Espectrofotometria de absorção no UV (pesquisa de química Analítica

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FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DE VIÇOSA
Trabalho de Química Analítica.
Fundamentos teóricos e uso das seguintes técnicas.
Atividade proposta pela professora Grasielle Gusman da disciplina Química Analítica. Apresentada pelo Aluno:
Hiago Cassio Cunha Guimaraes Mat: 8206
VIÇOSA – MG
Novembro de 2017
Espectrofotometria de absorção no UV-Visível
A espectrofotometria pode ser definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria.
1.1. Origem
A palavra espectro de origem grega foi empregada para nomear raios luminosos em virtude de na antiguidade as pessoas sepultarem seus mortos em covas rasas, e o simples fato de alguém desavisado pisar em cima, de uma dessas sepulturas fazia com que o gás metano fosse expelido, visto que corpos em decomposição liberam diversos gases, entre eles o metano, que apresenta uma propriedade de auto inflamar-se apresentando um aspecto luminoso intenso. Quando alguém era surpreendido por uma bola gasosa dessa ficava assustado e dizia estar sendo assustado por um fantasma que em grego é espectro.
1.2. Fundamentos da espectrofotometria
A luz de uma maneira geral é mais bem descrita como sendo uma radiação eletromagnética em virtude de sua natureza dualística. Ou seja, ela existe e tem um comportamento de campos elétricos e magnéticos oscilantes como a figura abaixo representa:
Onde:
O comprimento de onda (λ) é distancia em metros, de um pico ao outro da onda;
A frequência (v) é o grau de oscilação das ondas, em função da velocidade da luz no vácuo que é representada pela constante c (c=2, 998x108m. s-1). De modo que:
λ . v = c
1.3. Espectro eletromagnético representando os comprimentos de onda correspondente a cada radiação
A técnica espectroscópica é baseada na no aumento de energia em função do aumento da frequência da radiação incidida. Quando uma espécie química absorve energia na forma de fótons, seus elétrons ficam excitados e ocorre uma transição de um orbital de mais baixa energia para outro de maior energia. Um exemplo disso, são compostos químicos que apresentam duplas ligações C=C no benzeno e C=O, a carbonila, por exemplo. 
Benzeno
As cetonas da ligação peptídica
O aumento de energia é representado pela condição de frequência de Bohr:
Onde:
E é a energia que aumenta em função da frequência, e h é a constante de Planck h=6,626x10-34J.s.
A transição eletrônica de duplas ligações, ocorre em virtude de uma ligação dupla ser formada por um orbital sigma (σ) e um orbital (π), de modo que o elétron que está no orbital pi ligante vai para o orbital pi antiligante que tem maior energia. (para detalhes maiores vide teoria do orbital molecular).  A transição nas C=C é na C=O é representada na figura abaixo, essa espécies químicas são denominadas cromóforos ou substâncias que trazem a cor:
Aminoácidos como a Fenilalanina, Tirosina e Triptofano são os principais responsáveis pela absorção de luz das proteínas em virtude possuírem o anel benzênico em sua estrutura química, além da ligação peptídica listada acima. A luz é absorvida na faixa de 280nm.
 1.4. Lei de Lambert-Beer
A “força vital” da espectrofotometria está fundamentada na lei de Lambert-Beer, que estabelece:
“A absorbância é diretamente proporcional a concentração da solução de amostra.”
Ou:
Log(I/I0)=εcl
Fonte de Luz: é composta por uma lâmpada de deutério e uma lâmpada de tungstênio (semelhante à lâmpada de carro). A lâmpada de deutério emite radiação UV e a de tungstênio emite luz visível.
Monocromador: alguns espectrofotômetros ainda possuem um prisma como monocromador, porém os mais modernos possuem dispositivos eletrônicos que transformam a luz incidida em vários comprimentos de onda, em um só comprimento, ou seja, a luz monocromática.
Cubetas utilizadas em espectrofotometria. Geralmente usa-se cubeta de 1 cm, a fim de facilitar os cálculos da Lei de Lambert-Beer.
