Buscar

Produção in vitro de embriões bovinos

Prévia do material em texto

mentodessesmecanismosporpermitirauti-
lizaçãoda própriaespécieestudadacomo
modeloexperimental.Adicionalmente,ela
temrespaldadoodesenvolvimentodebiotéc-
nicascomoclonagempor transferêncianu-
clear,transgênese,sexagemdeespermato-
zóideseembriões,preservaçãodeoócitose
embriões,alémdaMOIFOPA.
Alémdaaplicabilidadenapesquisa,aPIV
temsidotambémempregadaem situações
especiaisde infertilidadehumanae animal
com enfoquesbastant;diferenciados.Na
produçãoanimal,particularmentenosbovi-
nos,autilizaçãodaPIV aindaélimitadaem
funçãodainconsistênciadosresultadosrefe-
rentesàstaxasequalidadedemórulaseblas-
tocistos,docustoinicialparaconstruçãoda
jnfra-estruturaedo tempoconsumidopara
executara rotinadeproduçãodeembriões
quevaidesdeapunçãofolicularin vivoaté
o desenvolvimentoin vitrodeembriões.
Principais Etapas da Produção
;n v;fro de Embriões
ColheitadeOócitos
Os oócitosbovinospodemser obtidos
in vitroa partirdepunçãofolicular(Figura
10.1)ou dissecçãofolicular(quandoo nú-
merodeovárioséreduzido),emováriospro-
venientesdeabatedourosou,invivo,porla-
parotomiaoulaparoscopiaviaflancoeainda
porlaparoscopiaouultra-sonografiaviatrans-
vaginal(Figura10.2).A colheitain vitrode
oócitosprovenientesdeabatedourosé,geral-
mente,efetuadapormeiodepunçãofolicular
comagulhaacopladaaumaseringaoubom-
badevácuoe,invivo,atravésdeumaagulha
acopladaaumabombadevácuo,guiadapor
ultra-sonografiatransvaginal.
Nostrabalhosemqueosováriossãopro-
venientesdeabatedouros,normalmentesão
transportadosemsoluçãosalinaa 0,9%de
NaCI aquecidaa 30-35°C.O tempotrans-
Figura10.1.Métododecolheitadeoócitosinvitro.Osfo-
lículosentre2 e 8 mmestãosendopunciona-
doscomo auxíliode umabombadevácuo.
ri...,~ i ..~..
,f.
:11 ...
Figura10.2.Métodode colheitade oócitosin vivopor
ultra-sonografiaviatransvaginal.No painel
A, estásendorealizadaa colheitaviatrans-
vaginal,estandonodetalheo transdutore
a agulhaparaaspiraçãofolicular.No painel
B,estãosendodemonstradososfolículosna
telado ultra-som,enquantoa bombade
vácuomostrandoaproximadamente30 mm
de Hg, no painelC, e os oócitosobtidos
pelaaspiraçãonopainelD.
corridoentreaobtençãodosovárioseo iní-
ciodacolheitavariaentregruposdepesqui-
sa,masnãopareceafetaraviabilidadedos
oócitosquandorealizadono períododeaté
3 horas.No laboratório,osováriossãolava-
dos com novasoluçãosalina,aquecidana
mesmatemperaturadetransporteeconten-
doantibióticos(100VI depenicilinae50/lg
197
Célulasmuraldagranulosa
Antrofolicularcomlíquido
deestreptomicina/ml).Emalguns
laboratórios,osováriossãodesin-
fetadoscomálcoola70oGL.Com
agulhadecalibre18G,osfolícu-
los,medindoentre2 e8 mmde
diâmetro,sãoaspiradoscom
bombadevácuo,ajustadapara
aspirarumvolumede10mlde
líquidoporminuto,pressãoque
nãocomprometea quantidade,
qualidadeeposteriorviabilidade
dosoócitos.
PrincípiosBásicosda Maturação
in yitrodeOócitos
O oócito,no interiordofolículo,estáen-
voltopor célulasdagranulosa,formandoo
complexocumulus-oócito(CCO). O con-
juntodecélulaspróximasdazonapelúcida,
queestãoemíntimocontatocomo oócito
porjunçõesintercomunicantesédenomina-
dodecoronaradiata.Essascélulasdocumu-
lustêmfunçãodiferenciadadaquelaspresen-
tesna muraldo folículoemconseqüência
doseuíntimocontatocomo oócito(Figura
10.3).Substânciasreguladorasproduzidas
pelooócitotêmfunçãoimportantenaativi-
dadedascélulasdo cumuluse, da mesma
maneira,componentesdessascélulassomáti-
castêmparticipaçãoativanomecanismode
crescimentoematuraçãodosoócitos.Apesar
dascélulasdocumulusnãoseremessenciais
paramaturaçãodosoócitos,melhoresresul-
tadosdematuração,fecundaçãoededesen-
volvimentoembrionáriosãoalcançadosna
presençadessetipocelular,fatoqueeviden-
ciaaimportânciadascélulasdocumulusna
maturaçãodo oócitoin vitro.
Característicasmacroscópicasdofolículo
sãoimportantesparadeterminaropotencial
de maturaçãonucleare citoplasmáticado
oócito.Oócitospresentesemfolículosmeno-
resque2 mmdediâmetro,geralmentenão
sãocompetentesparareiniciarema meiose,
198
Teca externa
Teca interna
Corona radiata
Oócito
Zona Pelúcida
.
Cumulus oophorus
~C
...
r.
Figura 10.3. Estruturasovarianasobservadasem bovinos.
No painelA, estãosendo indicados, par se-
taspretas,os folículosterciáriosde diferentes
tamanhose par setabranca, umcarpa lúteo
emumováriobovino.No painelB, estárepre-
sentadoesquematicamenteumfolículoterciá-
rio. No painel C, está sendo apresentado
umcomplexocumulus-oácitobovino, indican-
do o cumulusoophorus(setabranca),carona
radiata Isetapreta)e oócito (setaazul).
enquantoqueumaelevadapercentagemde
folículosmaioresdo que8 mmjá estãoem
processodeatresiaouapresentamoócitosem
processode maturação,ressaltando-seque
emambososcasos,aviabilidadedosoócitos
encontra-secomprometidaparaPIV. Contu-
do, deveser consideradaa diferençaentre
folículosdominantesesubordinadosquepa-
receterreflexosobreacapacidadedooócito
emprogrediratéa clivageme sustentaro
desenvolvimentoembrionário.Oócitosaspi-
radosde folículosum poucoantesdo pico
ovulatóriodohormônioluteinizante(LH) têm
maior capacidadede desenvolvimentoaté
blastocistodoqueaquelescomdiâmetroen-
tre2 e6mm.Provavelmente,apermanência
dooócitono folículodesdeadivergênciafo-
licularatéaovulaçãoéimportanteparacom-
pletaro fenômenodenominadode capa-
citaçãodooócito.Naprática,osfolículosen-
tre2e8mmtêmsidoutilizadosparamatura-
çãoinvitroemdecorrênciadonúmerodispo-
nívelnoovárioedadificuldadededeterminar
osoócitosqueestãocapacitadosantesdafe-
cundação.Métodoseficazesparacapacitação
deoócitosin vitrodevemserdesenvolvidos
paraincrementarosíndicesdeproduçãode
embriões.
O oócitopodeteroseupotencialdema-
turação,fecundaçãoecapacidadededesen-
volvimentoembrionárioestimadopelaapa-
rênciadoCCO. Morfologicamente,osoóci-
toscommaiorpotencialdeviabilidadedevem
apresentarooplasmahomogêneocomgra-
nulaçõesfinas,decoloraçãomarromecom-
pletamenteenvolvidosporváriascamadasde
célulasdocumulusdispostasdeformacom-
pacta(FiguralO.4A).Entretanto,hágrandes
variaçõesquantoaospadrõesmorfológicos
dequalidadedeoócitoentreasespécies.Por
exemplo,oócitosviáveisdecamundongoapre-
sentamoooplasmaclaro,quasesemgranula-
ções,enquantoqueemeqüinos,suínosecães,
observa-seooplasmaescuroeasgranulações
podemapresentar-sedeformaheterogênea.
Váriasclassificaçõesmorfológicastêmsido
adotadasparaselecionaroócitosbovinosna
tentativadeidentificarosdemaiorviabilida-
de. Nestecapítulo,estásendoapresentada
umaadaptaçãodaproposiçãode Leibfried
& First (1979),classificaçãocomescalade
1a4,considerandoascaracterísticasdocu-
mulus(coberturadooócito)edo citoplasma
do oócito(ooplasma):
.. .iif
-
Figura 10.4.Oócitosimaturoscomo cumuluscompacto
(AI e maturoscom o cumulusexpandido (BI.
Qualidade1:Cumuluscompactopresente,
contendpmaisdetrêscamadasdecélu-
las.Ooplasmacomgranulaçõesfinase
homogêneas,preenchendoointeriorda
zonapelúcidaedecoloraçãomarrom.
Qualidade2: Cumuluscompactoparcial-
mentepresenteemvoltado oócitoou
rodeandocompletamenteooócito,com
menosde3 camadascelulares.Ooplas-
ma,comgranulaçõesdistribuídashete-
rogeneamente,podendoestarmaiscon-
centradasnocentroemaisclarasnape-
riferiaou condensadasemumsó-local
aparentandoumamanchaescura.O
ooplasmapreencheoespaçodointerior
dazonapelúcida.
Qualidade3:Cumuluspresente,masexpan-
dido.Ooplasmacontraído,comespaço
entreamembranacelulareazonapelú-
cida,preenchendoirregularmenteoes-
paçoperivitelino,degenerado,vacuoli-
zadoou fragmentado.
Qualidade4:Oócitodesnudosemcumulus.
