Bioténicas Aplicadas em Reprodução Animal (6)

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massal>3;motilidadeprogressivaindi-
vidual>3 e <15%dealteraçõesmor-
fológicas),segundoNunesetalo(1997).
Colheitae manipulaçãodo sêmen
O sêmenpodeserprocessadodediferen-
tesmaneiras,podendoserusado:
a) fresco,puroou diluído;
b) resfriado;ou
c) congelado.
SegundoNunesetaI. (1997),o sêmen
frescoe resfriadoapresentafertilidademais
elevada;ocongeladopreserva-seporumpe-
.ríododetempoindefinido,semantidoem
nitrogêniolíquidoàtemperaturade-196°C
eédemaioraplicabilidade,quandocompa-
radoaosêmenresfriadoa 4°C,cujaviabili-
dademáximaéde48horas.Produtodaeja-
culaçãonormaldeumreprodutor,o sêmen
écompostodeespermatozóides,produzidos
nostestículos,eumafraçãolíquida,produ-
zidapelasglândulasacessóriasdoaparelho
genitalmasculino.Os espermatozóidessão
ascélulasresponsáveispelafecundaçãodos
óvulosnasfêmeas.Na colheitadosêmende
bodes,utiliza-sea vaginaartificial,instru-
mentoquesimulaascondiçõesdepressãoe
temperaturadasvaginasnaturais.A vagina
artificialpodeserconstituídaporumtubode
PVC rígido,umtuboelásticodeborrachae
umatorneira,porondedevepassaraáguaà
40°C. Na extremidadedestaestrutura,aco-
pIa-seumcopodecolheitagraduadoemdé-
cimosdemilímetros(Figura7.2).
Figura7.2.Vaginaartificialacopladaa copocoletar
118
O atodecolhero sêmenésimples:segu-
ra-sea fêmeaemestronaturalou induzido,
apresentando-aaomacho.Quandoesteefe-
tuarosalto,segura-seoprepúciocomamão,
desviandoo pênisparadentrodavaginaar-
tificial.A ejaculaçãoéquaseinstantânea.O
materialcolhidodeveserprotegidoda luz
solardireta,dapoeira,daagitaçãoedemu-
dançasbruscasdetemperatura.
Avaliaçãodo sêmen
O sêmendeveseravaliadodeacordocom
asseguintescaracterísticas:
. volume:variade0,5a2,0ml;
. cor:deveseramarelada,desprezando-
seosêmencomcoloraçãoavermelhada
oucomcordechocolate,indicandopre-
sençadesangueoupus;
. aspecto:variandodeleitosoacremoso,
desprezando-seosêmenaquosooutur-
vo,indicativodepequenonúmerode
espermatozóides;
. concentração:determinadanoespectro-
fotômetroounomicroscópiosegundo
atécnicaempregadaemhematimetria;
significaaquantidadedeespermatozói-
desemcadamililitrodesêmen.Ovalor
normalestáemtornode3bilhões/ml;
. Turbilhonamento(motilidademassal):
movimentodamassadeespermatozói-
desnoplasmaseminal.Assemelha-seàs
ondasdomarepoderecebernotasde
O(semmovimento)a 5 (movimentos
muitofortes)
.Motilidadeindividualprogressiva:movi-
mentoemflechadecadaespermatozói-
de(escaladeOa5).Paraainseminação
artificialdevemserutilizadossomente
ejaculadosqueapresentaremvalores
paramotilidadeigualousuperiora 3;
. Morfologiaespermática:aporçãodees-
permatozóidespatológicos(semcauda,
comcaudadupla,comduplacabeça,etc.)
dentrodapopulaçãoespermática,não
devendoultrapassaros15%.
Diluiçãodosêmen
Apósa etapadeavaliaçãoeconsideran-
do-seteraamostradosêmenboaqualidade,
passa-seà fasedediluição,a qualdeveter
concentraçãofinal,paracadadose,deapro-
ximadamente200milhõesdeespermatozói-
desporml.Casonãosedisponhamdemeios
paradeterminar,comeficácia,talconcentra-
ção,procede-seuma diluiçãopráticacom
umapartedesêmenparanovepartesdo di-
luente,istoé,para1,5ml desêmen,adicio-
nam-se13,5mldodiluente,obtendo-se15ml
desêmendiluído,quantidadesuficientepara
inseminar30fêmeas,jáqueseutiliza0,5ml
dasoluçãopor inseminação.
Escolhadodiluente
Umbomdiluentedeveseratóxicopara
osespermatozóides;terpHepressãoosmó-
ticacompatíveiscomasobrevivênciaesper-
mática;serdebaixocustoe preparofácil.
Dentreosváriosdiluentes,destacam-se:
a) Diluenteparasêmencongelado(-196°C):
Leitedesnatado 20g
Glicose 388mg
Águabidestilada 200ml
PenicilinaG sádica 200.000U.I.
Sulfatodeestreptomicina 100mg
b) Diluenteparasêmenresfriado(4°C):
Águadecocofiltrada 50ml
Águabidestilada 25ml
Soluçãodecitratodesódioa 5%25ml
O cocoutilizadodeveter,aproximada-
mente,seismesesdematuração,ouseja,
apresentar-senoiníciodaformaçãodaca-
madatipo"gel".Antesdeserutilizada,de-
ve-seprocederàfiltragemdaáguadecoco
emfiltrodepapel(Salgueiro,2000).
Envasamento
Apósadiluição,osêmendeveseracondi-
cionadodemaneiraapermitiraaplicaçãofácil
erápida.Porisso,sãoenvasadosem"palhe-
tas"de 0,5 ml, paraposteriorrefrigeração
ou congelação.No envase,procedimento
simples,segura-seapalhetapelaporçãosu-
perior(extremidadefechada),insere-seaex-
tremidadeopostanosêmendiluídoeenche-
seapalheta,poraspiração.A seguir,bate-se
suavemente,a fim deformarumapequena
bolhadear nasuaporçãoterminal,preen-
chendo,esseespaço,commassademodelar,
álcoolpolivinílicoouselarcomseladoraelé-
trica.Por ocasiãodainseminação,remove-
seesselacre,cortando-ocomumatesoura.
As dosesdevemseridentificadas,principal-
mentequandosãoutilizadossêmenderepro-
dutoresdistintos.A identificaçãomínimade-
vecontera raça,o nomeou númerodore-
produtor,a dataea horado envasamento.
Resfriamentodo sêmencaprinodiluídoem
águadecoco
A águadecoco,porserpobreemfosfoli-
pídios,apresentou-secomoumdiluentefa-
vorável,possibilitandoumexcelentecompor-
tamentodo sêmencaprino,tantoin vitro
quantoinvivo.A tecnologiadosêmencapri-
no resfriadoe diluídoemáguadecocoou
leitemostrou-seeficientenoprocessodedi-
fusãogenéticadereprodutoresdaraçaSaa-
nen.O maiortempodesobrevivênciadosê-
mendessesreprodutoresemáguadecoco
permitiu,atravésdeumbaixocustoeconô-
mico,aumentaraprodutividadeleiteiradas
cabrasnativasemcertasregiõesdoNordeste
brasileiro.
A águadecocoapresentaresultadossatis-
fatórioscom o sêmendiluídoe resfriadoa
4°C. No entanto,paraa congelação,os re-
sultadosnãosãodesejáveis,poisa presença
defosfolipídiosé necessáriaparaa criopre-
servaçãodascélulasespermáticas,principal-
menteàtemperaturaabaixodeO°C,havendo
anecessidadedaadiçãodecertaquantidade
de fosfolipídios,apósa lavagemdo plasma
seminal,possibilitando,umaboacriopreser-
119
vaçãodomaterialespermáticoeviabilizan-
do,dessaforma,o sêmencaprino,tantoin
vitroquantoinvivoapósacongelação.
Tratamentodo sêmenapósa colheita
Apósacolheita,avaliam-seovolume(ml),
aconcentraçãoespermática(109sptz/ml)e
turbilhonamento(motilidademassal-escore
deOa5).O volumeédeterminadoporobser-
vaçãodiretaatravésdecopocoletorgradua-
doeaconcentraçãoespermáticaporespec-
trofotometriautilizando-se5 mldeumaso-
luçãosalinaformolizadaa 0,1%e 50 I.Lide
espermapuro.O númerototaldeesperma-
tozóidesnoejaculadoédeterminadomulti-
plicando-seovolumepelonúmerodeesper-
matozóidesindicadospo~mlatravésdatra-
mitânciadecadaanimal.O turbilhonamento
édeterminadopor observaçãodeumagota
deespermapuro,emmicroscopiaótica(au-
mentode 1OOX).
~ Preparaçãoda soluçãoa basede água
de coco (100mil
Utiliza-se50%deáguadecocofiltrada,
25%deáguabidestiladae25%desoluçãode
citratodesódioa 5%.O cocoaserutilizado
deveter,aproximadamente,de4 a 6 meses
dematuração,ouseja,apresentar-senoinício
daformaçãodacamadatipo"gel".A ftltração
deveráserrealizadaemftltrodepapel.
A águabidestiladaseráutilizadaparabai-
xara osmolaridadepara300miliosmolese
ocitratodesódioa5%paraelevaropH para
6,2a6,8,sendooscitadosvalorescompatí-
veisparao sêmencaprino(Nunes& Com-
barnous,1995).