Cubeta: é o recipiente propício para conter a amostra que será utilizada na análise, as cubetas podem ser de quartzo, vidro e acrílico, porém recomenda-se que seja usada uma cubeta de quartzo por que o vidro e o plástico absorvem UV e causa a reflexão da luz visível.
Detector: o detector é um dispositivo que detecta a fração de luz que passou pela amostra e transfere para o visor e para o computador acoplado ao aparelho.
1.5. Análise espectrofotométrica
Passo 1: a amostra deve ser preparada com a quebra da amostra por métodos mecânicos, químicos ou físicos;
Passo 2: a amostra é solubilizada no solvente escolhido em um balão volumétrico limpo e seco;
IMPORTANTE: o solvente na maioria das vezes é água, porém, quando tratar-se de amostras apolares que precisam ser diluídas em solvente orgânico nunca utilize alcenos, alcinos, cetonas ou qualquer outro que tenha ligações C=C ou C=O ou triplas.
Passo 3: em uma cubeta é colocado o solvente puro e lido no comprimento de onda o mesmo que será lida a amostra, esse procedimento é chamado leitura em branco, e tem como finalidade minimizar os erros causados, pela absorção luz ocasionados pelo vidro e pela água;
Passo 4: a amostra é filtrada em uma membrana de 0,2 μm, por que a solução deve estar totalmente límpida a fim de diminuir ao máximo o erro causado por partículas em suspensão, a cubeta contendo o branco e retirado do equipamento e sua absorção anotada. Após esse processo a solução de interesse é lida, e dessa absorbância é subtraído a leitura do branco.
Espectroscopias de infravermelho
2.1. Origem
 Os avanços tecnológicos ocorridos nas ultimas d´décadas produziram uma melhoria na eficiência e o barateamento dos componentes dos equipamentos de medidas ópticas, possibilitando que as técnicas espectroscópicas fossem abundantemente usadas para a caracterização de materiais de diversos tipos. Além disso, essas t´técnicas continuam a desempenhar um papel muito importante na proposição de novos problemas físicos e na compreensão de fenômenos antes apenas teoricamente estudados. Pela versatilidade, rapidez e caráter não destrutivo, podemos destacar três técnicas espectroscópicas bastante difundidas, quais sejam: a espectroscopia de infravermelho, a espectroscopia Raman e a espectroscopia de fotoluminescência. Apesar de serem baseadas em processos de interação entre radiação e matéria, cada uma dessas técnicas fundamentada em um fenômeno físico diferente. A espectroscopia de foi Toluminescência está baseada no fenômeno de emissão de radiação por um meio. A espectroscopia de infravermelho tem seus fundamentos baseados em efeitos de absorção da radiação. Por sua vez, a espectroscopia Raman e governada por processos de espalhamento de luz pela matéria. Textos a respeito dos fundamentos de cada uma dessas espectroscopias podem ser encontrados na literatura. Porém, as especificidades apresentadas para cada caso muitas vezes impedem que o leitor iniciante possa perceber interessantes aspectos de inter-relação entre as técnicas consequentes, de sistematizar os fundamentos físicos das espectroscopias, este texto traz então uma comparação entre as três t´técnicas e expõe relações de complementaridade que elas guardam entre si. Com isso, procuramos evidenciar como essas três t´técnicas podem ser usadas individualmente ou combinadas para fornecerem informações preciosas a respeito das propriedades físicas de objetos de estudo.
2.2. Preparação da amostra
As amostras líquidas podem ser prensadas entre duas placas de um sal de alta pureza como o cloreto de sódio. Essas placas têm de ser transparente à luz infravermelha e, dessa forma, não introduzirem nenhuma linha no espectro da amostra. Essas placas obviamente são bem solúveis em água, então a amostra, os reagentes de lavagem e o meio precisam ser anídros (isto é, sem água),
As amostras sólidas normalmente são preparadas misturando-se umacerta quantidade da amostra com um sal altamente purificado (geralmente brometo de potássio). Essa mistura é triturada e prensada a fim de se formar uma pastilha pela qual a luz pode passar. Essa pastilha precisa ser prensada a altas pressões a fim de garantir de que ela seja translúcida, mas isso não pode ser alcançado sem um equipamento apropriado (como uma prensa hidráulica). Da mesma forma que o cloreto de sódio, o brometo de potássio não absorve radiação infravermelha, então as únicas linhas espectrais a aparecer virão do analíto.