A maturaçãodo oócito,envolvendoas
transformaçõesnuclearecitoplasmática,está
ligadaa umasériedemudançasestruturais
ebioquímicasquetornamogametafeminino
aptoa serfecundadoeterdesenvolvimento
embrionáriosubseqüente.In vivo,essepro-
cessoteminício, coincidentemente,como
pico pré-ovulatóriode LH duranteo estro
e, in vitro,coma simplesretiradadooócito
dofolículo.A maturaçãonucleardooócitobo-
vinorequerde 18a 22 horasecompreende
aprogressãodoestádiodediplótenodapri-meiraprófasemeióticaatéafasedemetáfa-
se11.O períodonecessárioparamaturação
nuclearvariaentreasespécies.A cinéticades-
seprocesso,embovinosecamundongos,está
apresentadanatabela10.2.
Concomitantecomamaturaçãonuclear,
o oócitosofremodificaçõescitoplasmáticas
199
essenciaisparafecundaçãomonospérmicae
subseqüentedesenvolvimentoembrionário.
Ao iniciaroprocessodematuração,atrans-
criçãodegenesnecessáriosparasíntesede
proteínasduranteamaturaçãoeo iníciodo
desenvolvimentoembrionárioé cessada.
Nesseperíodo,ocorremsignificantesmodifi-
caçõesnasínteseprotéicaqueafetamocom-
pletoprocessode maturaçãodo oócito.A
modulaçãoda sínteseprotéicaé observada
simultaneamentecomareorganizaçãodeor-
ganelascitoplasmáticas.Modificaçõesem
número,tamanhoelouposiçãodasorgane-
Iascitoplasmáticastêmsidodescritasemoó-
citosdemamíferos.Na reestruturaçãocito-
plasmática,a maioriadasorganelasmigra
parao centrodacélula.Por exemplo,mito-
côndriassãolocalizadasperifericamenteem
oócitoimaturoemaiscentralemoócitoma-
turo,noentanto,osgrânuloscorticais(GCs),
associadoscomumsegmentodoretículoen-
doplasmáticoliso,permanecempróximosa
periferiada célula.Após o início da matu-
raçãodooócitodasespéciesruminanteehu-
mana,ocorreum aumentodo númerode
GCs. Nessasespécies,o númerodeGCs é
significativamentemaioremoócitosapóso
rompimentodavesículagerminativadoque
naquelesemestádiodevesículagerminativa
(Cran, 1989;Sathananthan& Trounson,
1982;Fairetal., 1997).Todavia,o número
deGCsemcamundongoésignificativamente
reduzidonosoócitosemMIl devidoa pre-
maturaexocitoseduranteamaturação(Du-
cibellaetal.,1990).O indicadormaisfactual
dacompletamaturaçãonuclearecitoplasmá-
ticaéacapacidadedo oócitoserfecundado
edesenvolveratéembrião.
Duranteamaturaçãonuclearecitoplas-
mática,ascélulassomáticasqueenvolvemo
oócitotambémsofremsignificativasmodi-
ficações.As célulasda granulosa,tantoda
muralquantodocumulus,parecemdesem-
penharimportantesfunçõesno crescimen-
200
to,divisãomeióticae maturaçãocitoplas-
máticadooócito.Ascélulasdocumulus,mas
nãoasdamural,tornam-sesuspensasem
umamatrizdemucoduranteamaturação,
permanecendoseparadasemconseqüência
doacúmulodessemucoricoemácidohialu-
rônico.Hormôniosendógenosefatorespro-
duzidospelooócitoestimulama síntesede
ácidohialurônico,pelascélulasdocumulus,
induzindoamucificaçãoouexpansãodocu-
mulusduranteoperíododematuração(Fi-
gura10AB).A comunicaçãoentreascélulas
documuluseooócitotemsidodemonstrada
emCCOsdediversasespéciesanimais.Essas
junçõesintercomunicantesentreascélulas
somáticaseooócitoparecemserimportan-
tesparaapassagemdenutrientesecompo-
nentesquímicosreguladoresdamaturação
dooócito.
Tabela10.2. Cinéticadamaluroçõonuclearem bovinose camundongos.
Estãorelaaonodasospenadosnecessáriosporoos oócitos
atingiremosestódiosderompimentodavesículogerminativa
(RVG), metófaseI (MI), anófoseI (AI), telófoseI (TI) e
metáfose11(MIIJ, opós reiniciarema divisãomeiótica.
~ Regulaçãoda Maturaçãode Oócitos
Antesdeabordarespecificamenteospro-
cessosin vitro,serãodiscutidosalgunsfato-
res,mecanismose princípiosfundamentais
paraamaturaçãodeoócitos.O oócitopre-
sentenofolículoprimordial,umavezativado,
devecresceresofrerváriasmodificaçõesde
ordemultraestrutural,citoesqueléticaebio-
químicacomafinalidadedesetornarcom-
petenteparareiniciarecompletaramatura-
ção meiótica.Oócitos incompetentessão
EstádiodaDivisão Bovino Camundongo
Meiótico Horas Horas
RVG 8-12 2.3
MI 12-15 6-9
AI/TI 15.18 10-13
Mil 18-22 13-14
Fosfatasecdc25
~
Tre14-P
Inativa
Figura10.5.AtivaçãodoMPFdurantea maturaçãodooócito.
deficientesemRNAs mensageirosquecodi-
ficamparao fatorintracelularpromotorda
fase-M(MPF). Enzimasquinasesefosfata-
sesestãoenvolvidasnoreinícioenacompleta
maturaçãomeióticadooócito(Figura10.5).
Oócitosemfasedecrescimentoapresentam
nívelmuitobaixodep34cdc2enãosãocapazes
deprogrediremdafaseG2(intervaloentrea
síntesedeDNA edivisãocelular)paraa M
(divisãocelular,meiose).No finaldafasede
crescimento,aconcentraçãoeaatividadede
p34cdc2estáaumentadaeo oócitoalcançaa
competênciameiótica.
O MPF écompostodeduassubunidades,
sendoumacatalítica,constituídaporumapro-
teínade34kD, ap34cdc2(controledadivisão
celular),eumareguladora,formadaporuma
proteínade45kD, aciclinaB.Emsuaforma
inativa,a p34cdc2é fosforiladaemtreonina
161,treonina14etirosina15.Paraserativa-
da,essasubunidadecatalíticadeveserdesfos-
foriladaemtreonina14etirosina15pelafos-
fatasecdc25.O MPF apresentaforteafInida-
depelahistonaH 1quinasecomosubstrato,
a qualtemsidoutilizadaparademonstrara
atividadedoMPE Emoócitosbovinos,ahis-
tonaH 1quinaseestáembaixonívelnoestádio
devesículagerminativae,subseqüentemente,
Tre14
Ativa
ocorreaumentogradativo,atingindoomáxi-
monoestádiodemetáfaseI (MI). Apósesse
pico,osníveisdehistonaH 1quinase(ativida-
dedeMPF) têmdiminuiçãoabrupta,coinci-
dindocomosestádiosdeanáfaseI (AI) ete- .
lófaseI (TI). Um outroaumentonaatividade
doMPF éobservadoemMIl. Essesníveisele-
vadossãomantidosváriashorasapósama-
turaçãodo oócitoe, gradativamente,dimi-
nuemapós30horasdamaturaçãoou,abrup-
tamente,nafecundaçãoouativaçãodooócito
(Figura10.6).
Emmamíferos,existemevidênciasdeque
várioseventosduranteamaturaçãodeoócitos
ocorremtambémsoba regulaçãoda MAP
quinase(MAPK -mitogen-activateproteinki-
nase)tambémdenominadadeERK (extracel-
lularregulatedkinase).A MAPK éativadaem
conseqüênciadafosforilaçãoemresíduoses-
pecíficosdetirosinaetreoninaduranteama-
turaçãodeoócitos.Emmurinos,duasisofor-
mesdeMAPK, p42-ERK2 (42kDa)ep44-
ERKl (44kDa),foramidentificadas.Embo-
vinos,a MAPK éativadano rompimentoda
vesículagerminativa(VG),atingeaatividade
máximaemMI e permaneceelevadaatéa
formaçãodospronúcleos,nãodiminuindoem
MIl. EssesachadossugeremqueaMAPK é
201
LI..
Q.
:E
C1)
"Ceu
"C
"S;
;;«
FecundaçãoouAtivação
t
o 8 12 14 16 18 19 20 24
Maturaçãodo Oócito (h)
26 30 48
Figura10.6.AtividadedoMPFmedidopelaatividadedahistonaH1quinasedurantea maturaçãodeoócitosbovinos.
O MPF alcançaa maioratividadenoestádiodeMI, diminuinodeAI e TI,aumentanovamenteemMil
e, finalmente,diminuiapósa fecundação,ativaçãoouapós30 horasde maturaçãoIWu etai., 1997;
Liu& Yang,1999).
FecundaçãoouAtivação
!
~
11.
~
:!E
Q)
'C
ca
'C
"S:
;:
~
o 9 12 15 20 24 26 35 36 38 44
MaturaçãodeOócito(h)
Figura1OI Atividadeda MAPKdurantea maturaçãodeoócitosbovinos.A atividadedaMAPKaumentanomomento
do rompimentoda VG, atingea maioratividadeemMI e permaneceelevadaatéa formaçãodospronú-
cleos(Fissoreetai., 1996; Liu& Yang,1999)
'}f\'}
importanteparamantero oócitoemMIl e
entrareminterfase(Figura10.7).
aócitos competentesreiniciam,in vivo,
aprimeiradivisãomeióticacoincidentemente
apóso pico ovulatóriode LH, entretanto,
aindanãoestácomprovadoseo LH éo res-
ponsávelpeloreiníciodameioseembovinos.
Váriasseqüênciasnesseprocesso,desdeo
desencadeamentodoRVG atéobloqueioem
MIl, nãosãocompletamenteelucidadas.Por
exemplo,nãoéconhecidoosinalquedesen-
.cadeiaa ativaçãodo MPF edaMAPK, rei-
niciandoameioseemoócitosdemamíferos.
a oócitodemuitasespéciesé mantidoem
G2 peloAMPc quetemfunçãoinibitóriana
maturaçãonucleardeoócitosdecamundon-
go, bovinoe suíno,masnãodeovino.Em
bovinos,oAMPc induzinibiçãotemporaria-
mentecurtana vesículagerminativa,não
impedindoa progressãoatéMI.