~ Adiçãode gemade ovo
Acrescenta-se2,5%degemadeovoàso-
luçãoa basedeáguade coco,ou seja,em
umasoluçãode 100ml, retira-se2,5mlda
soluçãoedescarta-se,emseguida,adiciona-
se2,5mldegemadeovoàsolução.A gema
120
deovo,porserricaemfosfolipídeos,protege
os espermatozóidesdo choquetérmicoem
temperaturasabaixodeO°C (Mies Filhoet
aI.,1982).
~ Usodo glicerol
O gliceroléutilizadocomocrioprotetor
emumaporcentagemde 7%em 100mlda
soluçãofinal.Paraaadiçãodoglicerol,sepa-
ra-seasoluçãode 100ml,já adicionadada
gemadeovo,emdoisrecipientesde50 ml.
A primeirasoluçãoserádenominadadefra-
çãoA eterá0%deglicerol,sendoacondicio-
nadaemumbanho-mariaaumatemperatu-
ra constantede 37°C.À segundasolução,
acrescentar14%deglicerol,ouseja,descar-
ta-se7 ml da soluçãoe acrescenta-se7 ml
deglicerol.Talsoluçãoserádenominadade
fraçãoB edeveráserlevadaaofreezerpara
queatinjaa temperaturade4°C.
~ PrimeiradiluiçãoRealizadanaproporçãode1partedesê-
menpara4,5 partesda fraçãoA, ou seja,
1ml desêmenpara4,5ml da fraçãoA.
Avaliaçãoda motilidadeindividualpro-
gressiva(MIP) edapercentagemdeesper-
matozóidesmóveis
Apósaprimeiradiluição,osêmenéincu-
badoa37°Cembanho-maria,sendoentão
avaliadasamotilidadeindividualprogressiva
(MIP) eapercentagemdeespermatozóides
móveis(% sptzmóveis)estimadasemmi-
croscopiaótica(aumentode400X),porexa-
mesubjetivodeumagotadesêmendiluído
eavaliadoentrelâminae lamínula.
~ Resfriamentodo sêmen
Ocorredeformaprogressiva,nageladeira
enãonofreezer,ondepermanecepor45mi-
nutos,aproximadamente,dentrodeum bé-
querouumcopodevidrocontendoágua,até
atingira temperaturade 12°C.Atingidaesta
temperatura,transporta-seo sêmenparao
freezer,atéatingira temperaturade4°C.
~ Segundadiluiçãoou glicerolização
A glicerolizaçãorealiza-seem3etapasque
constamdeadição,acada5minutos,deuma
parcelada fraçãoB, duplicandoo volumee
reduzindoaprimeiradiluiçãopelametade.
~ Examepós-glicerolização
Antesdeenvasar,avalia-seamotilidade
individualprogressivaeaporcentagemdees-
permatozóidesvivos,atravésdemicroscópio
óticonoaumentode400x.
~ Envasamentoe Congelação
Depoisdeenvasadosempalhetasefecha-
doscomálcoolpolivinílicooumassademo-
delaratóxica,sãolevadosa um isoporcom
rampasuspensaa 3 cmdabaseparaqueas
palhetasrecebamsomenteosvaporesdeni-
trogêniolíquido,atéatingiratemperaturade
- 60°C.Decorridos5 minutos,transfere-se
parabotijõesdenitrogêniolíquidoa- 196°C,
ondeserãoarmazenados.
Avaliaçãodo sêmenapósa descongelação
Decorridos15diasapósacongelação,re-
tiram-sedobotijãoamostrasaleatóriasdepa-
lhetasparaadescongelação.Aspalhetassão
imersasembanho-mariaaumatemperatura
de37°C,durante1minuto.Descongeladas
asamostras,avaliam-se,novamente,amoti-
lidadeprogressivaindividualeapercentagem
deespermatozóidesvivosemcadadiluente
e,ainda,asalteraçõesmorfológicas.
~ Avaliaçãodas alteraçõesmorfológicas
Efetuam-se"esfregaços"desêmendecada
amostradescongelada,utilizando-seumaso-
luçãodecoloraçãocompostadeeosinaa 1%,
denigrosinaa3%edecitratodesódioa 3%
(Colas,1980).Emcada"esfregaço"sãoava-
liadas150células,observando-seosdefeitos
decabeça,daspeçasintermediárias,dasgotas
citoplasmáticasproximaledistaledoflagelo,
atravésdemicroscópioótico,utilizandoocu-
larde 10%eobjetivadeimersão(100%).
No queserefereàmorfologiadoesper-
matozóide,Arbeiter(1964)detectou15,5%
deespermatozóidesmorfologicamenteanor-
mais,apóso examede 144ejaculadospro-
venientesdenoveanimaissadios.A freqüên-
cia entrediferentesalteraçõesclassificadas
emseisgruposéaltamentesignificativa(Ta-
bela7.2).
Tabela7.2. Freqüênciadeanomaliasmorfolágicosdosespermatozái-
desde bodescomumquadroespermáticonormal.
Alterações
Portesuperiordocabeça
Cabeça
Peçointermediário
Flogelo
Estruturasduplosoumúltiplos
Fonte:Arbeiter,1964.
%
3,00
0,74
3,00
6,5
0,01
Principaisresultadosreferenteà
utilizaçãoda água de cocoe seu
princípioativo (IAA) na
inseminaçãoartificial em caprinoso
Sobaformadegeleestabilizada,aágua
decocotemmostradoexcelentesresultados
noaumentodastaxasdeparição,noíndice
deprolificidadeenafertilidade.Osresulta-
dosobservadoscomcabrasinseminadascom
sêmendiluídoemáguadecocoxleiteestão
ilustradosabaixo(Tabela7.3).
Tabela7.3. Fertilidadedecobrasinseminadascomsêmendiluídoem
águade cocoe leite.
Porõmetros Águodecoco Leite
Fertilidade aos 60 dias
Taxo de ponção
Taxo de prolificidode
Proporção de fêmeas
Proporção de mochos
Fonte: Nunes, 1998.
85%(136)
60%(96)
110%(105)
43%(45)
57%(60)
88%(194)
68%(150)
180%(266)
72%(194)
28%(72)
Toniolli& Mesquita(1990),trabalhando
comsêmensuínodiluídoemáguadecoco,
obtiveramtaxadepariçãosuperioraoBTS,
121
alémdeummelhorcomportamentodo sê-
meninvitrocomrelaçãoàmotilidade.Refe-
renteahumanos,amotilidadeepercentagem
deespermatozóidesmóveisdosêmendiluído
emáguadecocoou 1M foramestatistica-
mentesuperioresaosdosdiluentesconven-
cionais.Montezumaet aI. (1974)realizou
testedetermo-resistênciaa 37°Cno sêmen
caninodiluídoemáguadecocoeobservou
queamotilidadeeporcentagemdeesperma-
tozóidesmóveisforamsuperioresàquelas
obtidascomodiluenteàbasedeleitedesna-
tado,sobretudoaofinaldotempodeincuba-
çãode 120minutos.
Resultadossuperiores(p<O,OS)emto-
dosostemposdeincubaçãoparaaáguade
cococomodiluente,emrelaçãoaoleite,fo-
ramencontradosnasavaliaçõesdaspercen-
tagensdeespermatozóidesmóveisedamo-
tilidadeprogressivadosêmenovinoincubado
a 15°Cdurante24horas(Tabela7.4).
Tabela7.4. Percentagemde espermatozóidesmóveise motilidade
progressivado sêmenovinodiluídoemáguadecoco
e no leite,incubadasa 15QC.
Avaliaçãoinvitroe invivodosêmendeovinos,
caprinose humanosadicionadode IAA
Cruz(1994)trabalhandocomsêmenovi-
nodiluídoemáguadecocoeno1M econ-
servadopor48horasa4°C,observoutaxas
depariçãode42%para1M, 22%paraaágua
decocoe0%parao leite,lactoseegemade
ovo (Cruz, 1994).
122
Na espéciehumana,realizaram-seen-
saiospreliminarescomsêmendeindivíduos
oligospérmicos,incubadosà temperatura
ambienteediluídoem1M ediluenteMene-
zo,sendoobservadaamotilidade(velocidade
retilíneadoespermatozóide)duranteumpe-
ríodode20horas,emambososdiluentes.A
açãodo1M namenordosagem,ouseja,fan-
togramas(1019IM/rnl desêmen)foi signi-
ficativamentesuperioremrelaçãoàs doses
crescentesde1M e,ainda,emcomparação
como diluenteMenezo.
Na Índia,foramisoladaseidentificadas,
naáguadecoco,assubstânciaspromotoras
docrescimentorevelandováriascitocininas
endógenase,ainda,traçosdezeatinaeribo-
sídeo.O endospermalíquido,concomitan-
temente,mostroua presençade 1M e de
duasgiberelinas.
Dix& VanStanden(1982)identificaram
naáguadecocoassubstâncias"giberielin-
like",queconstituemastermolábeis,"asamá-
naseascitocininas,fatoresativosqueserela-
cionamcomfatoresestabilizadoresdecalor,
já queosníveisdecitocininasconhecidase
presentesnaáguadecoco,sãoelevados.
A comparaçãoda motilidadeindividual
progressivados espermatozóidescaprinos
diluídosemáguadecocoin naturacomeste
diluenteacrescidode 10ng/mldezeatinae
comO,OSng/mlde1M, evidencioumelhor
comportamentocomaadiçãode1M (Tabela
7.5).No queserefereaocomportamentoin
vivodo 1M, a melhorfertilidadedo sêmen
semprefoialcançadacomasmenoresdoses.
Tabela7.5. Motilidadeindividualprogressivadosêmendecoprinosdiluído
emáguadecocoinnaturaeacrescidadezeatinae1M.
