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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLOGICAS LICENCIATURA EM CIÊNCIAS NATURAIS BIOQUÍMICA FUNDAMENTAL AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA AMILASE SALIVAR ALUAN MAGALHÃES MACHADO GABRIEL SOUZA PEREIRA GENIVAL CALAÇO DE SOUSA JUNIOR PÂMELA VIEIRA DO NASCIMENTO PETERSON DE MOURA ORIENTADOR: PROF. DR. BRUNO MENDES TAVARES MANAUS-AM 2017 ALUAN MAGALHÃES MACHADO GABRIEL SOUZA PEREIRA GENIVAL CALAÇO DE SOUSA JUNIOR PÂMELA VIEIRA DO NASCIMENTO PETERSON DE MOURA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA AMILASE SALIVAR Relatório apresentado ao Curso de Ciências Naturais, como parte da composição de nota da Disciplina Bioquimica Fundamental, oferecida pela Universidade Federal do Amazonas através do Instituto de Ciências Biológicas. ORIENTADOR: PROF. DR. BRUNO MENDES TAVARES MANAUS – AM 2017 1 INTRODUÇÃO Enzimas são catalisadores biológicos cuja natureza química é proteica. A natureza proteica das enzimas lhe proporciona alto grau de especificidade. A grande maioria das reações biológicas não ocorrem, ou ocorrem a velocidades baixíssimas nas condições fisiológicas de pH e temperatura. Logo, as reações biológicas, em geral, necessitam de catálise para ocorrer, isto é, necessitam de enzimas. Para cada reação há uma enzima específica. A digestão do amido tem início na boca por ação da enzima amilase salivar, conhecida também por ptialina, que hidrolisa as ligações (14) das cadeias do amido, produzindo glicose, maltose e oligossacarídeos. Figura 1. Hidrólise do amido pela enzima amilase. A atividade da amilase pode ser medida pela quantidade de amido (substrato) restante ou pela quantidade do produto formado. A comprovação da presença de amido é feita utilizando-se lugol (coloração castanha), que contém iôdo. Pela mistura do amido com lugol, desenvolve-se uma coloração azul/preta que é devida a um complexo instável (produto de adsorção) constituído por amido, iôdo e água.. Portanto, a coloração azul/preta indica presença de amido, isto é, que a enzima não atuou. A estrutura e a forma do sítio catalítico de uma enzima são uma decorrência da estrutura tridimensional da enzima e podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças conformacionais na estrutura proteica, como variação de pH, temperatura, composto orgânicos como uréia, etc. A amilase é uma hidrolase que tem a função de degradar carboidratos. Ela é predominantemente produzida pelas glândulas parótidas e pâncreas. A digestão do amido tem início na boca por ação da enzima α-amilase salivar, conhecida também por ptialina, que hidrolisa as ligações das cadeias do amido, produzindo glicose, maltose e oligossacarídeos. A α-amilase salivar é uma enzima unida ao cálcio que inicia a digestão do amido na cavidade oral. Os genes da α-amilase estão localizados em um cluster no cromossomo que inclui os genes da amilase salivar (AMY1), dois genes da α-amilase pancreática (AMY2A e AMY2B) e um pseudogene relacionado. Os genes AMY1 demonstram extensa variação do número de cópias que é diretamente proporcional ao teor da α-amilase salivar na saliva. (SANTOS, 2012) 2 OBJETIVO Verificar a ação da amilase salivar sobre seu substrato, o polissacarídeo amido. Verificar o efeito do PH sobre a atividade da amilase salivar. 3 MATERIAL MÉTODOS 22 tubos de ensaio; 2 copos descartáveis; 2 Béquer (100 ml); 1 Bureta (50 ml); 1 Pipetador automático; 1 Pipeta de Pasteur; 1,0 ml de saliva; 10 ml de água destilada; 2 gotas de lugol; 2 ml de tampão fosfato; 2ml de tampão glicina; 4 ml de NaCl; 10ml de solução de amido; 4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL O experimento teve início com a numeração, de 1 a 10, e divisão dos 22 tubos em dois grupos, a e b, cada um com 11 tubos, adicionou-se 2 ml de água destilada e duas gotas de lugol em todos os tubos. Para a preparação da solução de saliva, um dos membros da equipe doou sua saliva em um copo descartável, a solução foi preparada em um copo com 1,0 ml da saliva doada e 10 ml de água destilada, a solução foi guardada até o momento do uso. Para a primeira reação, foi misturado em um béquer 5 ml da solução de amido, 2 ml do tampão fosfato, cujo Ph 6.8, e 2 ml de NaCl. Foi retirado duas gotas da solução da reação e adicionado ao tubo B, nomeado anteriormente e antes da saliva ser adicionada. Em seguida foi adicionado 2 ml de solução de saliva a solução da reação, foi colocado imediatamente 2 gotas da solução da reação nos tubos, de 1 a 10, a ordem e o tempo das reações foram anotados. Para a segunda reação, foi misturado em um béquer 5 ml de solução de amido, 2 ml do tampão glicina, cujo Ph 1.7, E 2 ml de NaCl. Foi retirado 2 gotas da solução da reação adicionado ao tubo, antes de ser colocada a saliva. Em seguida foi adicionado 2 ml de solução de saliva a solução da reação, foi colocado imediatamente 2 gotas da solução da reação nos tubos, de 1 a 10, a ordem e o tempo foram anotados. 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Na tabela 1 abaixo encontram-se os resultados obtidos na primeira reação: Tempo 0 min 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min 6 min 7 min 8 min 9 min Solução de reação Tendo como substrato o amido e cofator enzimático o NaCl e a partir dos resultados obtidos, nota-se que a cada tudo a solução vai ficando com coloração mais clara que a do anterior, isso ocorre pois quanto menor foi o tempo de reação das enzimas, menos elas puderam fazer a quebra de todo o amido, logo a indicação mais escura deve-se ao fato de não ter dado tempo da enzima fazer a quebra do amido completamente. Deve ser levado em consideração que o tampão serve para amenizar e deixar o ph relativamente constante, e também que o tampão fosfato possui Ph 6.8, muito próximo ao Ph ótimo para a atividade enzimática, logo a mudança de coloração e o tampão fosfato com ph próximo ao ph ótimo das enzimas foram os fatores responsáveis para que, com o passar dos minutos, a reação apresentasse a colocação mais clara, indicando a ação das enzimas na quebra do amido. Na tabela 2 abaixo encontram-se os resultados obtidos na segunda reação: Tempo 0 min 1 min 2 min 3 min 4 min 5 min 6 min 7 min 8 min 9 min Solução de reação 5 CONCLUSÃO As enzimas são proteínas com atividade catalítica. Elas aceleram reações termodinamicamente favorecidas. Os compostos transformáveis pela ação da enzima recebem o nome de substrato. REFERÊNCIAS 1. Santos JL, Saus E, Smalley SV, Cataldo LR, Alberti G, Parada J, Gratacòs M, Estivill X. Copy number polymorphism of the salivary amylase gene: implications in human nutrition research. J Nutrigenet Nutrigenomics. 2012;5(3):117-31. 2. Artigo: AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA: Fatores que afetam a atividade enzimática .Disponível em < http://www.foa.unesp.br/home/departamentos/ciencias_basicas/2016--fatores-que-afetam-a-atividade-enzimatica_final.pdf > Acesso em 3 de set às 23:41h.
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