Método típico 
Aparato típico
Um feixe de luz infravermelha é produzido e dividido em dois raios separados. Um passa pela a amostra, e o outro por uma referência que é normalmente a substância na qual a mostra está dissolvida ou misturada. Ambos os feixes são refletidos de volta ao detector, porém primeiro eles passam por divisor que rapidamente alterna qual dos dois raios entra no detector. Os dois sinais são comparados e então os dados são coletados.
Uma referência é usada por duas razões:
Previne que flutuações da energia elétrica da saída da fonte afetem os resultados finais, uma vez que tanto a amostra quanto a referência são afetadas da mesma forma
Por essa mesma razão, também previne a influência de variações no resultado final devido ao fato de que a fonte não necessariamente emite a mesma intensidade de luz para todos os comprimentos de onda
Permite que os efeitos do solvente sejam cancelados, já que a referência é normalmente a forma pura do solvente na qual ela se encontra.
Uso e aplicações 
A espectroscopia no infravermelho é largamente usada tanto na indústria quanto na pesquisa científica pois ela é uma técnica rápida e confiável para medidas, controle de qualidade e análises dinâmicas. Os instrumentos agora são pequenos, e podem ser transportados, mesmo para medidas de campo. Com a crescente tecnologia em filtragem computacional e manipulação de resultados, agora as amostras em solução podem ser medidas com precisão (a água produz uma banda larga de absorbância na faixa de interesse, o que daria um espectro ilegível sem esse tratamento computacional). Algumas máquinas até mesmo dirão automaticamente que substância está sendo analisada a partir de milhares de espectros de referência armazenados na memória.
Medindo-se a uma frequência específica ao longo do tempo, mudanças no caráter ou na quantidade de uma ligação em particular podem ser medidas, isso é especialmente útil na medida do grau de polimerização na manufatura de polímeros. As máquinas modernas podem tirar medidas na faixa de interesse frequentemente, como 32 vezes por segundo. Isso pode ser feito enquanto se fazem medidas simultâneas com outras técnicas. Isso faz com que as observações de reações químicas sejam processadas mais rapidamente, de forma mais precisa e mais exata.
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
 A Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é uma técnica analítica sofisticada e poderosa com uma variedade de aplicações em diferentes campos da pesquisa científica, da medicina e em diferentes setores industriais (farmacêutica, alimentícia, cosmética, agroquímica etc.). Com o desenvolvimento da metodologia e instrumentação ao longo das últimas duas décadas, a RMN tornou-se uma das mais potentes e versáteis técnicas espectroscópicas para a análise qualitativa e quantitativa tanto para os produtos naturais quanto para as misturas complexas. A InKemia há mais de uma década atua com esta técnica o que resultou na formação de uma equipe altamente especializada que atua em um ambiente de Boas Práticas de Fabricação (BPF) importante às necessidades da indústria de Ciências da Vida.
3.1. Origem
 A espectroscopia de RMN é baseada na absorção e remissão de radiação eletromagnética ocorre quando os núcleos de determinados átomos  imerso num campo eletromagnético estática são expostas a um segundo campo magnético oscilante. A ressonância magnética é uma técnica sensível para compostos que comportam 1H, 13C, 19F, 15N, 31P e, portanto, pode ser considerado como um detector universal para compostos orgânicos. Atualmente, não há outra técnica analítica que em uma única análise seja capaz de fornecer informação qualitativa e quantitativa sem o uso de padrões externos, sem a aplicação de uma separação prévia dos diferentes compostos de uma amostra. Como a ressonância magnética é uma técnica analítica não destrutiva ela permite o desenvolvimento de métodos simples e preparações fácil de se comprovar e validar. As principais aplicações da análise da RMN são:
 Elucidação estrutural de moléculas orgânicas;
Abertura de fórmulas de  produtos, a fim de identificar os componentes individuais destes;
Identificação das Impurezas de elementos desconhecidos em amostras complexas,
A quantificação dos componentes de uma amostra;
Controle de qualidade de grandes quantidades de produtos químicos, produtos farmacêuticos, produtos naturais, nutracêuticos e alimentos;
Identificação de materiais;
Estudos de temperatura e cinéticos em misturas de reação e
Determinação enantiômeros.