Tempode
incubação
(minutos)
5
30
60
90
120
Diluenteáguodecoco(motilidade- média:t DP)
innatura1OngdeZeatina/ml0,05ngdeIM/ml
45.7:t19,832,8:t12,7 23,6:t24,5
42,8:t21,130,°:t16,0 60,°:t25,0
35.7:t12,9 27,1:t8,08 54,3:t23,0
40,°:t13,027,1:t11,7 47,1:t21,8
37,8:t19,2 25,°:t14,2 35,8:t15,7
Fonte:Salles,1989.
Tempodeincubação Águodecoco Leite
(horas) (%sptzmóveis) (%sptzmóveis)
-motilidade- -motilidade-
2 85-4,5 80-4,5
4 80-4,5 70-4,0
6 70-4,0 60-3,5
8 60-4,0 50-3,0
24 50-3,0 3°-2,0
Fonte:Nunes,1998.
Diantedosresultadosalcançados,pode-
seconcluirqueaáguadecocoinnatura,des-
dequecorrigidosaosmolaridadeeopH para
o sêmenda espécierespectiva,constitui-se
emumdiluenteeficiente,comumarelação
custo-benefíciofavorávelaosprogramasde
inseminaçãoartificial.Alémdisso,a fração
ativadaáguadecococontendoasubstância
IAA apresentaefeitopotencializador,incre-
mentandoamotilidadein vitrodeesperma-
tozóidesdecaprinos,ovinose suínos,com
correlaçõespositivassobrea fertilidadedos
rebanhosdasreferidasespécies.
ConsideraçõesFinais
A seleçãodereprodutorescaprinospo-
derácontribuircomaelevaçãodastaxasde
crescimentodeanimaisjovensecomame-
lhoriadaeficiênciareprodutivaedomaterial
genéticodosrebanhos,umavezque,além
decontribuircommetadedo patrimônio
genéticoparaa progênie,aindasepode
aplicarnelesumapressãodeseleçãomaior
doquenasfêmeas.
A identificaçãodaidadeemqueseinicia
apuberdade,nomachocaprino,permiteao
produtoradotartécnicasdemanejoreprodu-
tivo,noquedizrespeitoàcastração,àépoca
daseparaçãodosanimaisporsexoeàsele-çãoprecocedeanimaisdestinadosàrepro-
dução,contribuindoparareduzirointervalo
entregeraçõeseconseqüentementepermi-
tindoomelhoramentogenéticomaisrápido
dorebanho.
Umaavaliaçãodamorfologiadostestícu-
los,incluindoasmedidasdecircunferência
escrotal,permiteaoscriadoresaescolhade
melhoresanimaisjovensdestinadosàrepro-
dução,devidoà altacorrelaçãoentreessas
característicascomaproduçãototaldesê-
meneo desempenhoreprodutivo.
Váriossãoospesquisadoresquetêmcon-
centradoseusestudosnodesenvolvimentode
técnicasquepermitamamáximaexploração
do potencialreprodutivodeanimaisdealto
padrãogenético.A sincronizaçãodoestro,a
inseminaçãoartificial(comautilizaçãodesê-
menfresco,resfriadooucongelado)eatrans-
ferênciadeembriões,sãoexemplosdebiotéc-
nicasjáutilizadasemnívelprático.Outraste-
rãosuaaplicabilidadenofuturo,comoéoca-
so dafecundação"in vitro",dasexagem,da
clonagemedatransferênciadegenes.A bio-
técnicadeisolamento,criopreservaçãoeculti-
vodefolículosovarianospré-antrais(FOPA),
recentementedesenvolvida,eatecnologiade
beneficiamentodosêmendiluídoemáguade
coco,tambémpoderãocontribuirdemaneira
significativaparaaconservaçãoemultiplica-
çãodeanimaisdealtalinhagem,bemcomo
aquelesemviadeextinção.
O usodediluentespobresemfosfolipí-
diospodecontribuirparaabiotecnologiade
criopreservaçãodo espermacaprino,supri-
mindoosprocessosdelavagenspelosquaiso
sêmendeverápassarantesdeserdiluídonos
diluentesconvencionais.
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125
Capítulo 8
Transferênciae Criopreservação
de EmbriõesBovinosHorst-DieterReichenbach,MarcosAntônio Lemos de Oliveira,
Paulo Fernandesde Lima,Antônio Santanados SantosFilho,
Joaquim Corrêa de Oliveira Andrade
Introdução
A transferênciadeembriões(TE) éuma
biotécnicaquepermiterecolherembriõesde
umafêmeadoadorae transferi-Iosparafê-
measreceptorascomafinalidadedecomple-
taremoperíododegestação.Apesardospro-
cedimentossofisticadosnecessáriosparasua
implementação,aTE éumabiotécnicamun-
dialmentedifundida.Suaimportânciabásica
paraaproduçãoanimalconsistenapossibili-
dadedeumafêmeaproduzirumnúmerode
descendentesmuitosuperiorao queseria
possívelobterfisiologicamentedurantesua
vidareprodutiva.Alémdeequacionarproble-
masrelativosaquestõesdeordemgenéticae
sanitária,contribuiparaampliaros conhe-
cimentosdefisiologia,patologiaeendocri-
nologiadecorrentesda relaçãoentreem-
brião,orgãosgenitaisinternosesistemaner-
vosocentral.
A TE forneceabasetécnicaparaviabilizar
a implementaçãodebiotécnicasafins,como
aproduçãodeclonesedeanimaistransgêni-
cosoParao melhoramentozootécnico,elaé
um importanteinstrumentoporqueacelera
econferemaiorprecisãonoprocessodese-
leçãoanimal.Alémdisso,aTE podeserem-
pregadaparaobterdescendentesdeanimais
comdistúrbiosreprodutivosadquiridossem
caracterizaçãogenética,impedindo,emalguns
casos,o descarteprecocedefêmeasgene-
ticamentesuperiores.
Estecapítulotempor objetivoprincipal
apresentarosdiferentesmétodose técnicas
empregadasnaTE debovinosdeformapor-
menorizadaedeabordar,paramelhorcom-
preensãodoconteúdotemático,assuntosre-
lativosà fisiologiae ao controlebiotécnico
docicloestraledaovulação,bemcomocon-
cernentesaosprocessosdefecundaçãoede
desenvolvimentoembrionário.Ao término
destecapítuloecomtodososassuntosdiscu-
tidos,espera-seter repassadoinformações
atualizadasquepermitamo leitoradquirir
nãosomenteos conhecimentosespecíficos
daTE embovinos,masdeterproporcionado
umavisãotécnicaconsistentesobreopoten-
cialdeutilizaçãodestabiotécnicaemprolda
melhoriadosrebanhos,especialmentequan-
doutilizadaemconjuntocomasbiotécnicas
afinsaquiapresentadas.
Histórico
A idéiadefazerumafêmeaconceberum
embriãocolhidodeoutradamesmaespécie
ébastanteantigaeoscoelhosforamosani-
127
maisselecionadosporHeape(1890)pararea-
lizaraprimeiratransferência.Naespéciebovi-
na,aprimeiraTE foi realizadaaindaname-
tadedoúltimoséculoporWilletetalo(1951).
Emtermoscomerciais,aTE embovinos
teveinícionosEstadosUnidosdaAmérica
duranteadécadade70.Nessaépoca,osem-
briõesaindaeramcolhidosatravésdelaparo-
tomiamedianasobanestesiageralinalatória,
fatoquelimitavaadifusãodessabiotécnica.
Aindanametadedosanos70enabuscade
alcançarresultadossemelhantesaosobtidos
como métodocirúrgico,técnicosdevários
laboratóriosdesenvolveramométododeco-
lheitanão cirúrgica,masapesardisso, a
transferênciacontinuavasendorealizada
atravésdalaparotomiadoflancosobaneste-
sialocal.Comonessamesmadécada,outros
pesquisadoresviabilizarama colheitae a
transferênciaunicamenteporviatranscervi-
cal,essemétodonãocirúrgicotornou-seum
marconahistóriadaTE embovinosdevido
asuaexeqüibilidadetersidobastantesimpli-
ficada,fatoquedinamizouacomercialização
deembriões.
A criaçãodaSociedadeInternacionalde
Transferênciade Embriões(IETS) no ano
de 1974,emDenver-Colorado/EUA,pro-
porcionougrandedifusãodessabiotécnica
embovinos,especialmenteapartirde 1978
como lançamentodosanaisda IETS que
permitiumaiordivulgaçãoeacessodasino-
vaçõestecnológicasemoutroscontinentes.
A necessidadedemelhoraproveitaraca-
pacidadeprodutivadeanimaisgeneticamente
superioresmotivouospesquisadoresadesen-
volveremmétodosparasuperovularfêmeas
buscandoobterumelevadonúmerodeem-
briõesemummesmocicloestral.Esseméto-
dopermiteumaproveitamentomaisracional
do potencialdeumafêmeaproduzirmuito
maisdescendentesdoqueseriapossívelatra-
vésdosprocessosfisiológicosdereprodução.
Comoo númerodefêmeasreceptorasnem
128
sempreeracompatívelcomaquantidadede
embriõesdisponíveisparatransferência,criou-
seaexpectativadeseconservarosembriões
excedentesparamaximizaraeficiênciadessa
biotécnica,fatoquemotivouo nascimento
do primeiroprodutooriginadode embrião
congelado,segundorelatode Wilmut &
Rowson(1973).
