Motilidade +/- - + + + - + + + + + + + + + 
Lisina d - + + - + - + + + - - - - - 
Ornitina d d + + d - + + + + - + + - - 
Glicose + + + + + + + + + +/- +/- + d -/+ - 
Lactose + - - d d + + + -/+ -/+ - - - - - 
Sacarose d - - - d + + + d + + d - d d_ 
 
(+) positivo,( - ) negativo, (d) positiva tardia, reação pode ocorrer em até 72h, (w) reação fraca, (+/-) maioria positiva, 
(-/+) maioria negativa 
A s pec t o s Mic r os có p ico s e M ac ro sc óp ico s d o s F u n go s 33 
 
 
VII – ASPECTOS MICROSCÓPICOS E MACROSCÓPICOS DOS FUNGOS 
 
 
Os fungos são organismos eucarióticos, heterotróficos, 
obtendo sua alimentação a partir de matéria orgânica 
inanimada ou nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos. 
Estes microrganismos causam doenças humanas, em animais e 
vegetais. De um modo geral, os fungos incluem os bolores (ou 
mofos) e as leveduras. Os bolores são filamentosos e 
pluricelulares e as leveduras se apresentam sob forma 
unicelular. 
Conhecer os aspectos microscópicos e macroscópicos dos 
fungos é de extrema importância para a identificação destes 
organismos que são agentes etiológicos de processos 
infecciosos, de reações de hipersensibilidade imediata e 
tardia e produtores de micotoxinas. 
A coleta do material é o primeiro passo para 
obtenção de um resultado laboratorial confiável. Deve-se 
sempre questionar o paciente em relação ao uso de medicações 
antifúngicas tópicas e/ou sistêmicas. Caso o paciente esteja 
fazendo uso da medicação, o mesmo deverá ser orientado a 
suspendê-la por um período de 15 dias, em caso de uso tópico 
e 1 mês, quando se tratar de drogas de uso sistêmico. Esta 
suspensão deve ser realizada com autorização médica. 
É de grande importância que todos os espécimes 
clínicos encaminhados para diagnóstico laboratorial, venham 
acompanhados de uma ficha, que contenha no mínimo as 
seguintes informações: identificação e procedência do 
paciente, tempo de evolução da lesão, localização e aspectos 
clínicos da lesão, possíveis contatos com animais e solo, uso 
de drogas. 
 
1)ASPECTOS MICROSCÓPICOS DOS FUNGOS 
 
1.1- Exame microscópico direto 
 
O diagnóstico microbiológico e imunológico das micoses 
pode ser feito pelo exame microscópico direto, exame 
histopatológico, cultivos, testes intradérmicos, pesquisa de 
anticorpos séricos e de antígenos. O exame microscópico 
direto é o método mais usado no diagnóstico de rotina das 
micoses por ser rápido e sensível, permitindo a visualização 
do fungo e em muitas ocasiões, sua identificação. É 
importante salientar que a realização do cultivo 
paralelamente ao exame direto é imprescindível para um 
completo diagnóstico laboratorial micológico. 
A técnica de preparação para o exame direto, varia de 
acordo com o material biológico a ser investigado e da 
suspeita clínica da etiologia do processo. 
 
♦ Preparação do exame direto com amostras clínicas densas 
(p.ex.: escamas epidérmicas, ungueais e pêlos): 
 
 
 
 
 
 
 
 
A s pec t o s Mic r os có p ico s e M ac ro sc óp ico s d o s F u n go s 34 
 
 
a) Clarificar a amostra clínica, já sobre a lâmina, com 1 gota 
da solução de hidróxido de potássio (KOH) a 10-20%; 
b) Aquecer suavemente a lâmina na chama do bico de Bunsen; o 
calor juntamente com o KOH vai dissolver a queratina 
presente na amostra, clareando o material de fundo; esperar 
10 minutos, tempo necessário para clarear o material de 
fundo. 
c) Corar o material com 1-2 gotas de lactofenol azul-algodão 
(ou azul de Amann); 
d) Cobrir com lamínula; 
e) Examinar ao microscópio com objetiva de 40X. 
Exemplos de algumas características