 3.2. Aplicações da RMN Quantitativa
A Espectroscopia de RMN Quantitativa (qRMN) é um dos métodos mais eficazes para a identificação , autenticação e estrutura de qualquer composto orgânico e suas misturas análise. Ele é descrito na Farmacopeia Europeia como um dos adequado para fins de utilização tanto qualitativos e quantitativos técnicas analíticas. As principais vantagens de RMN quantitativa são:
Intensidade de sinal integrado é diretamente proporcional ao número de átomos do grupo molecular responsável pelo sinal.
Permite analisar amostras complexas sem o uso de padrões externos e os padrões de referência, algo impossível nos métodos cromatográficos, espectrometria de massa, fotométrico e outros métodos de análise utilizados.
Como prótons são detectados com a mesma sensibilidade, independentemente da natureza química da molécula, a necessidade de determinar os fatores de resposta correspondentes é evitado.
Finalmente, existe uma relação linear entre ressonâncias integradas de componentes individuais do espectro e o seu conteúdo em substâncias estudadas o que permite quantificar amostras complexas num ensaio sem intensidades de separação anteriores.
Aplicações de RMN na indústria farmacêutica
A Espectroscopia de RMN tornou-se um dos métodos mais utilizados pela indústria farmacêutica. Tanto a Farmacopeia Europeia e a Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) têm reconhecido o seu valor e tem capítulos gerais que descrevem o equipamento, técnicas, metodologia quantitativa e qualitativa a seguir. Ambos também têm monografias oficiais farmacopeia baseado em técnicas de RMN, em particular para substâncias complexas (produtos naturais ou biológicas) ensaios. Em geral, é usada para a identificação e a determinação das substâncias ativas ou substâncias relacionadas e outros testes de impurezas. As principais aplicações da análise de RMN são:
 1. Espectroscopia de RMN quantitativa (qNMR): Devido a uma resposta igual para qualquer composto dissolvido, a qRMN é uma excelente técnica para a quantificação de qualquer substância.
Exemplos de qNMR incluem a determinação da pureza dos ingredientes farmacêuticos cativos (API) e quantificação dos ingredientes ativos, excipientes e impurezas em produtos farmacêuticos. Também podem ser determinados solventes residuais, isômeros, diastereómeros e o excesso enantiomérico.
Técnicas de RMN quantitativa é aplicada como uma alternativa à cromatografia convencional (HPLC), quando não estão disponíveis padrões de impurezas, como durante as fases iniciais do desenvolvimento da droga perfil/impureza.
2. Estudos  de  Espectroscopia RMN tornou-se um método insubstituível para a avaliação de qualidade farmacêutica, que é fundamental na identificação inequívoca e confirmação da estrutura.
O espectro de RMN pode oferecer informação detalhada sobre as estruturas moleculares e ajuda a confirmar e estabelecer a identidade das substâncias farmacêuticase impurezas.
É notável a capacidade da técnica para efetuar a identificação e quantificação simultânea de impurezas que converte RMNq uma análise simples instrumento para farmacêutica.
3. A RMN é amplamente aplicada na descoberta de novas drogas. Este estudo geralmente tem como objetivo a obtenção de:
A estrutura molecular da droga e da estrutura da ligação ao receptor e sua dinâmica no local do receptor
A estrutura do receptor e do seu complexo com o fármaco, fornecendo informações sobre a ligação e interação do grupo funcional envolvido no reconhecimento do ligante e da ligação.
Aplicações da RMN na indústria de alimentos e agroquímicos
 Nas últimas duas décadas, o uso da espectroscopia de RMN para a caracterização e análise de alimentos e materiais de agroquímicos floresceu, e esta tendência continua a crescer. Alguns exemplos são descritos são:
Análise de Vinho: para detetar a variedade, origem geográfica e possíveis adulterações, assim também criou-se um banco de dados com espectros de diferentes vinhos
Análise de  azeite (1H, 12C, 31P):. espectroscopia de RMN é uma ferramenta valiosa para determinar os diferentes compostos bioativos, avaliação e de certificação
Análises de mel: para detetar açúcares exógena.