No Brasil,aprimeiratentativadesetrans-
ferirembriõesbovinosdatadoanode1977,
quandoumconvênioexistenteentrea Uni-
versidadeFederaldeSantaMariaeaEscola
de MedicinaVeterináriade Hannoverpro-
porcionouavindadoProfessorJ.Hahn,en-
tãoresponsávelpelostrabalhosdeTE naClí-
nicadeGinecologiaeObstetríciadareferida
escolaalemã.Todavia,somentea partirda
décadade80équeessabiotécnicaembovi-
nosfoirealmentedifundida.O marcoimpor-
tantenoBrasilfoiacriação,em1985,daSo-
ciedadeBrasileiradeTransferênciadeEm-
briões,atualmentedenominadade Socie-
dadeBrasileiradeTecnologiade Embriões
(SBTE), quevemproporcionado,aolongo
dosanos,eventostécnico-científicosvisando
respaldarosprofissionaisdaárea.
Bases Fisiológicas da Transferência
de Embriões
AspectosFisiológicosdo ciclo Estral
Na espéciebovina,aatividadesexualdas
fêmeasteminício quandoalcançama pu-
berdadeeatingemdesenvolvimentocorpo-
ral correspondenteaospadrõesdaraça.Os
bovinos,classificadoscomopoliéstricoscon-
tínuosporexibirematividadesexualdurante
todosos mesesdo ano, quandomantidos
emcondiçõesambientaisadequadasapre-
sentamcicloestralcomduraçãoaproxima-
dade 21 dias,sendoconstituídodasfases
deproestro(3dias),estrooufaseestrogêni-
calproliferativa(:t 18horas),metaestro(2
a3dias)ediestroou faseluteínica/secretó-
ria (:t 14dias).
A fisiologiado cicloestralé complexae
dependedaperfeitainteraçãoentreosistema
nervosocentral(hipotálamoehipófise)eos
órgãosgenitais(úteroeovários).O hipotála-
mo,estruturalocalizadacentralmentenabase
docérebro,possuiagrupamentosneuronais
(núcleos)responsáveispelasecreçãodehor-
môniospeptídicos,osquais,atravésdosaxô-
ruosdosneurôniosoudosistemaporta-hipo-
talâmico-hipofisáriosãocarreados,deforma
pulsátil,atéahipófiseparacontrolaraativida-
dedessaglândula.No casodoseventosrepro-
dutivos,osfatoresliberadoresdegonadotro-
finas(GnRH), ligam-seareceptoresespecífi-
cosnosgonadotrofosdaadeno-hipófisepara
darinícioasÚlteseealiberação,tambémpul-
sátil,doshormôniosdenaturezaglicoprotéi-
ca,denominadoshormôniofolículoestimu-
lante(FSH) ehormônioluteinizante(LH).
AlgunsfatoresintrÚlsecoseextrínsecosin-
fluenciamnocontroledasecreçãodeGnRH.
Intrinsecamente,oshormôniosesteróidesdo
ováriosãoestrógenoeprogesterona,conhe-
cidosporexerceremaçãodestacadanasÚltese
dasneurosecreçõeshipotalâmicasedasgona-
dotrofinasadeno-hipofisárias.A progesterona,
queexerceefeitomoduladorsobreohipotála-
mo,diminuia freqüênciadepulsodeGnRH
atravésdo mecanismoderetroalimentação
negativa,enquantoqueaaçãoestrogênicava-
riadeacordocomaconcentraçãodeproges-
terona.Duranteafaseluteínica,oestrógeno,
emaçãosinérgicacomaprogesterona,depri-
measecreçãodeGnRH, masduranteafase
pré-ovulatóriados folículosovarianos,esse
esteróide,pormeioderetroalimentaçãoposi-
tiva,determinaoaumentodafreqüênciapul-
sátildeGnRH e daondapré-ovulatóriade
LH. Dentreosfatoresextrínsecosqueinter-
feremnasÚltesedeGnRH, oestadonutricio-
naldoanimal,atemperaturaambiente,o fo-
toperíodoconformea regiãogeográfica,a
épocado ano,o manejodo rebanho,situa-
çõesdeestresse,oestímulodaamamentação
emvacasdecorteeosferomôniosmasculi-
nossãoosdemaiorimportância.A nutrição
em conjuntocoma condiçãocorporalde-
sempenhampapelrelevantena secreçãode
GnRH e, por conseguinte,na fisiologiada
reprodução.O estímulodaamamentaçãoem
vacasdecorteresultanaproduçãodeopiói-
des endógenosque inibema secreçãode
GnRH pelosneurônioshipotalâmicos.
A açãodoGnRH sobreaadeno-hipófise
podesertambéminfluenciadapor hormô-
nios específicosproduzidospelosfolículos
ovarianos.Atéo presente,o hormôniomais
interessanteé a inibinaque,seletivamente,
suprimeasecreçãodeFSH seminterferirna
deLH. Por outrolado,a ativinaestimulaa
secreçãodeFSH eo balançoentreessesfa-
torespodedeterminara taxadesecreçãode
FSH.O LH, comoanteriormentecomenta-
do,ésecretadodeformapulsátileafreqüên-
ciadessespulsosé reguladapeloGnRH e,
conseqüentemente,pelasecreçãodeproges-
teronadurantea faseluteínica,pelobalanço
energéticonegativoduranteo pós-partoe
peloestímulodaamamentação.A liberação
deFSH éreguladapeloestrógenoe inibina
(videCapítulo3).Apesardasgonadotrofinas
hipofisáriasatuaremdemodosinérgico,de-
sempenhamfunçõesdiferenciadas.Enquan-
too FSH temafunçãodeatuarsobreospe-
quenosfolículosovarianosestimulandoode-
senvolvimentoatéoestádiodefolículodomi-
nante,o LH atuanofinaldamaturaçãodesse
folículodominanteestimulandoaprodução
de estrógenoe induzindoa ovulação,além
deestimularasecreçãodeprogesteronapelo
corpolúteo.No casodafêmeanãotersido
naturalmenteouartificialmenteinseminada
duranteo estro,o úteronãorecebeo sinal
trofoblásticodo embriãoe emdecorrência
de ser estimuladopelaocitocinasecretada
pelocorpolúteo,liberaaprostaglandinaque
promoveráalisedessecorpolúteo,porvolta
do 17°ou 18°diadociclo,permitindoaocor-
rênciadeum novocicloestral.
129
Superovulação
Logo apóso nascimento,os ováriosde
umafêmeabovinacontêmmilharesdefolícu-
los,entretanto,muitopoucosdesenvolvem,
maturameovulamduranteavidareprodutiva.
Osdemaispermanecememumpoolnoesta-
dodelemrgiae,porummecanismoaindades-
conhecido,sãorecrutadosem grupospara
iniciaro desenvolvimento.Do grupodefolí-
culosqueiniciamaemergênciadaonda,um
delesé selecionado,torna-sedominantee
continuadesenvolvendo,enquantoosoutros
regridemetornam-seatrésicos.Picosnacon-
centraçãodeFSH coincidemcomaemergên-
ciadaondafolicular,enquantoqueomomen-
todadivergênciadataxadecrescimentodos
folículosdominantesesubordinadosencon-
tra-serelacionadocomodecréscimodacon-
centraçãodessehormôniogonadotrófico.
Nos bovinos,o desenvolvimentofolicular
apresentaa particularidadede, na maioria
dosanimais,consistirdeduasoudetrêson-
dasde crescimento,(SantosFilho et aI.,
2001),sendocada ondaformadaporum
grupodefolículoscomdiâmetromaiorou
iguala4 mm.Ressalta-sequeaemergência
daterceiraondafolicularestáassociadacom
umafaseluteínicamaisprolongada.
O aproveitamentomaisracionaldesses
folículosquesetornariamatrésicospodeser
obtidoatravésdasuperovulação.A superovu-
laçãopodeserdefinida,portanto,comoum
métododeestimulardiversosfolículosterciá-
riosdesenvolverematéo estádiodepré-ovu-
lação,comsubseqüenteovulação.O trata-
mentosuperovulatórioobjetivasupriradefi-
ciênciadaconcentraçãode FSH antesque
o folículodominantepromovaa reduçãoda
concentraçãoendógenadessagonadotrofi-
na. Dessemodo,os efeitosda dominância
folicularsãoneutralizados,adivergênciaim-
pedidae o desenvolvimentosimultâneode
váriosfolículoscomcaracterísticasfisiológi-
cassemelhantesdaquelesselecionadospara
ovularem,torna-sepossível.O processode
130
seleçãodofolículodominantenãoestátotal-
menteesclarecido,entretanto,sabe-sequeo
desenvolvimentodessetipodefolículoinibe
o crescimentodossubordinadosdeformas
passivaeativa.A inibiçãopassivaocorreatra-
vésdadiminuiçãodaconcentraçãodeFSH
atéalcançarvaloresincompatíveiscomama-
nutençãodosfolículossubordinadoseaativa
pormeiodasecreçãodesubstânciascapazes
dediminuira sensibilidadedessesfolículos
àaçãodasgonadotrofinas.O recrutamento
defolículosemrespostaaotratamentosupe-
rovulatórioapósaremoçãodofolículodomi-
nante,evidenciaqueapresençadessesfoncu-
los inibea respostaao FSH exógeno(para
maioresdetalhesvideCapítulo3).
