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Universidade Tecnológica Federal do Paraná Campus Campo Mourão Coordenação de Alimentos Disciplina de Microbiologia Profa. Márcia R. F. G. Perdoncini AULA PRÁTICA n° PREPARO DE MEIOS DE CULTURA Introdução Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos e fornecem os princípios indispensáveis ao seu crescimento. As exigências nutritivas estão relacionadas a uma fonte de carbono, de nitrogênio, de energia e de sais minerais. Alguns microrganismos também necessitam de fatores de crescimento, substâncias que eles não podem sintetizar, tais como vitaminas, aminoácidos, entre outras. Além disso, alguns meios podem ser formados por preparados de sangue, de carne, de leite e de vários outros produtos. O ágar, agente solidificante largamente usado, formado por extrato de algas marinhas, funde-se em torno do ponto de ebulição da água, formando uma solução transparente que permanece no estado líquido até em torno de 40°C. Uma vez eu a maioria dos microrganismos não é morta a 45°C, eles podem ser adicionados a um meio com Agar ainda liquefeito em tubos de ensaio ou placas de Petri. Depois que o meio com Agar se resfria e se solidifica, ele permanecerá solidificado a temperaturas de incubação e pode ser inoculado com microrganismos. O Agar não serve como nutriente para a maioria dos microrganismos e não é metabolizado durante o crescimento. Existem algumas observações importantes no preparo de meios de cultura: • Não se pode manter o meio de cultura à temperatura ambiente em uma solução não-esterilizada por mais de uma hora, devido à possibilidade de evaporação da água e de crescimento microbiano. • Frascos de meios de cultura desidratados são altamente higroscópicos, portanto mantê-los em ambientes secos e o menor tempo possível abertos. • Seguir sempre as orientações do fabricante; • Utilizar sempre o frasco mais antigo do estoque; • Proteger os frascos da luz; • Desprezar meios que apresentem sinais de hidratação; • Observar data de validade; • Pesar precisamente os componentes do meio e em equipamento adequado; • Utilizar somente água destilada, ou deionizada, ou tratada por osmose reversa; • Afrouxar as tampas dos frascos e tubos para autoclavação; • Respeitar o máximo de material a ser esterilizado; • Verificar após esterilização (quando necessário) o valor de pH da preparação, cor, estabilidade e consistência. • Incubar amostra representativa do lote; • Incubação de controle branco a cada inoculação; • Armazenamento após preparo longe da luz, em local limpo e evitar perda de umidade; • Descartar se apresentar perda de umidade, mudança de cor ou crescimento microbiano; • Registrar SEMPRE a data de preparação. Validades: • Distribuídos em placas, armazenar de 4 a 12°C por uma semana; • Suplementos/reagentes estéreis- 3 meses de validade sob refrigeração; • Meios completos e basais ainda não suplementados- 3 meses sob refrigeração; 1 mês a temperatura ambiente. Fusão do ágar • Banho-maria ou processo que seja efetivo; • Aquecimento o tempo mínimo necessário; • Armazenamento de 45-49°C por no máximo 4 horas; • Não fundir novamente se solidificado. Adição de suplementos • Meio resfriado a 45-49°C; • Se retirados do refrigerador aguardar atingir temperatura ambiente; • Não reaquecer. Distribuição em placas • Camadas de aproximadamente 2mm; • Superfície fria e plana para solidificação. MATERIAIS • Agar (tubos inclinados) e caldo nutriente; • Caldo EC; • Agar batata dextrose (PDA); • Ácido tartárico 10%; • Água destilada. PROCEDIMENTO Prática Preparo de meio líquido: caldo EC e caldo AN • Pesar o meio de cultura em papel alumínio e, a seguir, transferi-lo para um balão de fundo chato; • Verter sobre o papel de filtro uma pequena quantidade de água para arrastar todo o meio; • Adicionar água deionizada ou destilada ao meio de cultura; • Colocar a boneca nos balões e a coifa de papel com o nome do meio e a data; • Autoclavar a 121°C por 15 minutos; • Distribuir em tubos esterilizados a quantidade necessária para análise. OBS.: ACOMPANHAR O PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO!!!! Prática Preparo de meio sólido (Agar nutriente e PDA) • Pesar o meio de cultura em papel alumínio e, a seguir, transferi-lo para um balão de fundo chato; • Verter sobre o papel de filtro uma pequena quantidade de água para arrastar todo o meio; • Adicionar água deionizada ou água destilada ao meio de cultura; • Levar o balão com o meio para um banho-maria a 60°C durante 20minutos. A cada 3 minutos, homogeneizar para a dissolução do meio de cultura; 1. Para o PDA • Colocar a boneca nos balões e a coifa de papel com o nome do meio e a data; • Autoclavar a 121°C por 15 minutos; • Após a autoclavagem, levar o meio para um banho-maria a 50°C até o momento do uso. 2. Para o Agar nutriente: • Distribuir em tubos e autoclavar a 121°C por 15 minutos; • Após a autoclavagem, inclinar tubos. OBS.:Plaqueamento: Agar PDA • Destampar o balão na zona estéril de um bico de Bunsen, flambando a boca para impedir a entrada de eventuais microrganismos; • Resfriar até a 46-48°C. Adicionar cerca de 1,5 mL de solucão aquosa de ácido tartárico 10% para cada 100 mL, de forma a baixar o pH até 3,5. • Verter entre 18mL e 20mL do meio de cultura em placas de Petri estéreis com técnica asséptica; • Deixar a placa em posição horizontal até que o meio de cultura se solidifique completamente; • Armazenar as placas em posição invertida na geladeira. EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 1. Por que os microbiologistas utilizam meios quimicamente definidos? 2. Por que o Agar é o agente solidificante ideal para uso em microbiologia? 3. Qual é a constituição do Agar? Qual a finalidade da sua incorporação nos meios de cultura? 4. Quando um microbiologista utiliza um meio de enriquecimento para o cultivo de microrganismos? 5. Qual a composição dos meios EC, PDA e Agar nutriente? Quais as suas finalidades? 6. Por que tem que abaixar o pH do meio PDA após a esterilização para sua posterior utilização? REFERÊNCIAS OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologia- roteiros de aulas práticas. São Paulo: Tecmedd, 2008.
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