4. Espectrometria de massa
 A espectrometria de massa é uma técnica analítica física para detectar e identificar moléculas de interesse por meio da medição da sua massa e da caracterização de sua estrutura química. O princípio físico básico de um espectrômetro de massa consiste em criar íons de compostos orgânicos por um método adequado, separá-los de acordo com a sua taxa de massa/carga (m/z) e, por conseguinte, detectá-los qualitativa e quantitativamente por sua respectiva taxa m/z e abundância. A espectrometria de massa é frequentemente aplicada no controle de poluição, controle de comida, física atômica, determinação de parâmetros termodinâmicos, e muitos outros ramos científicos.
4.1. Origem
Em 1886, o físico alemão Eugen Goldstein observou raios formados em descargas de gás sob baixa pressão que viajava através dos canais em um cátodo perfurado na direção do ânodo, e chamou este fenômeno de "Kanalstrahlen" (raios canais). Mais tarde (1907), utilizando campos magnéticos demonstrou que os raios produzidos revelavam que a matéria era composta por elementos de massa variável, sendo que a mais leve era a do hidrogênio. Em experimentos paralelos utilizando fortes campos magnéticos e elétricos, Wilhelm Wien (1898) identificou a presença de um elemento com carga positiva e massa igual a do hidrogênio, e em 1911 recebeu o Prêmio Nobel de Física. Também em paralelo, diversos estudos estavam sendo realizados por Joseph J. Thomson, que em 1897 descobriu os elétrons, recebendo o Prêmio Nobel de Física em 1906, como reconhecimento por esta descoberta. Posteriormente, trabalhando sobre os experimentos de Wien, J. J. Thomson obteve um registro em chapas fotográficas obtidos pela ionização do gás neônio. Contudo seus registros acusavam a presença de duas marcas referentes ao neônio, que foram inicialmente entendidas como se o gás neônio fosse formado por uma mistura de dois gases. Mais tarde foi atribuído que a presença de compostos de massas diferentes no gás neônio era devido à presença de seus isótopos (20Ne, 21Ne e 22Ne), assim, outros compostos isotópicos acabaram sendo identificados. Em 1918, Arthur J. Dempster desenvolveu o primeiro espectrômetro moderno, e fez a importante descoberta do isótopo 235U. Em 1919, Francis W. Aston também desenvolveu e melhorou seu espectrômetro de massa, o que lhe permitiu descobrir 212 isótopos naturais e em 1922 ele recebeu o Prêmio Nobel de Química pela sua pesquisa. Os conceitos desenvolvidos por Arthur J. Dempster e Francis W. Aston são utilizados até hoje no desenvolvimento dos modernos espectrômetros de massa. Mais tarde, na década de 50, foi desenvolvida uma das principais técnicas de análise de massas, chamada de íon trap (armadilha de íons). Seus criadores, Hans G. Dehmelt e Wolfgang Paul receberam o Prêmio Nobel de Física (1989). Contudo, todas as técnicas de ionização e análise de massas até então desenvolvidas, não permitiam análises de moléculas de alta massa molecular, mas nos anos 80, John Bennett Fenn desenvolveu um método de ionização suave chamado de electrospray ionization, que permitiu a análise de macromoléculas com baixos níveis ou nenhuma fragmentação. Fenn juntamente com Koichi Tanaka, quem desenvolveu outra técnica suave de ionização chamada de soft laser desorption (1987), receberam o Prêmio Nobel de Química em 2002. A importância do desenvolvimento desta técnica analítica pode ser notada pelo grande número de Prêmios Nobel que foram dados aos seus criadores. 