Emboraexistamalternativasdeutilização
degonadotrofinasquepromovemasupero-
vulação(gonadotrofinacoriônicaeqüina-
eCG,gonadotrofmadamenopausahumana-
hMG eFSH), aaltavariabilidadederesposta
àsuperovulaçãodecorrentedediversosfato-
res,imprecisãonograudesincroniaovaria-
na,atividadebiológicaedosedagonadotrofi-
nautilizada,idadeeraçada doadora,além
defatoresindividuais,éumaspectoquein-
terfereelimitaaeficiênciadaTE naespécie
bovina.Porisso,outrosfatoresquetambém
exerceminfluênciasobreaTE devemsercui-
dadosamentecontrolados.É importantefri-
sarqueasuperovulaçãodeveseriniciadano
momentodaemergênciada ondafolicular,
sejaespontâneaouinduzida,porqueanimais
comfolículossensíveisaaçãodoFSH, nor-
malmenteapresentammaiorcapacidadede
produzirembriões.Issoéexplicadoemfun-
çãodequenesseperíodo,apresençadeum
folículodominanteinfluenciarianegativamen-
tesobreasuperovulação.Outraconsideração
importanteequemerecedestaqueéquedu-
rantea superovulaçãoocorreumamudança
bruscado perfil hormonaldas doadoras.
Observa-seumaelevaçãodaconcentraçãode
hormônioestrogênicoresponsável,provavel-
mente,pelapresençadefolículosanovulató-
riosepeloaumentodahipermotilidadedotra-
togenitalqueaceleraotransportedasestrutu-
rasembrionáriasparaoambienteuterino,fato
quecomprometea qualidadedosembriões.
Oscomentáriossobreosprotocolosdesupe-
rovulaçãoestãocontidosno itemtratamento
hormonaldasdoadorase receptoras.
Fecundaçãoe DesenvolvimentoEmbrionário
Nestecapítulo,asetapasqueresultamna
fecundaçãodosgametasserãocomentadasde
modosuperficial,tendoemvistaquenoCa-
pítulo10 foi assuntodetalhadamenteabor-
dado.Os espermatozóidesaoseremdeposi-
tadosnotratogenitaldasfêmeasbovinas,se-
jamnavaginaapósamontanaturalounoú-
tero(nacérvice,nocorpoounocornouteri-
no)depoisdaIA, necessitamsertransporta-
dosatéoterçosuperiordooviduto,maispre-
cisamentenaampola,parainteragircomos
oócitosliberadosdosfolículosovarianos.Além
disso,necessitamdeumprévioperíodopara
quemodificaçõesbioquímicase estruturais
lhesconfiramhabilidadede fecundar(ca-
pacitaçãoespermática)osgametasfemininos.
A capacitaçãoespermática,processode
ativaçãoenzimáticaquetornaosespermato-
zóidescapazesdesofrerreaçãoacrossômi-
ca,nãoé espécie-específicoporqueoócitos
de umaespéciepodemserfecundadosem
outra.A capacitaçãoconsistenaremoçãode
substânciasabsorvidasou incorporadasà
membranaplasmáticado espermatozóide
contidasnoplasmaseminal(proteínasegli-
coproteínas,bemcomoespermina),no au-
mentogradualdaentradadecálcioparain-
crementara atividadeflagelar(importante
parao transporteespermáticodo istmoaté
ampolado ovidutoe paraa penetraçãodo
espermatozóidenazonapelúcida-ZP)e na
reaçãoacrossômicaqueocorreapósoesper-
matozóideentraremcontatocomaZP.
Em conseqüênciadasmodificaçõesque
os espermatozóidesexperimentamno trato
genitaldafêmeabovina,a deposiçãodo sê-
menanteriormenteaoeventodaovulaçãoé
defundamentalimportânciaparaosíndices
defecundaçãoseremmaximizados.Conside-
randoqueosespermatozóides,aocontrário
dosoócitos(20a24horas),preservamaca-
pacidadefecundantenotratogenitalfeminino
porperíodomaislongo(24a48horas),que
asfêmeasovulam10a 12horasapósotérmi-
nodoestro(fasedemetaestro)equeosoóci-
tos,naetapademetáfase11,devemserfecun-
dadosapós6horasdaovulação,érecomen-
dadoqueainseminação(naturalouartificial)
sejarealizadaantesdaovulaçãoparaqueos
espermatozóidescompletemo processoda
capacitaçãoantesdachegadadooócito.
Ao alcançaremooócitonaampoladoovi-
duto,osespermatozóidesencontramacoro-
naradiataea ZP quesãobarreirascapazes
deimpedirapenetraçãonooócito.Nessemo-
mento,váriosespermatozóidescircundama
coronaradiatana tentativadepenetrarno
oócito e essapressãoestimulaa fusãoda
membranaplasmáticacoma membranaex-
ternadoacrossoma.Nospontosdefusãodas
membranassurgemorifíciosporondesãoli-
beradasasenzimasdo acrossomaresponsá-
veispelapenetraçãodoespermatozóide.O co-
nhecimentoatualsugerequeasenzimascon-
tidasnoacrossomaou aderidasàsuamem-
branaatuamsinergicamenteduranteapene-
traçãonooócito,bemcomoapontaahipera-
tivaçãoespermáticacomofundamentalnesse
processo.ApósafUturadaZP eapenetração
doespermatozóide,elaéprontamenteresta-
belecida,impedindoapolispermia.
No espaçoperivitelino,afusãodoesper-
matozóidecoma membranaplasmáticado
oócitoresultanasuaativaçãoparareiniciar
ameioseeliberaro segundocorpúsculopo-
lar.A partirdessemomento,ooócitofecun-
dadoédenominadodezigotoqueémorfolo-
gicamentecaracterizadopelaspresençasdos
pronúcleosmasculinoefeminino,sendoo fe-
mininoformadoaotérminodamaturaçãonu-cleareomasculinoresultantedadesconden-
131
saçãodo espermatozóide.Essespronúcleos
sãohaplóidesporpossuíremmetadedoscro-
mossomospresentesnasfuturascélulasdi-
plóidesdoembrião.Na etapafinaldafecun-
dação,ocorreaproximaçãodospronúcleos,
desintegraçãodasmembranasnuclearese
combinaçãodoscromossomos,eventoconhe-
cidoporsingamia.Em seguida,têminícioas
divisõesmitóticas(clivagem)comconseqüen-
tedesenvolvimentoembrionário,ressaltando-
sequetodasascélulasembrionáriassãodi-
plóides,denominadasdeblastômeros.
As clivagenscelularessão síncronase
obedecemaplanospré-estabelecidos,detal
modoqueapóso términodecadaclivagem
ocorreumaduplicaçãodonúmerodeblastô-
meros.Todavia,durantea primeirasemana
dodesenvolvimentonãoocorreaumentodo
diâmetroembrionário,umavezqueovolume
dosblastômerosdiminui,praticamentepela
metadeapósasclivagense,aomesmotem-
po,ocorreaumentogradualdaforçadecoe-
sãointercelular.Até o estádioembrionário
de16células,essaforçadecoesãoaindanão
é intensa,permitindoumaboa separação
mecânicadecadablastômeroemexperimen-
toscomembriõesnessafasededesenvolvi-
mento.Nas próximasclivagens,a forçade
coesãointercelular,poraumentarsignificati-
vamente,contribuiparao processodecom-
pactaçãoembrionáriacom a conseqüente
formaçãodamórulainicial.Esseestádioem-
brionárioé constituídode 13a maisde32
blastômeros,sendonecessários4 a 5 dias
parasuaformação.À medidaqueocorrem
divisõescelularessubseqüentes,a coesão
intercelularéintensificada,tomandoamassa
celularaindamaiscompactaparaoriginaro
estádiodemórulacompacta.Nestafasede
desenvolvimentodo embrião,o isolamento
mecânicodosblastômerostoma-seextrema-
mentedifícilemdecorrênciadaintensaforça
decoesãointercelular.
Coma contínuadivisãoeespecialização
dascélulasdamórulacompactada,temori-
132
gemoblastocistoinicial,oqualéconstituído
por doistiposcelularesdistintos.As células
poliédricasdoembrioblastosãoresponsáveis
pelaformaçãodo futuro feto e as células
extremamenteplanasdotrofoblastoorigina-
rãoapartefetaldaplacentadaespéciebovi-
na.Outracaracterísticaimportantedoblas-
tocistoinicialéa formaçãogradualdeuma
cavidadedenominadade blastocele.O de-
senvolvimentodessablastoceleemconjunto
comaproliferaçãodosblastômerosdetermi-
namo aumentodo diâmetroembrionárioe
a diminuiçãodo espaçoperivitelino.Como
conseqüênciadesuaexpansãoedevidoasua
elasticidade,a ZP toma-sedelgadae sofre
aumentodatensãosuperficial,culminando
como seurompimentoeeclosãodamassa
celularembrionária.Nesseestádiodedesen-
volvimento,oembriãoédenominadoinicial-
mentedeblastocistoemeclosãoeaoserlibe-
radoda ZP rompidapassaa ser chamado
deblastocistoeclodido.A expansãoeaeclo-
são embrionáriapermitemuma avaliação
morfológicasimplesdavitalidadeedaviabi-
lidadedeembriõesemcultivo.Todavia,devi-
doàproteçãomecânicaebiológicaoferecida
pelaZP intacta,recomenda-se,paraarotina
daTE embovinos,autilizaçãodeembriões
emestádiosqueantecedama eclosãoem-
brionária.Apósaeclosão,oembriãoemcres-
cimentocontínuoédenominadoblastocisto
eclodido/expandido,oqualinicialmentepos-
suiumaformaesféricaepor aumentarseu
tamanhoem direçãolongitudinal,assume
umaformatubular,processoesseresultante
damultiplicaçãodascélulasdo trofoblasto.