Após maturação,os oócitossãomanti-
dosemMIl atéa fecundaçãoou aativação
partenogenética.Existemevidênciasqueos
oócitossãomantidosemMIl por açãode
fatorescitostáticos(CSF) quesãocapazes
de mantera atividadeelevadado MPE O
CSF écompostopor MAPK ec-mosproto-
oncogene(Mosquinase).Moséumaserina/
treoninaquinaseencontradasomentenoes-
tádiodeMIl emoócitosbovinoseéumati-
vadordaMAPK. Em camundongo,oócitos
deficientesemMos quinasenãopermanece
emMIl. Assim,inúmeroshormônios,fosfa-
tasesequinasesestãoenvolvidosnoprocesso
deregulaçãodamaturaçãodeoócitosbovi-
nos,processoquenãoestácompletamente
elucidado.aconhecimentobásicodesses
mecanismoséfundamentalparasealcançar
a eficiênciamáximanos procedimentosde
produçãodeembriõesin vitro.
Maturaçãoin vitrodeOócitos
Umagrandevariedadedemeiostemsido
utilizadaparamaturaçãoin vitrodeoócitos,
todavia,a maioriadasequipesutiliza,como
meiobase,oTCM -199comsaisdeEARLE.
Essemeioémodificadoconformearotinade
cadalaboratório,geralmente,éadicionadoL-
gh.\,tamina,bicarbonatode sódio,HEPES,
piruvatodesódioe hormônios.Em relação
aoshormônios,é usuala utilizaçãodoLH,
oudoFSH ouaindaacombinaçãodessasgo-
nadotrofinas.Há controvérsiasquantoàreal
necessidadedesseshormôniose quantoàs
concentraçõesa seremutilizadas,porém,a
maioriadosresultadosdemonstramqueaadi-
çãodegonadotrofinasaomeiodematuração
deoócitosbovinosaumentaacapacidadede
fecundaçãodo oócitoemelhorao posterior
desenvolvimentoembrionário.Algunslabora-
tóriostambémutilizamestradiol17-~,mas
naatualidade,amaiorianãoadicionaessees-
teróidenosmeiosdematuração,principal-
mentenosprotocolosqueutilizamóleopara
impediraevaporaçãodeáguadomeiodecul-
tivo.Tendoemvistaqueosesteróidessãohi-
drofóbicos,a tendênciadesseshormôniosé
migraremparaoóleoempoucosminutosde
cultivo.A adiçãodosoroaomeiodematura-
çãotemsidosugeridacomoumdosrequisitos
parasealcançara perfeitaexpansãodo cu-
muluseamaturaçãodooócito.Melhoresín-
dicesdedivagemtêmsidodescritoscomsoro
devacaemestro(SVE), contudo,existem
inúmeroscomponentesdosoroquepoderão
afetarpositivaenegativamenteosresultados
in vitro.Por isso,é necessáriotestarcada
partidadesoroantesdecolocá-Ianarotina
daproduçãoin vitro.Alémdo meio,outros
fatoresrelacionadoscomoambientedeculti-
vocelulardevemserconsideradoscomofun-
damentaisparaodesenvolvimentoembrioná-
rio. Paraisso,énecessáriaestufaquemante-
nhaprecisamenteaatmosferagasosaetempe-
raturaconstantes.Geralmente,amaturação
deoócitosbovinosérealizadaa39°Cpor24
horasematmosferade5%deca2 emar e
umidadesaturada.
203
PrincípiosBásicosdaCapacitaçãoEspermática,
ReaçãodeAcrossomoe Fecundação.
~ CapacitaçãoEspermática
O espermatozóideéfuncionalmenteima-
turo,infértile imóvelenquantopermanece
notestículo,somenteadquirindocapacidade
defecundarnoepidídimo.A maiorpartedas
mudançasqueocorremnoepidídimoestáre-
lacionadacoma aquisiçãodamotilidadee,
emgraumenor,comamorfologiaemetabo-
lismo.A maturação€ umreflexodemuitas
modificaçõesbioquímicasdoespermatozói-
dee,dentreessastransformações,pode-se
afirmarqueocorreestabilizaçãodacromati-
naedasestruturasdacabeçaecauda,estabi-
lizaçãodamembranaplasmáticapelaabsor-
çãoe/ouintegraçãodeglicoproteínasepidi-
dimárias,aquisiçãodomovimentoprogressi-
voehabilidadeparaligar-seàzonapelúcida.
Os espermatozóides,quandoem contato
comoplasmaseminal(glicoproteínasoupo-
lipeptídeos,incluindofatoresdecapacitan-
tes),sofremincorporaçõesemodificaçõesde
váriassubstânciasda suasuperfíciequeos
tornamincapazesdefecundar.Essefenôme-
no bioquímicoé denominadodedecapaci-
taçãoespermática.
A capacitaçãoespermáticaé de funda-
mentalimportânciaparaqueosespermato-
zóidestornem-seaptosparafecundarinvivo.
Esseprocessoocorreno tratogenitalfemi-
ninopelaremoçãodecomponentesdecapa-
citantes,semmodificaçõesmorfológicas,
masbioquímicas,queresultamemdesesta-
bilização(fluidez)damembranaplasmática
ehiperativaçãoespermática,essenciaispara
queocorramareaçãodoacrossomoeape-
netraçãodo espermatozóideno oócito.
Algumasglicosaminoglicanaspresentesno
tratogenitalfemininosãoresponsabilizadas
por induzirema capacitaçãoespermáticain
vivo.Nosprocessosinvitro,umaglicosamino-
glicana,a heparina,temsidoutilizadapara
capacitarespermatozóidesembovinos.Ome-
204
canismopeloqualaheparinaatuanacapacita-
çãoespermáticanãoécompletamenteconhe-
cido,todavia,pareceestarenvolvidono de-
sencadeamentodemudançasbioquímicasna
membranaplasmáticado espermatozóide.
Sualigaçãocomoespermatozóideémediada,
provavelmente,porproteínas,comoaproteína
carreadoradeheparina(HBP), presentesno
plasmaseminaldetouros.
Existevariaçãoindividualentretouros
quantoàconcentraçãodeheparinanecessária
paraacapacitaçãoespermática.A concentra-
çãoidealdeheparinavariade2 a 100~g/ml
demeio,dependendodotouroedoprocesso
deseparaçãoespermática.Há evidênciasde
queespermatozóidesseparadospelogradien-
tedepercolnecessitammenorconcentração
de heparinado queaquelesseparadospor
swimup.A concentraçãomaiseficiente,nos
diferentesprocessoseparaosdiferentestou-
ros,estáemtornode10~g/mldemeio.No
entanto,é adequado,semprequepossível,
determinaraconcentraçãoidealparaosêmen
quevaiserutilizadonarotinadolaboratório.
Emcasosdeproduçãoinvitrocomercial,esse
procedimentonemsempreépossívelemcon-
seqüênciado custoe/ou da disponibilidade
dedosesdesêmenpararealizaroteste.Atual-
mente,aheparinaéaglicosaminoglicanamais
utilizadaparacapacitarespermatozóidespara
fecundaçãoin vitro.
~ Reação do Acrossomo
Na presençadecálcioextracelular,o es-
permatozóidecapacitadotemahabilidadede
seligaràzonapelúcidado oócitoesofrera
reaçãoacrossomática.Paraqueo esperma-
tozóidepenetrenazonapelúcidaesefusione
comamembranaplasmáticadooócitoéne-
cessáriocompletara reaçãoacrossomática.
A reaçãodeacrossomoenvolveasegmenta-
çãoprogressivadoacrossomoea fusãodas
membranasplasmáticaeacrossomática,for-
mandovesículasepermitindoaliberaçãode
enzimaseaexposiçãodamembranainterna
eperforatorium.A liberaçãodessasenzimas
éimportanteparaapenetraçãodoesperma-
tozóidee a fecundaçãodo oócito.A perda
completadoacrossomoocorrecomapene-
traçãodoespermatozóidenazonapelúcida.
~ Fecundação
A ligaçãodo espermatozóideao oócitoé
mediadaporreceptoresespermáticosespécie-
específicospresentesna zonapelúcida.As
glicoproteínasconstituintesdazonapelúcida,
identificadasinicialmenteemcamundongos
sãodenominadasde ZPl, ZP2 e ZP3 que
apresentamimportantesfunçõesnafecunda-
ção.A ZPl tem,basicamente,papelestrutu-
ral,enquantotemsidoatribuídaa funçãode
receptorsecundárioàZP2 ereceptorprimá-
rioàZP3, sendoqueaZP3 temsidorespon-
sabilizadapelareaçãodoacrossomo.O esper-
matozóidepenetrana zona pelúcidapelas
açõesenzimáticase mecânicas.A reação
acrossomáticapermitealiberaçãodeenzimas
quedigeremamatrizdazonapelúcidaeex-
põeo perforatoriumparaa penetraçãodo
espermatozóidena zonapelúcidaauxiliada
pelasuamotilidade.A fusãodooócitocomo
espermatozóideocorreapósa penetração,
especificamentepelocontatoentreosegmen-
toequatorialdoespermatozóideeamembra-
naplasmáticadooócito.A membranavitelina
(membranaplasmáticado oócito)participa
ativamentenesseprocessoe,dessaforma,o
espermatozóideéincorporadopeloooplasma.
O oócitoativadopeloespermatozóiderespon-
de inicialmentecom a despolarizaçãoda
membranaplasmática,lúdrólisedofosfatidili-
nositolbifosfato(PIP2),aumentodasoscila-
çõesintracelularesde cálcio,exocitosedos
grânuloscorticais,aumentodopH inti:'acelu-
laredasínteseprotéica.