4.2. Estrutura de um espectrômetro de massa
Na espectrometria de massa quase qualquer técnica para alcançar as metas de ionização, separação e detecção de íons em fase gasosa se aplica. Com isso, há uma configuração básica para todos os tipos de espectrômetros de massa. Um espectrômetro de massa consiste de uma fonte de íons (em que os componentes de uma amostra são convertidos em íons, através de um agente ionizante), seguido por um analisador de massa que separa os íons de acordo com a taxa m/z e um detector, o qual conta e transforma a corrente de íons em sinais elétricos que posteriormente vão para um sistema de computador que processa o sinal, todos os componentes do espectrômetro sendo operados sobre condições de alto vácuo.  O resultado é um espectro de massa, que é uma representação, em duas dimensões, da intensidade do sinal (eixo das ordenadas), (que reflete diretamente a abundância das espécies iônicas) versus m/z(abscissa).  O espectrômetro de massa é, assim, composto de quatro partes:
O sistema de introdução de amostras
Os métodos mais comuns são:
a inserção direta: a amostra é colocada em primeiro lugar sobre uma sonda e, em seguida, inserido na região de ionização do espectrômetro de massa, tipicamente através de um bloqueio de vácuo, após a amostra é aquecida e evaporada).
a infusão direta: Um capilar simples ou uma coluna capilar é utilizado para introduzir uma amostra, tal como um gás ou uma solução. Essa técnica, por exemplo, inclui a cromatografia de gás.
A fonte de ionização: Nessa etapa a consideração mais importante é a energia interna transferida durante os processos de ionização e as propriedades físico-químicas que podem ser ionizados. Como exemplos de algumas fontes de ionização, temos:
Ionização por elétrons
Ionização química
Bombardeamento atômico rápido (FAB)
ionização química à pressão atmosférica
ionização por electrospray
A matriz de deserção a laser assistida por ionização (MALDI)
Analisador de massa: etapa em que ocorre a separação dos íons de acordo com a relação massa/carga (m/z). Há analisadores de baixa resolução: o quadrupolo (Q), o ion trap 3D (IT) ou linear (LIT) e analisadores de alta resolução ,que medem a massa exata dos analitos: o setor magnético acoplado com um setor elétrico, o tempo de voo (TOF),Transformada de Fourier de ressonância cíclotron de íons (FT-ICR) e Orbitrap. Estes analisadores podem ser acoplados em conjunto para executar as experiências de espectrometria de massa em tandem . Em geral, um primeiro analisador separa os íons, uma célula de colisão é usada para os íons do fragmento, e um segundo analisador os separa do fragmento. Alguns analisadores, como armadilhas de íons(ion trap,em inglês) e FT-ICR, constituem vários analisadores e permitem uma fragmentação dos íons e análise dos fragmentos diretamente.
O sistema de detecção e processamento: etapa em que o detector transforma a corrente dos íons em sinal elétrico. Além disso, o detector amplifica o sinal obtido o qual pode ser processado por computador, criando, por conseguinte, o espectro de massa correspondente.
4.3. Aplicações
A espectrometria de massa é utilizada na análise química analítica e como um método para a determinação de elementos químicos ou compostos. Nesta forma, espectrômetros de massa são usados​​em muitos campos da ciência e da tecnologia para a análise de materiais, incluindo química, biologia, arqueologia e climatologia.
Também se utiliza a espectrometria de massa em partículas. Nesta área, no entanto, o objetivo não é tanto a análise de elementos químicos, mas a determinação das massas de partículas elementares e núcleos atômicos ou a detecção de partículas ainda desconhecidas.
4.4. Bioquímica
A espectrometria de massa é utilizada em proteoma e metaboloma, onde o uso corresponde, em grande parte em química. A Espectrometria de massa de proteínas foi nomeada pela revista Nature Methods o método do ano 2012.
Referências bibliográficas:
https://www.infoescola.com/quimica/espectrofotometria/
https://pt.wikipedia.org/wiki/Espectroscopia_UV/vis%C3%ADvel
https://pt.wikipedia.org/wiki/Espectroscopia_de_infravermelho
http://www.sbfisica.org.br/rbef/pdf/344309.pdf
https://inkemiabrasil.com/2016/07/19/a-ressonancia-magnetica-nuclear-uma-tecnica-analitica-em-expansao/
https://pt.wikipedia.org/wiki/Espectrometria_de_massa