Nessemomentopode-se,comcertafacilida-
de, observára massacompactae bemcir-
cunscritadeembrioblastosqueselocalizam,
aproximadamente,nocentrodotubotrofo-
blástico.As principaiscaracterísticasdode-
senvolvimentoembrionárioencontram-se
resumidosnatabela8.1ena figura8.1.
Código2
2-células
(dia2)
Código2
4-células
(dia3)
Código3
Mórulainicial
(dia5- 6)
Código4
Mórula
(dia6)
Código6
Blastocisto
(dia7- 8)
Código8
Blastocisto
eclodido
(dia9)
Código7
Blastocisto
expandido
(dia8- 9)
Pró-núcleos
espermatozóide
Código5
Blastocistoinicial
(dia7)
Código9
Blastocistoeclodidol
expandido
(dia9- 10)
Figura 8.1. Representaçãoesquemáticadosestádiosdedesenvolvimentoembrionárioembovinos,considerando-seos
códigos recomendados pela IETS (1998)
133
Definições
Transferênciade Embriões
O termoTE englobao conjuntodeativi-
dadesnecessáriasparaaretiradadeembriões
do úterodefêmeasdoadorase a posterior
deposiçãodessesembriõesno úterodefê-
measdenominadasreceptoras(Figura8.2).
Principais etapasdaTE embovinos:
. Seleçãozootécnicadasdoadoraseava-
liaçãoclínico-ginecológicadasdoadoras
e dasreceptoras;
134
. Tratamentohormonalparasuperovular
asdoadorasesincronizaro cicloestral
dasdoadorase dasreceptoras;
. Observaçãodoestrodasdoadorase das
receptorasquantoaregularidadee in-
tensidade;
. IA dasdoadoras;
. Colheitae tratamentodosembriões;
Define-setratamentodeembriõescomo
sendoqualquertipodemanipulaçãoexecuta-
danoestádioinicialdodesenvolvimentoem-
Tabela8.1.Principaiscaracterísticasmorfológicasdeembriõesbovinos.
Estádio Códigoda Númerode Diâmetro
IETS células (mm) CaracterísTIcasprincipais
Oócito 1 1 0,14-0,17 Esférico. Restos de célulos do granuloso podem estar presentes.
ligoto 1 0,14-0,17 Esférico,semelhantea umoócitonamicroscopiacomum,alémdeapresentar
ospronúcleoseoscorpúsculospolares.
2a12células 2 2-12 0,14-0,17 Blastâmerosesféricasouovais.Aforçodecoesãoe oscontatosintercelulo-
ressãofracos,masapresentamexcelentevisuolizaçõodecadablastâmero.
Mórulo Estádiodecompactaçãogradual.Nodecorrerdodesenvolvimento,o forço
decoesãoe oscontatosintercelularesvãosendointensificados.
Móruloinicial 3 13:t-32 0,14-0,17 Iníciodacompoctoção.Blostômerosarredondados,boovisuolizoçãode
cadoblostômero.
MórulaCompacta 4 32:t64 0,14-0,17 Términodacompadação.Aforçadecaesõoeoscontatosintercelulares
sãobemintensos,apresentamboavisuolizoçõodosblostômeros
periféricos,osuperfíciedomossaembrionáriaapresentoelevoções
convexas,típicose semelhantesàsdeumaamora.
Blostocisto Diferenciaçãocelularemembrioblastosetrofoblastas.Formaçãoda
blastocele.Volumevariável.Atenção:devidoaumadiminuição
passageirodovolumedoblostocele,osblostocistospodemestar
temporariamentecolabados.
BlastocistoInicial 5 64:t130 0,14-0,17 Semelhonieomórulo,todavia,compequenoblostocele,geralmente
excêntricaecomformatoachatado.Espaçoperivitelinopresente.
Blastocisto 6 130:t 200 0,14-0,17 BlastoceleníTIda,espaçoperivitelinopresente.Embrioblastofacilmente
identificável.
BlostocistoExpandido 7 +200 0,18-0,22 BlastoceleníTIdo,espaçoperiveTIlinonãomaisvisível.Embrioblostoescuro
edefácilidenTIficação.TrafoblostosniTIdamenteachatados.
BlastacistaEclodido 8 +200:t800 0,18-0,22 Farmoesférica.AusênciodoZP(rompida).Embrioblastoetrofoblastos
níTIdos.Blastocelepossuiumgrandevolume.
Blostocisto 9 +200:t800 0,20-0,80 Fonmatubulor.Ausênciodozr Fácildiferenciaçãomorfológicadoscélulas
EclodidojExpandido comummicroscópio.Massocompactadeembrioblostos,bemníTIdano
centrodotubotrofoblástico.
DiaO
o
o
o
Dia 11
Dia 14
Dia 16
DiaO
o
o
o
Dia 7
-
v.t
VI
Doadora
Transferênciadeembriões
[Jk".~""'. "'C""" ..;.i...~"L'...,:ccL.L;::;;~'0'~j;,.~;...,11[j]I ~
Estro
( , I I~ Sincronização de cio
" .
{
, Aplicação única de PMSG
Superovulação ; ou 8 aplicações de FSH
Luteólise de manhãe de tarde
(ProstaglandinaFa) . emintervalosde12horas
~~~~inaçãoartificial ~0T\
(2-3inseminações
emintervalosde8-12horas)
Colheita e transferêncian
dos embriões IL\-'
Figuro 8.2. Principaisetapas do TE em bovinos.
Receptaras
((~
~if
I::",'.~~:::JZJ~ ~~
W
((~
~~
~~~
brionárionoexteriordoorganismomaterno
necessáriaparaodesenvolvimentonolabora-
tório(desenvolvimentoinvitro).
Principaistratamentosembrionários:.Avaliaçãodo desenvolvimentoedavita-
lidadedosembriõesduranteo cultivo
ouco-cultivoinvitro;.Preservaçãodosembriõestantoporpe-
ríodoscurtosdecultivoquantoporperío-
dosmaisprolongadosdepreservação,
sejaporresfriamentoouporcongelação
emnitrogêniolíquido (N2) a -196°C
(criopreservação);
. Todotipoderetiradadecélulasembrio-
nárias,isoladasouemgrupos,tantopara
diagnósticospré-implantativos(pré-de-terminaçãodosexo)quantoparaapro-
duçãodeanimaisgeneticamenteidênti-
cos,sejapelométododabipartiçãoem-
brionária(clonagemporbipartição)ou
pelométododatransferênciadenúcleos
celulares(clonagemportransferênciade
núcleosdecélulasembrionárias).
.. Deposiçãodosembriõescolhidose
tratadosno úterodasreceptorase
.. Diagnósticodegestaçãonasreceptoras.
Biotécnicas Afins da TE
Denominam-sebiotécnicasrelacionadasà
TE, astécnicasembiologiaereproduçãoani-
malquesãoexecutadascomestruturasem-
brionáriascolhidasde doadorasou obtidas
atravésdabiotécnicadeproduçãoinvitroque
envolveumoumaistratamentosembrionários
eatransferênciadasmesmasparareceptoras
objetivandoaobtençãodedescendentescom
característicasgenéticasdesejadas.
Define-secomoproduçãoinvitrodeem-
briões,abiotécnicaqueproduzembriõesem
condiçõesartificiais.Osoócitossãosubmeti-
dosàmaturaçãoefecundaçãoeosembriões
sãocultivadosatéestádiosdedesenvolvimen-
toembrionáriopassíveisdetransferênciapa-
raasreceptoras.A produçãoin vitrodeem-
briõesé assuntotratadono Capítulo10.
136
As principaisbiotécnicasassociadasàTE
debovinosencontram-seresumidasnafigura
8.3.A clonagemportransferênciadenúcleos,
apunçãofoliculartransvaginal,aproduçãoin
vitrodeembriõese a produçãodeanimais
transgênicossãoassuntostratadosemcapítu-
losespecíficos.
Criopreservaçãode Embriões
A criopreservaçãode embriõesé uma
técnicadeconservaçãoemN2 quepropicia
aviabilidadedosembriõesporlongoperíodo.
O termocongelaçãoéadotadoparaastécni-
casondeocorrecristalização(formaçãode
cristaisde gelo)parcialou totaldosmeios
decriopreservação.Poroutrolado,o termo
vitrificaçãoéempregadoparaastécnicasem
queosmeiosdecriopreservaçãosofremuma
passagemdiretado estadolíquidoparaum
estadovitrificadoe amorfo,semquehaja
umacristalizaçãodomeio.Essapossibilidade
édecorrentedassoluçõescrioprotetorasse-
remdealtograudeviscosidadeedarápida
velocidadedecongelaçãoporimersãodireta
dessassoluçõesnoN2,apartirdatemperatu-
ra ambiente.