Paraimpedirapenetraçãodemaisdeum
espermatozóide,ocorreobloqueioprimário
dapolispermiaqueédevidoàrápidadespo-
larizaçãodamembranaplasmáticadooócito
apósafecundação,denominadodebloqueio
vitelínico.O bloqueiosecundárioresultada
reaçãocorticaloutambémdenominadade
reaçãodazona,apósapenetraçãoespermáti-
caqueenvolveafusãodamembranaplasmá-
ticadooócitocomamembranadosgrânulos
corticais.Essafusãoépropagadacomouma
onda,envolvendotodaasuperfíciedooócito,
apartirdopontodafusãoespermatozóide-
oócito.O conteúdodosgrânuloscorticais,
comoenzimashidrolíticas,proteinasesepe-
roxidases,édepositadonoespaçoperiviteli-
no,provocandohidróliseparcialdasproteí-
nasdazonapelúcida,sendotransformadas
emZPIF, ZP2F eZP3F.Os sacarídeosda
zonapelúcidatambémsofremalteraçõespor
açãodasglicosidasesliberadasdosgrânulos
corticais.Comessasmodificações,a zona
pelúcidaperdereceptoresespermáticose
torna-semaisresistenteàdigestãoenzimáti-
ca,impedindoapenetraçãodeoutrosesper-
matozóidesqueprovocariampolispermiae
impediriamaclivagemeodesenvolvimento
embrionário.
Apósapenetraçãoespermática,ocorrea
segundadivisãomeióticaeoscromossomos
quepermaneceramnooócitosãoenvolvidospor umamembrananuclear,formandoo
pró-núcleofeminino.Deformaconcomitan-
te,amembrananucleardoespermatozóide
sedesintegra,a cromatinanucleardescon-
densapelaremoçãodeproteínasnucleares
espermáticasespecíficaseocorrea forma-
çãodenovamembrananuclearqueenvolve
oscromossomospaternos,formandoopró-
núcleomasculino.SínteseativadeDNA e
transcriçãodeRNA,comsíntesedenovas
proteínassãoobservadasdurantea forma-
çãodospronúcleos.Duranteo desenvolvi-
mentodospronúcleosmasculinoefemini-
no,hámigraçãoparaocentrodoooplasma.
Osmicroftlamentospresentesnocórtexdo
oócitosãoessenciaisparaa migraçãodos
205
pronúcleosparao centrodocitoplasmado
oócito.Nocentrodoooplasmaocorreasin-
gamia,ospronúcleossedesintegrame os
cromossomosseassociamparaa primeira
divisãomitótica.Como completoprocesso
dafecundação,observa-sequeoscromos-
somospaternosematernostornam-seasso-
ciadoseconsidera-sequeodesenvolvimen-
toembrionárioteminíciocomumgenoma
estabelecido.
PreparaçãoEspermáticaeFecundaçãoinvitro
~ Métodosde SeparaçãoEspermática
paraFecundaçãoin vitro
Astécnicasmaisutilizadasparaseparação
deespermatozóidesvivosdosdemaiscom-
ponentesdosêmenedoscrioprotetoressão
oswimup,o gradientedepercoleo lavado
espermático.A técnicaidealparaseparação
espermáticadeveserrápida,simples,debai-
xo custo,capazderecuperara maioriados
espermatozóidesmóveis,nãoresultaremal-
teraçõesespermáticas,removerespermato-
zóidesmortoseoutrascélulas,incluindomi-
croorganismos,removersubstânciastóxicas
e bioativas,permitiro processamentode
grandesvolumesdesêmen,alémdepermitir
ocontroledaconcentraçãoevolumefinalda
suspensãoespermática.
Noswimup,osespermatozóidesvivossão
separadosdosmortos,do plasmaseminale
doscomponentesdosdiluidorespelamotili-
dadeascendente.Esseprocessoconsisteem
depositarde200a500l.tIdesêmennofundo
detubosdecentrífugacontendoentre1e2 ml
deSP-TALP(videpreparaçãodosmeiospara
PIV) paraqueo sêmenpermaneçanofundo
dotubocobertopelomeioSP-TALP.Em se-
guida,essestubossãocolocados,comincli-
naçãoparaformaro ângulode45°,emam-
bientea39°Cealgunslaboratóriosincubam
o sêmenemestufacomatmosferade5%de
ca2 emar e umidadesaturada,permitindo
queosespermatozóidesmigremparaaposi-
206
./
çãosuperiordomeioeosdemaisconstituin-
tesdosêmenpermaneçamnofundodotubo.
Numasegundaetapa,osobrenadanteéaspi-
rado de formaa nãopermitirquecompo-
nentesdosêmenpresentesno fundodotubo
entrememcontatocomosespermatozóides
e,emseguida,essaamostraétransferidapara
outrotubocomafinalidadedesercentrifuga-
da a rotaçãode 700a 900xg por 10a 30
minutos.Posteriormente,despreza-seo so-
brenadante,adiciona-se4 ml deSP-TALP e
seprocedenovacentrifugaçãoporigualperío-
doerotação.Aopelletresultantedasegunda
centrifugação,adiciona-seFERT-TALP (vide
preparaçãodosmeiosparaPIV) paraobtera
concentraçãofinalde 1 a 2 x 106esperma-
tozóides/mlnecessáriaparafecundação(vide
fecundaçãoin vitro).
Na separaçãoespermáticacomo perco!,
o sêmenécentrifugadoatravésdapassagem
por diferentesgradientesparapermitira se-
paraçãodosespermatozóidesvivosdosde-
maisconstituintesdosêmen,baseadona di-
ferençadedensidade.a percolécomposto
porpartículasdesilicacoloidalcobertocom
polivinilpirrolidona,preparadoemdiferentes
concentraçõesparaformarumgradientene-
cessáriodeseparaçãoespermática.Paradi-
luiçãodoperco!,o meioSP-TALP teráseus
saisconcentradosnaproporçãode10vezes.
Comessemeio,prepara-seumasoluçãode
percol90%.Uma outrasoluçãode percol
45%épreparadaapartirdadiluiçãodoper-
co190%comSP-TALP Ix naproporçãode.
1:1.No fundodeumtubodeensaioécolo-
cado2 mldasoluçãodepercol90%esobre
essasolução,adiciona-se,lentamente,2 ml
de percol45%,sempermitirhomogeniza-
çãoentreasduassoluções.a conteúdode
umapalhetadesêmendescongelado(500Jll)
é depositado na superfície da solução
depercol45%e,a seguir,écentrifugadoa
700xgpor30minutos(Figura10.8).Após
Di!uidor
Perco!a45%
EspermatozóidesnãoviáveisemPerco!a45%
a centrifugação,o sobrenadanteé removi-
doe os espermatozóidessãosuspensosem
500l.tIdeFert-TALP.
~ Fecundaçãoin vifro
Apósamaturaçãodosoócitose separa-
ção dos espermatozóidesviáveis,deve-se
proporcionarum ambienteadequadopara
queocorraa capacitaçãoespermáticae a
fecundação.Esseambientedevepermitiro
metabolismodosoócitosecélulasdocumu-
lusemantera funçãoespermáticaeficiente.
Paraessafinalidade,o meiomaisutilizadoé
o FERT-TALP contendoheparinaparaca-
pacitaçãoespermática.Oco-cultivo (esper-
matozoideseoócitos)érealizadoporumpe-
~
~
~
~
~
Perco!a90%
ríodoentre18e22 horas,a umatempera-
turade39°C,emumaatmosferade5%de
CO2emareumidadesaturada.Osesperma-
tozóidessãoadicionadosàsgotasdefecun-
daçãocontendoosoócitosemumaconcen-
traçãofinalquepodevariardelxl06a Ixl07
espermatozóides/mldemeio.A concentra-
çãofinalmaisutilizadaparafecundaçãoin
vitroéde2x 106espermatozóides/ml.A adi-
çãodePHE (penicilamina,hipotaurina,epi-
nefrina)ao meioFert-TALPtemsidoutili-
zadaporalgunslaboratórioscomafinalidade
deaumentaraatividadeespermáticae faci-
litarasuapenetração,incrementandoosÍn-
dicesdefecundação(videProtocolodePIV
embovinos).
EspermatozóidesvivosemPerco!a90%
Figura 108 - Distribuiçãodossegmentosdo sêmennasdiferentescamadasde percolapóscentrifugação..
PrincípiosBásicosdo Desenvolvimento
EmbrionárioPrecoce
~ Clivagem
Ao finaldasingamia,origina-seo zigoto
comnovoarranjocitoplasmáticoecomeçaa
formaçãodeumorganismomulticelularcom
outropotencialgenético.Nessafase,teminÍ-
cioumasériededivisõesmitóticas,pormeio
dasquaisozigoto,quepossuiumacélulacom
grandevolume,sedivideemnumerosascé-
lulasnucleadasdemenortamanhoatéafor-
maçãodoblastocisto(Figura10.9).Essepro-
207
cessoéconhecidocomoclivagemeascélu-
Iasresultantesdaclivagemsãodenominadas
deblastômeros.
r::~;;;"~,.' 11'
Figura 10.9.Blastocistoproduzidoinvitroemestádiode
eclosãoIA) eeclodido(Bj.
Emmuitasespécies,ogenomadozigoto
nãotemcontrolesobreasfasesembrionárias
iniciaiseasprimeirasclivagenssãocontro-
ladaspeloRNAmmatemopresentenooóci-
to,entretanto,nosmamíferos,ogenomaem-
brionáriocomeçaatranscriçãonasfasesini-
ciaisdaclivagem.A ativaçãodogenomaem-
brionárionocamundongoocorrenoestádio
deduascélulas,nosuínonodequatrocélu-
lasenobovinoeovinoduranteo estádiode
oitocélulas.A clivagemnosmamíferosédo
tipoholoblásticarotacional,todavia,porexis-
tir umapeculiaridadedaclivagemnosma-
míferos,aprimeiradivisãocelularocorrede
formameridional,enquantona segunda,
umadascélulassofredivisãomeridionalea
outraequatorial.A clivagemnasespéciesma-
míferasocorredeformabemmaislentado
queemoutrasespéciesanimais,poiséco-
mumqueoembriãodemamíferoscontenha
númeroímpardecélulas,sendoessaoutra
característicadaclivagemporqueasprimei-
rasdivisõessãoassíncronas,ouseja,osblas-
tômerosnãosedividemsimultaneamente.