Principaisetapasda criopreservaçãode
embriõesbovinossão:
.. Seleçãomorfológicadosembriõesvisan-
do identificaraquelesque,potencial-
mente,deverãosobreviveraosprocessos
de congelaçãoou devitrificaçãoe de
descongelação;
..Adiçãodoscrioprotetores,envasamen-
todosembriõesemrecipientesadequa-
dos,geralmentepalhetas,eanotaçãodos
dadosreferentesaoembriãosobreasu-
perfíciedapalhetaou sobrea peçaou
pontadeplásticoqueobliteraapalheta
hermeticamente;
.. Exposiçãodessaspalhetasàscurvasde
congelaçãoparaumadiminuiçãogra-
dualdatemperaturaouquedaimediata
datemperaturanoprocessodevitrifica-
ção.As curvasdecongelaçãopodem
serobtidascomequipamentoapropria-
do,geralmenteaparelhosdecongelação
computadorizadosquepermitemcon-
tro1arareduçãodatemperatura.Avitri-
ficaçãoocorreporimersãodiretadas
palhetasnoN2semnecessidadedecon-
troledatemperatura;
. Imersãodaspalhetascontendoosem-
briõesnoN2aofinaldoperíododecon-
gelaçãoprogramado.A temperaturano
momentodaimersãodaspalhetasvaria
geralmenteentre-28°C e-35°C e
. Armazenamentodaspalhetasemraques
pré-congeladas,dispostasembotijãode
N2.
Figura 8.3. TE e biotécnicasassociadas(modificadode NIEMANN & MEINECKE, 19931.
Utilizaçãode Embriõesparao Diagnóstico
Pré-Implantativo(DPI)
O diagnósticopré-implantativo(DPI) é
abiotécnicaquetornapossívelumaanálise
genéticade célulasdeembriõesqueseen-
contramnosestádiosiniciaisdodesenvolvi-
mento,antesdasuatransferênciaeimplanta-
çãonoúterodasreceptoras.Condiçãofun-
damentalparaaexecuçãodoDPI éaretirada
depelomenosumaou,preferencialmente,de
algumascélulasdoembriãoduranteafasede
cultivoin vitrocomauxíliodeequipamento
demicromanipulação(Figura8.4).O exem-
ploclássicodeDPI emembriõesbovinoséa
análisedoscromossomassexuais,visandoa
pré-determinaçãodosexoeaverificação,an-
137
, t ,Transferência+- de, Embriões ,
t Bipartiçãoi4....".....""..r;;."", embrionária
t),
Pipeta
de
Fixação
doembrião1)Penetração
BlastômeroPipeta-/ de~ '-- InJeçao
2)Retirada ~
"
,
- (,
Figura 8.4. Equipamentonecessárioporao DPIemembriõesmostrandoa retiradade umblastõmeroatravésda ZP
com auxílio de pipetasde vidro (esquemático).
tesdatransferênciaparareceptoras,seoem-
briãoéportadordealgumaanomaliagenéti-
caou deaberraçõescromossômica.
Principaisetapasdo DPI:
. Seleçãomorfológicadosembriõesvi-
sandoidentificaraquelesque,poten-
cialmente,sobreviverãoaoprocessode
retiradadealgumasdesuascélulas;
. Fixaçãodoembriãoeretiradamecânica
dascélulassobummicroscópiocomau-
xI1iodeeq~ipamentodemicromanipu-
laçãoe
. Análisedascélulasobtidas(entreo pe-
ríododeretiradadascélulaseobtenção
dosresultadoslaboratoriais,osembriões
permanecememcultivoinvitro)emde-
corrênciadequesomenteos embriões
livresdeanomaliasou comascaracte-
rísticasgenéticasdesejadasserãoposte-
riormentetransferidosparareceptoras.
138
Bipartiçõo de Embriões
A bipartiçãodeembriõesé abiotécnica
atravésdaqual,comequipamentodemicro-
manipulaçãoapropriado,umembriãoemes-
tádioinicialdedesenvolvimentoémecanica-
mentedividido,preferencialmente,emduas
partespraticamenteiguais.Abipartiçãoem-
brionáriaéaformamaissimplesparaprodu-
zirdonesanimais(Figura8.5).
Denomina-sedone,umconjuntodein-
divíduosgeneticamenteiguais.O menor
donepossívelécompostodedoisgêmeos
idênticos.Essesgêmeospodemocorrerna
naturezadeformaespontâneaou serem
produzidosemlaboratóriocomauxI1iodas
técnicasdabipartiçãodeembriõesouainda
atravésdatransferênciadenúcleoscelula-
res,quepermiteaproduçãodedonescom
ummaiornúmerodeindivíduosidênticos
(videCapítulo13).
~/ -
Biparti2ãi~
.
"..
"
,.,.
,
.,."
.
..,
'
,
'
"e~'L-.. "
Metadesembrionárias
[;
Figura8.5. Bipartiçãoembrionária(esquemático)e umgrupo de paresde gêmeos idênticosobtidosapós a bipartição
de embriõesadquiridos de uma única colheita de uma doadora da raça Fleckvieh
Principaisetapasdatécnicadebipartição
embrionária:
. Seleçãomorfológicadosembriõesvi-
sandoidentificaraquelesque,poten-
cialmente,sobreviverãoaoprocessode
bipartição;
. Fixaçãodoembriãoebipartiçãosobmi-
croscópiocomauxíliodeequipamento
demicromanipulaçãoe
. Transferênciaimediatadasmetades
embrionáriasparareceptoraspodendo-
se,antesdatransferência,recolocarca-
dametadeembrionárianointeriordaZP
comafmalidadedefornecerumamaior
proteçãomecânicaàsmetadesembrio-
nárias.Alémdissoedispondodeboas
condiçõeslaboratoriais,pode-se,opta-
tivamente,cultivarin vitroas metades
obtidasporalgumashorasobjetivando
uma melhoravaliaçãoda viabilidade
embrionáriaantesdatransferência.
Importância da Transferência
de Embriões
A TE ofereceumasériedevantagenspara
aseleçãozootécnicacomconseqüentereflexo
sobreaproduçãoanimal,existindo,porisso,
umasériedeaplicaçõesdeimportânciazoo-
técnica,biotécnicaecomercial(Figura8.6).
Controleda Transmissãode Doenças
Infecto-Contagiosas
A TE permiteaintroduçãodematerialge-
néticonosplantéisdealtovalorzootécnicoe
comercialsemoferecermaiorriscodeconta-
minaçãodorebanhoporenfermidadesinfec-
to-contagiosas,quandocomparadacomoris-
co impostopelaaquisiçãode animais.Do
pontodevistadobemestaranimal,aadoção
dessabiotécnicapossibilitadiminuiro trans-
portedeanimais,evitandoquesejamexpos-
tosa possíveissituaçõesdeestressedurante
o seudeslocamentopor grandesdistâncias,
139
j)fJ;J f/fW:. I. Diagnóstico
~-. pré-implantativo(DPI),2.Cultivoinvitro,
3.Bipartiçãoembrionária
paraa
produçãode
gêmeos J
idênticos,
),
Figura8.6 - Importânciazootécnica,biotécnicae comercialda TE.
bemcomoqueessacondiçãodeestresseatue
sobreo sistemaimunológicodos animais,
tomando-osmaissusceptíveisaosefeitosdos
agentesinfecciososqueestão,eventualmen-
te,disseminadosnosrebanhosdedestino.
Poroutrolado,asmedidaspreventivasde
higiene (limpezae esterilização)com os
equipamentos,com os meiosde cultivoe
comassoluçõescrioprotetorasutilizadosno
140
manuseiodosembriõesdevemserrigorosa-
menteimplementadas,conformerecomen-daçãodaIETS, paraevitaradisseminação
dedoençasinfecciosasentrerebanhosou
paísesatravésdaprópriaTE. No comércio
comembriões,sejanacionalouinternacio-
nal,somentedevemseradquiridosouven-
didosembriõescomZP intactaemdecor-
rênciadapossibilidadedessaestruturacon~
feririmunidadecontraamaioriadosagen-
tesinfecciosos,viraisoubacterianos.É im-
portanteressaltarqueosembriõesdevemser
tratadosdeacordocomoprotocolodema-
nuseiosanitáriodaIETS, noqualestáin-
cluídotratamentodedescontaminaçãoda
superfíciedaZP.ApesardessaZPservirtanto
debarreiramecânicaquantofisiológica,
sabe-sequealgunspatógenos,mesmonão
penetrandoatravésdaZp,podemestarfir-
mementeaderidosàsuasuperfícieexterna.
Pararemoverou inativara maioriadesses
agentespatógenos,osembriõessãoinicial-
mentesubmetidosa diversaslavagensem
meiodecultivo.Emseguida,osembriõessão
tratadosemmeiocontendotripsina,haven-
doanecessidadedelavagensposterioresem
meiodeculturasemessaenzimavisandoa
suaneutralização.
A tripsinaéumaenzimaeficazparainati-
var vírusenvelopados,comoos agentesda
.rinotraqueíteinfecciosabovina,todavia,éde
menoreficiêncianocontrolededoençascau-
sadaspor vírusnãoenvelopados,comoos
agentesdapestesuínaafricana(DNA vírus)
edadoençavesiculardossuínos(RNAvírus).
No manualdaIETS encontra-seumresumo
dasprincipaisenfermidadesinfecciosaspara
asquaisháum riscodetransmissãoatravés
daTE. Essasenfermidades,classificadasem
4 categoriasdeinteresseparaa TE debovi-
nos,encontram-senatabela8.2.
Tabela 8.2. ClassificaçãodasdaençasinfectO1:ontagiasasde bavinasem categoriasconformeo riscode transmissãoatravésda TE (Manualda
IET5, 3'edição,1998).
Categoria Critérios de Classificoção
Existe suficiente evidência que o risco de transmissão
é desprezível, desde que a manipulação e o
tratamento sanitório dos embriões sejam adequodos.
2 Existe evidêncio substancial que o risco de transmissão é
desprezível, desde que a manipulaçõo e o tratamento
sanitório dos embriões sejam adequados.
Todavia, os dados disponíveis são ainda insuficientes
poro uma conclusõo definitiva.