~ Compactaçãoe FormaçãodaBlastocele
Nosanimaisdomésticosedelaboratório
ocorreofenômenodacompactaçãodosblas-
tômeros,osquaisparecemperdersuasiden-
tidadeseformarumaúnicamassacelular.
Essefenômenodacompactaçãocriacircuns-
tânciasqueinduzema primeiradiferencia-
208
çãoemmamíferosqueéa formaçãodotro-
foblastoe do embrioblasto.É bemprovável
quea compactaçãosejamediadapor even-
tosnasuperfíciedeblastômerosadjacentes.
Os blastômerosinteragemparasuportara
polarizaçãodamembranaduranteacompac-
tação. Em camundongo,a compactação
ocorrejá no estádiode 8 célulasenquanto
queembovinoeovinoem32células.Ospri-
meiroseventosqueocorremcomoembrião
sãomarcadospordiferenciaçãonasinterliga-
çõesentreosblastômeros,comformaçãodas
ligaçõesincipientesfirmeseligaçõesdotipo
"gap"Gunçõesintercomunicantes),quevão,
emúltimainstância,formaro trofoblasto,a
blastoceleeo embrioblasto.A diferenciação
dascélulasembrionáriasemcélulasdotrofo-
blastoouemcélulasdoembrioblastoédeter-
minadapelassuasposiçõesna fasedemó-
rola,ouseja,ascélulasdointeriordamórula
vãodarorigemàs célulasdo embrioblasto,
enquantoqueasdaperiferiadãoorigemàs
célulastrofoblásticas.
Proteínasespecíficasnasuperfíciecelular,tambémdesempenhamimportantepapelna
compactação,comoporexemplo,aglicopro-
teínaadesivacaderina-E.A compactaçãopa-
receiniciarporatividadedaproteínaquina-
seC, modificandoalocalizaçãodacaderina-
E.A reorganizaçãodocitoesqueletopodeser
a causadamodificaçãonamembranacelu-
larduranteacompactação.Asmicrovilosida-
des,prolongadaspelaaçãodos microftla-
mentos,aparecemsobreasuperfíciedacélu-
laadjacenteeligamumacélulaaoutra.Essas
microvilosidadespodemsero localdeação
adesivadacaderina-E.O achatamentoentre
osblastômeros,queocorreduranteacompac-
ração,podeserinduzidopeloencurtamento
damicrovilosidadeatravésdadespolimeriza-
çãodaactina.Dessaforma,existeumacres-
centeevidênciadequeacompactaçãoécau-
sadapelasmudançasnaarquiteturada su-
perfíciedos blastômeros.Porém,nãoestá
bemclarocomooseventosestãocorrelacio-
nadosou comoéo mecanismo'queintegra
esseseventosquecausama compactação.
A formaçãoda blastocele,cavidadedo
blastocisto,éumaetapaqueaconteceapós
a compactaçãodo embriãoqueé denomi-
nadademórulacompacta.Paraa formação
dablastoceleénecessáriohaveracúmulode
fluidoquepassaatravésdascélulasdotrofo-
blasto,nointeriordoembrião.O númerode
célulasembrionáriasnomomentodaforma-
çãodo blastocistovariaconsideravelmente
entreas espécies.Geralmente,esselíquido
começaa seacumularnosestádiosavança-
dosdeclivagem,sendo32célulasno suíno,
64nobovinoeovinoe 128célulasnocoelho.
Após a formaçãodo blastocistoocorresua
expansãotantoemconseqüênciado contí-
nuoacúmulodefluidoquantoemdecorrên-
ciadedivisãocelular.É interessantesalien-
tarqueduranteaexpansãodoblastocisto,a
assincroniada divisãocelularaumentae
acontecedeformamaislentaetambémque
aproporçãodecélulasdoembrioblasto,em
relaçãoaototaldecélulasdoblastocisto,di-
minuicomaprogressãododesenvolvimento
embrionário,apesardoíndicededivisãomi-
tóticadoembrioblastosemantersemelhante
aodotrofoblasto.Essaocorrênciaé,prova-
velmente,emconseqüênciademortecelular
no embrioblasto,causadapor um processo
deapoptosemaisacentuadonoembrioblasto
do queno trofoblasto.
Desenvolvimentoe CultivoEmbrionárioin vitro
Comojáfoiabordado,duranteoperíodo
depré-implantaçãoembrionária,ocorremal-
gunseventossignificativoscomoainiciação
eacontinuaçãodaclivagem,ativaçãodoge-
nomaembrionário,agregaçãoecompacta-
çãodeblastômeros,diferenciaçãodotrofo-
blastoeembrioblasto,formaçãoeexpansão
dablastoceleerompimentodazonapelúcida.
Essesfenômenosqueocorremduranteode-
senvolvimentoembrionárioin vitropodem
serafetadosporumavariedadedefatoresin-
trínsecoseextrínsecoscomoíonsinorgâni-
cos,tampões,composiçãodaatmosferaga-
sosa,aminoácidos,pH, fatoresdecrescimen-
to,luminosidade,vitaminasemacromolécu-
Ias.Embriõesbovinosdeduascélulasprodu-
zidosinvitrosãomaissensíveisàscondições
decultivodoqueaquelesproduzidosinvivo.
A ativaçãodogenomaembrionáriocoin-
cidecomperíodocríticodecultivo,resultan-
doembloqueiododesenvolvimentoemmui-
tasespécies.Essebloqueioaparecenatrans-
criçãodeficientedo genomaembrionárioe
subseqüentesínteseprotéicarelacionadaàs
condiçõesmetabólicas.Em bovinos,o blo-
queioocorrenoestádiode8-16célulascau-
sadopor cultivoinadequado.Issofoi o res-
ponsávelpelagrandedificuldadenaobtenção
in vitrodeembriõesbovinosnasdécadasde
60 e 70.Essadificuldadecontribuiuparao
desenvolvimentode sistemasde cultivoin
vivo,no qualos embriõesde2 ou 4 células
produzidosin vitro,desenvolviam-seemovi-
dutosatéo estádiodeblastocisto.AverilletaI.
(1955)foramosprimeirosausaremessaal-
ternativaparaultrapassarobloqueiocelular
duranteo desenvolvimentoembrionárioin
vitro,utilizandoembriõesovinostransferidos
paraovidutodecoelha.Porém,essametodo-
logiaépoucopráticaedealtocustoemcon-
seqüênciadanecessidadedemanutençãode
biotérioedosprocedimentoscirúrgicospara
transferênciae retiradadosembriõesdare-
ceptoratemporária.Porisso,métodosdecul-
tivoforamaperfeiçoadosparapermitirode-
senvolvimentoinvitro,utilizandooco-cultivo
deembriõescomBOEC (célulasepiteliaisde
ovidutosbovino),GC (célulasdagranulosa),
vesículastrofoblásticas,célulasVERO (linha-
genscelularesestabelecidasparacultivo),
209
célulasBRL (BuffaloRatLiverCells),células
endometriaisouocultivoemmeiocondicio-
nadoporváriostiposcelulares.
O co-cultivocelularéefetivoetemsidoo
métododeeleiçãoparaocultivodeembriões
produzidosin vitroemestufascomatmosfe-
rasemocontrolede°2' É importantesalien-
tarquenessessistemasdeco-cultivo,osmeios
utilizadosnãopodemserpobresemcompo-
nentesporqueascélulassomáticas,apóso
quartodiadecultivo,começama competir
comosembriões.A contribuiçãodascélulas
somáticasestánaproduçãodefatoresdecres-
cimento(EGF,TGFaeTGF-~l) queestimu-
Iamesãoimportantesparaodesenvolvimen-
toembrionárioinvitroenaremoçãodoscom-
ponentesinibitóriosdo ambientedecultivo,
comoradicaislivres,metabólitosembrioná-
riosecelulares,íonsdeamôniaeoutros.Blas-
tocistosproduzidosemsistemasdeco-culti-
vo podemapresentarmorfologianormale
conternúmerodecélulassemelhanteao de
blastocistosdesenvolvidosin vivo.As células
epiteliaisdeovidutonãosãoespécie-especí-
ficase nãodependemdapuberdadeparao
suportedo desenvolvimentoembrionário.
Existemmuitascontrovérsiasquantoaome-
lhorsistemadeco-cultivoouquantoaotipo
decélula.As célulasdelinhagensestabele-
cidasfornecemmelhorcontrolesanitário,
porém,apresentamcustomaiselevado.A
opçãodo tipocelularparao co-cultivovai
dependerdarotinaedadisponibilidadedo
laboratório,nãoinfluenciandonodesenvol-
vimentoembrionário.
Atualmente,o co-cultivodos embriões
com célulassomáticas,parao desenvolvi-
mentoembrionárioprecoce,temsidosubs-
tituídopelossistemasqueutilizam5%de°2'
meiossimplescomoo CR-l, CR-2, SOF e
KSOM acrescidosdeaminoácidosesemco-
cultivocelular.Essessistemastêminúmeras
vantagensemtermosdepraticidadeeecono-
micidade,podendoserutilizadocommeios
210
quimicamentedefinidosoucomsorosangüí-
neo.A tendênciaparao cultivoembrionário
éautilizaçãodemeiosquimicamentedefini-
dos,baseadosno conhecimentodasexigên-
ciasmetabólicas,ambientaisenutricionaisdos
embriões.Alémdisso,sistemasquepermitam
alteraçõesdascaracterísticasfísicasequúnicas
dosmeiosaolongodoprocessodecultivoten-
demaresultaremíndicessuperioresevanta-
gensemrelaçãoaossistemasestáticosutili-
zadosatualmente.
~ Ambientepara o Cultivo Embrionário
É necessário,nocultivoembrionário,o
usodemeiosimplesquesuporteanutrição
celulareo desenvolvimentodurantea fase
depré-implantaçãoembrionária.A composi-
çãodomeioébaseadanosfluidosdoútero
edoovidutoduranteoiníciodagestação.O
fluidodoovidutoécompostoporsecreções
dascélulasepiteliais,a partirdadifusãode
nutrientesdoplasma.O potássioe o cloro
estãopresentesnofluidodeovidutoemcon-
centraçõesmaiselevadasdoquenasdoplas-
ma,enquantooníveldecálcioémaisbaixo
eosdesódioemagnésiosãosimilaresaodo
soro.Enzimascomoamilaseelactatodehi-
drogenase,estãotambémpresentesem
abundâncianofluidodooviduto,enzimases-
sasquepodemconverteropiruvatoemgli-
cose.Temsidodemonstradoqueopiruvato
éumcomponenteessencialparaaclivagem
edesenvolvimentoembrionário.Somentea
partirdoestádiodemórula,embovinos,e
daterceiradivisãocelular,emcamundongos,
osembriõespodemutilizara glicosecomo
fontedeenergiaemdecorrência,possivel-
mente,dosistemaenzimático,necessáriopa-
raasuautilização,nãoseencontrarcomple-
tamentedesenvolvido.Durantea fasepro-
gesterônicadocicloestral,teminícioo au-
mentodaconcentraçãodebicarbonatoque
continuaatéaovulação.
Kim etaI. (1993)relataramqueoócitos
bovinosmaturadosefecundadosinvjiropo-
demdesenvolveratéblastocistoemmeios
simples,quimicamentedefinidose livresde
proteínas.Nessecaso,a adiçãodeaminoá-
cidos,fosfatos,piruvatoelactatoéessencial.
Coma adiçãodeaminoácidosno meiode
cultivo,háincrementonaformaçãodeblas-
tocistos.Os aminoácidosagemcomosubs-
tratosenergéticos,reguladoresdepH, bem
comoparticipamna sínteseprotéica.Em
embriõesbovinosproduzidos in vitro, o
metabolismoda glutaminaé relativamente
altonoestádiode2-4 célulasediminuinos
demórulaeblastocisto,provavelmentepeladegradaçãodeenzimasmaternas,RNAm ou
ambos.A ausênciadeglutaminaeaminoá-
cidosessenciaisinibeodesenvolvimentoaté
blastocisto.O mecanismopeloqualagluta-
minaatuano desenvolvimentodo embrião
nãoestábemelucidado,porém,a glutami-
napodeserdesaminadaeusadano ciclode
Krebsou na formaçãode glucosamina-6-
fosfato,umprecursordeglicoproteínas,gli-
colipídioseoutroscomponentesnecessários
paraa integridadecelular.
A glicina,a alaninae a prolinaestãoem
altasconcentraçõesnoovidutoemrelaçãoaos
outrosaminoácidos.A glicinaealanina,quan-
dousadasindependentes,atuamdiretamente
noincrementododesenvolvimentoembrioná-
riobovino.A utilizaçãodessesdoisaminoáci-
dosdeformacombinada,napresençadecélu-
Iasdooviduto,tambémfavoreceodesenvolvi-
mentoembrionárioembovinos.Ascélulasdo
ovidutopodemsecretarglicinaealaninaem
baixasconcentraçõesno meiode cultivo,o
queé benéficoparao desenvolvimentoem-
brionário.A concentraçãodeglicinaaumenta
entre48horase6 diasdecultivocelular,in-
dicandoqueamonocamadadecélulasepite-
liaisdeovidutosecretaglicinain vitro.
O pH dassoluçõese do fluidocelularé
críticoparaa eficiêncigdemuitoseventose
reaçõesbioquímicasqueenvolvemo equilí-
brioácido-base,bemcomoinfluênciasobre
a produçãodeblastocistos,devendovariar
ente7,3e7,5duranteamaturaçãodeoóci-
tose o cultivoembrionário.O usodesiste-
mastampõesemmeiosdecultivoéneces-
sárioparaminimizarpossíveisflutuaçõesde
pH emdecorrênciadasvariaçõesdopH do
meiorefletiremnopH docitosoldooócitoe
dascélulasembrionárias.Assim,havendova-
riaçãodepH nomeiodecultivo,dependen-
do da amplitude,a viabilidadecelularserá
afetada,resultandoembaixosíndicesdefe-
cundaçãoe deblastocistos.
Os primeirostampõesestudadosforam
misturasde saisinorgânicostamponados
comgrandesquantidadesdefosfatoou bi-
carbonatodesódio.Existemlimitaçõesem
setrabalharcomsistematampãobicarbona-
to/C02 porque,paramantero pH constan-
te,hánecessidadedousodesistemafecha-
do, equilibradopor níveisde CO2na fase
gasosa.Casocontrário,aperdadeCO2pela
soluçãopodelevaràprogressivae indesejá-
velelevaçãodopH. Outroproblema,éque,
geralmente,ostampõescausamefeitosbio-
lógicos,comoestímulooudepressãodaati-
vidadeenzimática,alémdepodereminter-
ferir ou reagircom substratoscomoinibi-
doresou cofatores.De formanãoespecífi-
ca,ostampõespodemexercerefeitosdevido
à suaforçaiônica,por isso,aconcentração
do tampãodeveser a maisbaixapossível,
desdequenãopercaacapacidadedemanter
o pH.
GoodetaI. (1966)desenvolveramoHE-
PES, o qualnadamaisédoqueumtampão
orgânicopara pesquisasbiológicas.Esse
tampãoéutilizadoemmuitosprotocolosde
PIV paramantero pH demaneiraeficiente
e maisconstantedo quea utilizaçãoúnica
debicarbonato.Houvetambémpreocupação
paraqueo tampãotivessemáximasolubilida-
deemágua,dificuldadeparapassaramem-
211
branacelular,nãoformassecomplexoscom
substânciasbiológicas,fossedebaixatoxida-
de,estávelenãoagissecomoinibidoremrea-
çõesbioquímicas.Por essasqualidades,o
HEPES temsidoo sistematampãoorgânico
maisutilizadoparacultivodetecidosecélu-
Iasanimais.
Vitaminastêmsidoconsideradasimpor-
tantesà obtençãode elevadosíndicesde
desenvolvimentoembrionárioin vitro.Em
meiodecultivoquimicamentedefinido,foi
demonstradoqueas 11vitaminashidrosso-
lúveiscontidasnomeioHam'sF1O(Biotina,
Pantotenatodecálcio,Colinaclorídrica,Ino-
sitol,Niacinamida,Ácidolipóico,Piridoxina,
Riboflavina,Tiamina,ÁcidofólicoeVitamina
B\) nãosãoessenciaisparaa formaçãode
blastocistosdecoelhosinvitro,porém,incre-
mentamconsideravelmenteo desenvolvi-
mentoembrionárioesãofundamentaispara
o crescimentoe expansãodosblastocistos.
Embriõesdehamsterrequerema presença
de aminoácidose vitaminaspresentesno
meioHam'sF10paraprogredirematéoes-
tádiodeblastocistoeclodido.Kane (1988)
demonstrouemratosqueo inositol,piridoxi-
na,riboflavinaeniacinamidasãoimportantes
paraaproduçãodeblastocistosexpandidos,
enquantoavitaminaB\2étóxicanaconcen-
traçãoencontradanomeioHam'sF10.Kane
& Bavister(1988)avaliarama importância
decadavitaminapresentenessemeiosobre
o desenvolvimentodeembriõesdehamster
de8célulasatéaeclosãoedeterminaramque
somenteo inositol,o pantotenatoeacolina
sãoimportantesparaqueoembriãoalcance
esseestádiode desenvolvimento.O ácido
fólicoéessencialparao desenvolvimentode
embriõesdecamundongos,todavia,suasu-
plementaçãono meiodecultivoparecedis-
pensávelatéo estádiode blastocisto,visto
queasconcentraçõesendógenas,na forma
defolatoreduzido,supremasnecessidades
dasprimeirasdivisõescelulares.Takahashi&
212
First (1992),bemcomoRosenkrans& FirstI
(1994)nãoencontraramnenhumefeitobe-
néficodasvitaminasdomeiomínimoessen-
cial Eagle's - MEM (Ácido patotênico-D,
Colinaclorídrica,Inositol-mio,Niacinami-
da, Piridoxal,Riboflavina,Tiamina,Ácido
fólico) sobreo desenvolvimentodezigotos
bovinosinvitro,portanto,contrárioaosacha-
dosdos trabalhosefetuadoscom roedores.
Embovinos,Montagner(1999)demonstrou
queapresençadoretinolnomeiodecultivo,
contendocélulasepiteliaisdeovidutobovino,
incrementasignificativamenteo desenvolvi-
mentodeembriõesin vitroatéo estádiode
blastocisto,sendoqueamelhorconcentração
foi de0,28Jlg/rnl e a de 1Jlg/rnl foi a que
proporcionoumarcadoefeitotóxico.
Em ovinos,poucoseconhecea respeito
do papelqueasvitaminasexercemsobreo
desenvolvimentoembrionário.Entretanto,
foidemonstradoquevitaminasdoMEM não
afetamo desenvolvimentode blastocisto
(GardneretaI.,1994).A morfologiaeo nú-
merodecélulasdosblastocistosnãosãoafeta-
dos,noentanto,ousodessasvitaminasinduz
um aumentodo metabolismoembrionário,
caracterizando-sepelamaiorentradadeglico-
seemaiorproduçãodelactatonascélulas.
Outrocomponenteutilizadonosmeiosde
desenvolvimentoembrionárioéosorosanguí-
neo.Diversostiposdesorotêmsidoutilizados
naproporçãode10%a20%dovolumetotal
domeiodecultivoembrioNário.Em relação
a espéciedo embriãopodemser'homólogo
(mesmaespéciedo embrião)ou heterólogo
(espéciediferentedo embrião).De acordo
comaidadeouacondiçãodoanimal,doqual
éobtidoosoro,temsidoutilizadosorodema-
cho castradoou inteiro,sorodefêmeaem
estro,sorodeanimalpré-púbereousorofetal.