Existe evidência preliminar que o risco de transmissão é
desprezível, desde que a manipulação e o tratamento
sonitório dos embriões sejam adequodos. Todavia, são
necessáriosdados adicionais tanto invitroquantoinvivo
para consubstanciar os resultadasexistentes.
Enfermidades ou agentes infecciosossobre os quais
foramrealizadosinvestigaçõespreliminaresou
esses trabalhos estõo em andamento.
3
4
EnfermidadeouAgenteInfeccioso
leucosebovinaenzoótico
Febreaftoso
Bluetongue(línguaazul)
Brucellaabortus
Rinotraqueíteinfecciosabovina
Nãohánenhumaenfermidadeouagenteinfeccioso
parabovinosnessacotegoria.
Pestebovina
Diarréio bovina a vírus
Haemophilussomnus
Ak.aoonevirus
Estomatitevesicular
Chlamydiapsittaci
Ureaplosmo - Mycoplasma spp
Enterovírus
Herpesvírusbovino-4
Mycobacterium paratuberculosis
Vírus da parainfluenza -3
Agente da encefalopatia
Espongiforme bovina
141
Natentativadeimpediratransmissãode
agentesinfecciosos,aIETS recomendalavar
osembriõescomZP intacta,pelomenos,10
vezesantesde qualquerprocedimentode
criopreservação,manipulaçãooudetransfe-
rência.Duranteaslavagens,éimportanteve-
rificarquecadabanhosubseqüentedeveper-
mitirumfatordediluiçãodaordemde1:100
emrelaçãoaobanhoprecedente.Outrame-
didapreventivarecomendadaéa adiçãode
antibióticosdelargoespectroaosmeiosde
colheita,cultivo,criopreservaçãoe transfe-
rência.O sorosangüíneoutilizadonosmeios
decultivodeveserprocedentederebanhos
commanejosanitárioconhecidoou serad-
quiridode laboratórioidôneo.Alémdisso,
osequipamentoseinstrumentosnãodescar-
táveis,utilizadosnoestábulodecolheitaeto-
domaterialdelaboratóriodevemseradequa-
damenteesterilizados.
MelhoramentoZootécnicoe ProduçãoAnimal
A TE éumabiotécnicadegrandepoten-
cialparaaseleçãoeaproliferaçãodeanimais
geneticamentesuperiores.Em bovinos,dos
aproximadamente200.000oócitosprimários
presentesnosováriosdeumafêmeanomo-
mentodeseunascimento,muitopoucosirão,
por viafisiológicae reprodutivanatural,re-
sultarnumacr.ia,principalmentedevidoali-
mitaçõesdecaráterbiológico(intervaloentre
partosprolongado,gestaçãosimples,rara-
mentegemelar),ambiental(enfermidadesdas
articulações,doscascosedo úbere,alémde
disfunçõesdo metabolismoe degenerações
hepáticas)eeconômico(nívelequalidadeda
produção).
Nosrebanhosleiteiros,onúmerodedes-
cendentesé muitopequenoemvirtudedo
descarteprecocedeanimais.Na maioriados
paíseseuropeussãoobtidos4a6descenden-
tesporvacanossistemasintensivosdepro-
duçãodeleite.O desenvolvimentodométo-
dodesuperovulaçãoeoaprimoramentodas
142
técnicasde colheitae de transferênciatêm
proporcionado,numperíodorelativamente
curto(1 a 3 anos),significativoaumentoda
relaçãofêmea/descendente.Existeapossibili-
dadedonúmerodecriasporfêmeaser3a5
vezesmaiordoqueaverificadapormeioda
reproduçãonatural,ressaltando-seque,emal-
gunscasos,essarelaçãopodeseraté8vezes
maior.É precisoregistrarqueanteriormente
àTE, aúnicapossibilidadedeaumentarartifi-
cialmenteonúmerodedescendenteserautili-
zarosêmendeumreprodutorgeneticamente
superioratravésdaIA.Apósodomíniodabio-
técnicadeTE, a utilizaçãoracionalizadado
potencialfemininoaumentouconsideravel-
mentearelaçãofêmea/descendentenospro-
gramasdemelhoramentoanimal.
Alémdemaximizarautilizaçãodopoten-
cialgenéticodasfêmeas,aTE possibilitauma
reduçãodointervaloentregerações,redução
essaquepodeserobtidaatravésdaprodução
de, pelomenos,um descendentefeminino
comembriõesdacolheitadenovilhasprove-
nientesdeacasalamentosselecionados.Após
umbomresultadodecolheitaetransferência,
essasnovilhaspodemserinseminadasegerar
asuaprópriacria.Atravésdoaumentodave-
locidadedeseleção,atécnicapermitequede-
terminadosobjetivosdosprogramasdeme-
lhoramentoanimalsejamatingidoscommaior
eficiência.A integraçãodaTE comprogramas
convencionaisdemelhoramento,alémdepro-
porcionartaxadereproduçãomaiselevada,
permitequeosobjetivosdessesprogramasse-
jamatingidoscommaiorvelocidade.Segundo
Brem(1997),oaumentodoíndicereproduti-
vodecorrentedaTE possibilita:
. Seleçãomorfológicadosembriõesvi-
sandoidentificaraquelesque,poten-
cialmente,sobreviverãoaoprocessode
bipartição;. Aceleraromelhoramentoanimalinten-
sificandoaseleçãodasmãesdostouros
utilizadosparaareprodução,tantoem
rebanhosdeleitequantodecorte;
. Aceleraro melhoramentoanimalem
sistemasfechadosdecriação,tantopa-
rarebanhosdeleitequantodecorte;
. Aumentaraeficiênciaemprogramasde
núcleosdemelhoramentoanimal;
. Proliferarrapidamenteosanimaisde
raçasexóticaseosanimaiscommuta-
çõespositivasraras;
. Aumentarataxadegêmeos;
. Melhoraraspossibilidadesdeexecução
dosprogramasdecruzamento,tantoem
rebanhosdeleitequantodecorte;
. Realizar,commaiorsegurançaerepre-
sentatividade,ostestesdeprogêniecom
asfêmeasemelhoraraavaliaçãozoo-
técnicadedeterminadasfamíliasporin-
termédiodetestescomirmãos;
. Reduziro intervaloentregerações;
. Maximizaradeterminaçãoeocontrole
dosexo;
. Calcularestimativamenteos efeitos
maternos;
. Simplificaraimportaçãoeexportação
dematerialgenético;
. Oferecercondiçõesbásicasenecessárias
paraodesenvolvimentoeparaaexecu-
çãodebiotécnicasassociadasàTE.
Paraamaioriadasraçasdeleiteexistem
programasconvencionaisdemelhoramento
animal,nosquaisa IA éaúnicabiotécnica
utilizada.Nessesprogramas,asIA ocorrem
exclusivamentecomsêmendetourosprove-
nientesdeacasalamentosplanejados,sendo
quetodos,anteriormentealiberaçãodosê-
menparausonaIA,sãosubmetidosaseleção
emetapascomduraçãomédiade5a6anos.
A associaçãoentreaIAeaTE podeacelerar
aexecuçãodessesprogramasemelhorarsua
eficiência,cujapossibilidadedeintensifica-
çãoévariávelconformeosresultadosdeme-
lhoramentoatéentãoobtidos.Quantomaior
a eficiênciado programaconvencionalde
melhoramento,menorseráa possibilidade
dejustificaressaassociação,todavia,apesar
doscustosadicionaisqueaTE proporciona,
devidoseraindaumabiotécnicadispendiosa,suaintroduçãonessetipo deprogramade
melhoramentoébenéficaemtermoseconô-
micos.A principalvantagemzootécnicade
aliarambasbiotécnicasconsistenapossibili-
dadedereduzirsignificativamenteonúmero
de matrizesparaprocriaremtouros,sendo
necessárioparatal,obterummaiornúmero
dedescentesparacadamãeselecionadacom
auxíliodaTE. Esseprocedimento,alémde
contribuirparaintensificaroprocessodese-
leçãogenética,permitereduziro intervalo
entregerações.Em programasdemelhora-
mentoanimalquevisamaseleçãodetouros
paraousonaIA,busca-seobter,dasmelho-
resmatrizes,onascimentodemachosdeex-
celentepotencialgenéticoporintermédiode
acasalamentosselecionados.Todavia,apro-
babilidadedessamatrizgerarummachopara
o programaé semprede 50%.No casode
nascerumafêmea,o retardoparaseuapro-
veitamentono programaseriade,no míni-
mo, 12meses,tempomédionecessáriopara
queelavenhaparirmaisumavez.ComaTE,
apossibilidadedeseobter,numcurtoespaço
detempo,onascimentodeváriosmachosde
umamatrizselecionadaémuitogrande.Por
isso,éumatécnicadegrandeinteressepara
programasdemelhoramentoanimalporper-
mitirumadiminuiçãosignificativado inter-
valoentregeraçõese,porconseguinte,acele-
rar o processodeseleção.
O melhoramentozootécnicoderaçaslei-
teirasquepodeserimplementadoatravésde
programasconvencionaisintroduzindoaTE,
variade 5% a 19%.Pararaçasde corte,a
taxademelhoramentopodeserdeaté33%
eparaasdeaptidãomistavariaentre5%e
14%.Essescálculosforamefetuadospordi-
ferentesautorescomo respaldodemodelos
estatísticosexperimentais,sendoqueos re-
sultadosvariam,principalmente,deacordo
comosresultadosesperadosdacolheitaeda
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