Em bovinos,os sorosmaisutilizadosnos
meiosdecultivosãoodevacaemestro(SVE)
eo fetalbovino(SFB). Os sorosheterólogos
têmavantagemdediminuira possibilidade
decontaminaçãopordoençasinfecto-cop.ta-
giosasespecíficasdecadaespécie.O soroé
altamentecomplexo,constituindo-sedacom-
binaçãode componentes,incluindo,entre
outros,proteínas,ácidosgraxos,glicídios,vi-
taminas,hormôniosefatoresdecrescimento.
É difícildeterminarquaisassubstânciaspre-
sentesnosoroquesãonecessáriasparaode-
senvolvimentodoembrião,asquecausamde-
trimentodedesenvolvimento,asquesãodes-
necessáriasporseremsecretadaspelopróprio
embriãoeasnecessáriasàscélulassomáticas
doco-cultivo.Os índicesdedesenvolvimento
embrionáriosãoincrementadoscomaadição
desorodevacaemestrodevidoaestimulação
daproduçãodefatoresembriotróficospelas
célulasepiteliaisdoco-cultivo(Wiemeretal.,
1991).Todavia,o sorotemsidorelacionado
comproblemasfuturosde desenvolvimento
fetal(videEficáciadaMetodologiadePIV).
Paraevitaros problemascausadospela
presençadosoronosmeiosdecultivoepara
estudaros requerimentosemecanismosre-
guladoresdo desenvolvimentoembrionário,
meiosdefinidostêmsidodesenvolvidos,uti-
lizandomacromoléculascomoopolivinilpir-
rolidona(PVP) eo álcoolpolivinílico(PVA).
Nessescasos,oco-cultivonãoéutilizadocom
célulassomáticas,sendonecessárioatmosfe-
ragasosacontendoemtornode5%deO2.A
misturagasosamaisutilizadaemmeiosdefi-
nidossemsoroeS"emcélulassomáticasé5%
deCO2,5%de O2e90%deN2.
Existegrandevariedadedemeiosdecul-
tivocelularquesuportamo desenvolvimen-
toembrionárioinvitro,podendoserclassifi-
cadosemmeiossimplesecomplexos.Entre
osdiversosmeiossimples,podemserdesta-
cadosoKSOM eo SOF edentreoscomple-
xos, o TCM 199.OKSOM (videfórmula
no tópico:preparaçãodosmeiosparaPIV)
éummeioSOM (SimplexOptimizationMe-
dium;ErbachetaI.,-1994)modificadocom
aumentodasconcentraçõesdeNa+(25mM)
eK+ (2,5mM) e suplementadocom soro.
Essemeiotemfornecidoresultadossatisfató-
riosemrelaçãoàqualidadedecompactação,
índicededesenvolvimentoembrionário,qua-
1idadedo blastocistoe divisãodascélulas
trofoblásticas.
Além dessesaspectosrelacionadosao
meiodecultivo,arelaçãoentreonúmerode
embriõeseovolumedemeioéumfatorre-
levantenaeficáciadodesenvolvimentoem-
brionárioin vitro.Embriõesbovinossinteti-
zamfatoresde crescimentodurantea fase
depré-implantaçãoquesuportamo desen-
volvimentodeoutrosembriõesco-cultivados.
KeeferetaI. (1994)observaramexistirne-
cessidadedainteraçãoentreosembriões,du-
ranteocultivoinvitro,paraquesejamprodu-
zidosfatoresdecrescimento.O fatordecres-
cimentoepidermal(EGF), o fatordecresci-
mentotansformador(TGF)-a e o TGF-~1
aumentamaproporçãodedesenvolvimento
embrionáriodeduascélulasatéblastocisto
e o EGF aumentao númerodecélulasem
blastocistos.Alémdisso,o embriãocultiva-
doisoladamenteemvolumesacimade50/lI
desenvolve-senormalmentesomentenapre-
sençadessesfatoresdecrescimento.No en-
tanto,grandeaumentodo númerodeem-
briõesemrelaçãoaovolumedemeiotambém
não é recomendadoem conseqüênciade
substânciasdometabolismocelular,dosem-
briõesedascélulasdo co-cultivo,poderem
inibir o desenvolvimentoembrionário.Por
isso,o númerodeembriõespor unidadede
volumedemeiodecultivotemsidosugerido
comopontocrucialnaeficiênciadosistema
dedesenvolvimentoembrionárioin vitro.
... AvaliaçãodoSistemadeDesenvolvimento
Embrionárioin vitro
A ativaçãopartenogenéticadevesercon-
sideradana avaliaçãoda eficáciada PIY.
Oócitosbovinosnãofecundadospodemser
ativadoseiniciaremadivisãocelular,porém,
213
essesoócitosproduzembaixosíndicesde
blastocistos.Porisso,éinteressantequecada
laboratóriotenhaconhecimentodos seus
índicesdepartenogênese,quedevemvariar,
nomáximo,entre1%e5%.Paraesseíndice
serdeterminado,énecessárioterumgrupo
deoócitosquesejamaturadoe inseminado
concomitantementecomodosexperimentos
oudarotinado laboratório.Os espermato-
zóidessãomortoscom águatridestiladae
submetidosàcentrifugaçãocomvelocidade
de700a 900xg durante10a 30 minutos.
Posteriormente,o sobrenadanteé retiradoe,
apósseradicionadomeioaopelletresultante
da centrifugação,novacentrifugação,com
igualperíodoevelocidade,érealizada,salien-
tando-sequeesteprocedimentoérepetidopor
maisduasvezes.Apósaúltimacentrifugação,
os espermatozóidessãosuspensosemmeio
naconcentraçãoadequadaparafecundação
(videprotocoloparaPIV embovinos),sendo
entãorealizadaa inseminaçãodosoócitos
previamentematurados.Finalmente,o índi-
cedepartenogêneseé determinadoa partir
da porcentagemdeoócitosclivadosapósa
inseminaçãocomespermatozóidesmortos.
Paraa avaliaçãoda PIV, algunsgrupos
usam,comocritério,o estádiode2-4 célu-
las,todavia,amaioriadoslaboratóriosutiliza
aproduçãodemórulaseblastocistos,consi-
derandoosíndicesdeproduçãoequalidade
embrionária,ressaltando-sequeo índicede
blastocistoexpandidoéoparâmetromaisfi-
dedignodaeficáciadetodooprocessodePIV.
É importanteaindaressaltarqueaavaliação
daqualidadeembrionáriadeembriõespro-
venientesdaPIV segueos mesmosparâme-
trosdaquelautilizadaparaembriõesprodu-
zidosinvivo.No entanto,oembriãoproduzi-
do in vitroapresentaalgumascaracterísticas
morfológicaspeculiares.Porexemplo,móru-
Iasproduzidasin vivoocupamemtornode
60-70%do espaçoperivitelino,enquanto
aquelasproduzidasinvitroocupamatotalida-
214
dedesseespaço.Os embriõesproduzidosin
vitroapresentamblastômerosmaisescurosdo
queosproduzidosinvivo,demonstandouma
maiorquantidadede lipídeos.Em bovinos,
parafrnspráticos,aobtençãodeblastocistos
após8diasdainseminaçãoindicaviabilidade
embrionária.Entretanto,parasedeterminar
a realeficiênciadaPIV, é necessárioqueos
embriõesresultememgestaçõesenascimen-
tosnormais.
Produçãode Embriõesin vitro a
Partir da Punção Folicularin vivo
Guiada por Ultra-som(PF/PIV)
Em 1988,foidescritapelaprimeiravez
atécnicadepunçãofolicular(PF)paraco-
lheitadeoócitosbovinos,porviatransva-
ginal,guiadapelaultra-sonografia(Pieterse
& Kappen,1988).Atualmente,váriosgru-
posvêmutilizando,comsucesso,osprincí-
piosbásicosdessametodologiaparaprodu-
çãoinvitrodeembriõesempesquisasouem
programascomerciais.Namultiplicaçãode
fêmeasdeelevadovalorzootécnico,essatéc-
nicapodeatingirproduçãomédiade25pro-
dutosdeumaúnicafêmeanoperíododeum
ano,fatoquesuperasignificativamenteos
índicesdaTE. A PF podeserrealizadaem
duasseçõessemanaisporalgunsmesessem
prejudicaro futurodesempenhoreproduti-
vo doanimal.Essatécnicapermitea re-
cuperaçãodeoócitosde,aproximadamente,
60%dosfolículospuncionados,obtendo-se,
decadavaca,amédiade14oócitos,2em-
briõese 1gestaçãoporsemana.
ParaserealizaraPF,utiliza-seumasonda
ultra-sonográfica,viavaginal,demaneiraa
obterimagemdoovárioedosfolículos.Os
oócitossãoaspiradospelapunçãodosfolí-
culoscomagulhadelúmensimplesconecta-
daaotubooufiltrodecolheitaporumtubo
deteflonousilicone.O sistemadepunção
podeserusadocomagulhalongadelúmen
duplo,sendoque,nessecaso,alavagemdo
folículoaspiradoé realizadaempregan~oa
bombadevácuo.Os oócitossãoavaliadose
submetidosàmaturação,fecundaçãoecul-
tivoembrionárioatéoestádiodeblastocisto
(dia7-9 apósa inseminaçãoin vitro),está-
diodedesenvolvimentomaisadequadopara
queos embriõessejamtransferidosparaas
receptorasou submetidosà congelação.
A PF/PIV apresentaalgumasdesvanta-
gensrelacionadascom exigênciade uma
equipedetrabalhoaltamenteespecializada,
equipamentosdeelevadocustoecomotem-
ponecessárioparaodesenvolvimentodatéc-
nica,limitandosuaampladifusãoparatraba-
lhosacampo.Alémdessesaspectos,outros
problemascomobaixoíndicedeprodução
in vitrodeembriões,baixaqualidadeecon-
gelabilidadedessasestruturasdecorrentesda
PIV,anormalidadesfetaiscomconseqüentes
problemasdedistociatambémtêmcorrobo-
radoparalimitaçãodeumamaiorutilização
dessatécnica.Emalgunspaíses,comoFran-
ça,EstadosUnidoseAlemanha,existemcen-
trosdePIV querecebemoócitosdepunção
foliculardelocaisdistantes.Essetipodepro-
cedimentoé umaótimaopçãoparadistri-
buiçãodosbenefíciosdessatecnologia,en-
tretanto,<?temporestritodetransporte,du-
ranteo qualooócitopermaneceviáveldesde
apunçãofolicularatéo localdaPIV,tem-se
apresentadocomooutrofator limitantede
expansãodaPE Atualmente,épossívelreali-
zaro transportedosoócitosporumperíodo
deaproximadamente10a 12horas,porém,
o desenvolvimentode uma técnicaviável
depreservaçãodeoócitosimaturos,comto-
dasassuasvantagensintrínsecas,permitirá
maiordifusãodessabiotecnologia.
Eficáciada Metodologia de PIV
NosprotocolosatuaisdePIV,osíndices
dematuração,fecundaçãoe clivagemsão
similaresaosdoprocessoin vivo. No entan-
to,asporcentagensdeblastocistosãosigni-
ficativamenteinferioresnosprocessosin
vitro.Aproximadamente30%dosoócitosque
sãosubmetidosaoprocessodematuração
in vitroalcançamo estádiodeblastocisto,
havendooscilaçõesdessesresultados,varian-
doentre5e60%.Essasvariaçõestêminú-
merascausasquepodemestarrelacionadas
como sêmene suacapacidadederespon-
dera capacitaçãocomheparina,qualidade
ecapacitaçãodooócito,habilidadedotéc-
nico,qualidadedosprodutosempregados
nosmeiosdecultivo,precisãodosequipa-
mentos,entreoutros.Comoéumprocesso
extremamentecomplexo,osresultadossão
geralmentecíclicose osproblemassãode
difícilidentificação.Emgrandeparte,essas
variaçõessãodevidasàexistênciadediferen-
çanopotencialdosoócitosemproduzirblas-
tocistos,apesardeapresentarem-semorfo-
logicamentenormais.
OsembriõesdecorrentesdePIVapresen-
tammenorviabilidade,assimcomoíndices
inferioresdegestaçãoapósatransferência,
tantoafresco(54%)quantocomembriões
congelados(30%),emcomparaçãocomos
produzidosinvivo(frescos=76%oucon-
gelados=67%).Alémdeapresentarem
maiortaxademortalidadeembrionária,os
embriõesPIV resultamemmaioresperdas
perinatais(15%)doqueaTE (9%)eem1%
dasgestaçõesoriundasdeembriõesPIV
ocorrehidroalantóide.Essaincidênciaémui-
tomaiordoquearelaçãodeumcasopara
cada7.500gestaçõesnormais.OsfetosPIV
apresentammaiorcrescimentoeresultamem
maiorpesoaonasceremaiorincidênciadedistocia,sendoautilizaçãodesoronosmeios
decultivoresponsabilizadaporessasanor-
malidadesfetais.
É importanteressaltarqueasmórulas
PIV,emgrandeproporção,nãosecompac-
tameapresentammenosestruturasdeliga-
215
çõesentreosblastômerosdoqueasmóru-
Iasproduzidasinvivo.Amembranadosblas-
tômerosémenoselásticaeablastocelemui-
tasvezesseformaemváriospontosdoem-
brião.Os embriõesPIV atingemo estádio
deblastocistomaisrápidodoqueosem-
briõesproduzidosinvivo.Essaslimitações,
diferençaseproblemasestãoassociadosaos
processosenvolvidoscoma PIV,portanto,
hánecessidadedeampliaro conhecimento
paraotimizarautilizaçãodaPIV.
EstruturaNecessáriapara
Realizaçãoda PIV
A estruturaçãodo laboratóriodePIV,
talvezsejaopontomaisdifícileimportante
nosentidodeeficiência,economia,pratici-
dade,comodidadee controledequalidade
dosfuturostrabalhos.Portanto,antesde
montara estruturadolaboratório,deve-se
realizarumprojetocuidadosoeminucioso,
observandoe avaliandotodososdetalhes
envolvidosnatécnica.Paraa realizaçãoda
PIV,o idealéquesedestineumlocalespe-
cialsomenteparaessafinalidade.Geralmen-
te,laboratóriosdedicadosaoutrostrabalhos
compartilhamespaçoe equipamentosda
PIV,influenciandonegativamenteosresul-
tados.O laboratóriodeveterespaçoffsico
suficienteparasepararapartedeprepara-
çãodosmeios,dosêmen,limpezaeesterili-
zaçãodomaterial,daoutradestinadaparaa
manipulaçãoe cultivodosgametase em-
briões.Olaboratóriodecultivodeveteruma
temperaturamínimade25°C.Oacessodeve
serrestritoaopessoalenvolvidocomo tra-
balhodePIV e serrigorosocomhigienee
assepsia,valendo-sedesistemasdepurifi-
cadoresdeare luzultravioleta.
É recomendávelquea colheitadeoóci-
tosapartirdeováriosdematadouronãoseja
realizadanolaboratóriodemanipulaçãoe
cultivodosgametaseembriõesparapreve-
nir contaminações.O laboratóriodePIV
216
comercialdeveserbemseparadodoscur-
raisdasdoadorasedasreceptorasetambém
teracessocontroladodepessoal,bemcomo
dispensarcuidadoespecialcomasmedidas
profUáticasparaevitarcontaminação.
A estufadecultivoou incubadoradeve
tercontroleautomáticodaatmosferaeca-
pacidadedemantertemperaturaconstante,
o quegeralmenteé obtidoemestufascom
jaquetasdeágua.Asestufasutilizadaspara
maturaçãodosoócitose desenvolvimento
embrionárioemmonocamadadecélulas
somáticasdevemterno mínimocontrole
automáticodeCO2.Nos laboratóriosque
utilizamsistemasdedesenvolvimentoembri-
onáriosemo co-cultivodecélulassomáti-
cas,é necessárioumaestufacomcontrole
simultâneodeCO2,°2eN2(Figura10.10).
-
~"~:~ .'.'~ - j
.
--
."" .
,t~,
"t~
_.~
"'
Figura10.10.Estufaparamaturaçãodeoócitos,fecun-
daçãoe desenvolvimentoembrionário.A
estufada esquerdaé parautilizaçãoem
atmosferacomCO2 emar e a da direita
comCO2, °2 e N2.
No entanto,o custoparagaseificaçãocom
os trêsgases,CO2, °2 e N2,é elevadoem
conseqüênciadoconsumoepreçodoN2.Por
isso, uma alternativatem sido cultivaros
embriõesno interiordedessecadoresgasei-
ficadoscomostrêsgasesmisturadosprevia-
menteempercentagenspredeterminadase
umidadesaturada(Figura10.11).Em qual-
I
Figura10.11. Estufacomcontrolede CO2emar,sendo
utilizadaparadesenvolvimentoembrionário
em atmosferacom CO2, °2 e N2 em des-
secador Note que o gás é aquecido por
sua passagem por umfrasco com água.
queruma'dasopçõesdetrabalho,nãoháne-
cessidadedaaquisiçãodeestufasdegrande
porteporqueaPIV podeserrealizadadefor-
maadequadaemestufasdemédioporte.A
aberturafreqüentedaportadaestufaresulta
emmudançasdrásticasnatemperaturaena
pressãodosgases,sendoqueasestufasde
grandecapacidade,comumasóporta,pos-
suemmaiordificuldadedemantera tempe-
ratura,umidadee a misturadegasesade-
quadano seuinterior.A aberturadaestufa
deveserminimizadaparanãocomprometer
osprocessosdematuraçãodosoócitosede
desenvolvimentodasestruturasembrioná-
rias.Algunslaboratóriosorganizamescalade
rotinaparaqueasestufassejamabertasem
horáriossincronizados.O cultivoemdesse-
cadorestambémtemsidoumaalternativapa-
racultivargametaseembriõesemlaborató-
rioscomrotinaqueexigeaberturasfreqüen-
tesdaportadaestufa.
O sistemadepurificaçãodeáguaé um
fatorfundamentalparaos índicesfinaisda
PIV, tendo emvistaque a qualidadedos
meiosdecultivodependedaqualidadedos
saise,principalmente,daágua.O aparelho
purificadordeveserde boaqualidade,ser
mantidobemconservadoeterseuftltrosubs-
tituídodeformarigorosamenteperiódica,sa-
lientando-sequeaáguautilizadanaPIV deve
estarausentedemicroorganismos,piróge-
nose outrassubstânciastóxicas.Parao la-
boratórioquenãopossuiinfra-estruturade
purificaçãodaágua,acompradeáguapura
podeserumaopção.
Os estereomicroscópiosdevemserdeboa
qualidadee possuirdiferentesaumentos,
sendoqueoaumentomáximodeveserigual
oumaiorque80vezes.Esseaumentomáxi-
mo deveestarrelacionadocomacapacida-
dedaobjetivaenãodo aumentodaocular,
casocontrárionãosetemmaiorresolução.
Por isso,o idealé utilizarocularesde 10
vezes.Deve-seusaraluzfriaetrabalharcom
poucaintensidade,poisassimnãoaquecea
basedalupaeminimizaos efeitosdeletérios
daluzsobreosembriões.Na PIV,o estereo-
microscópioé fundamentalenecessárioem
todasas etapasdasmanipulaçõese avalia-
çõesdosoócitosedosembriões,devendoser
colocadosobresuperfíciefirmee emlocal
confortávelquefacilitea manipulaçãodos
gametase embriões.
O microscópioinvertidoé fundamental
paramanipulaçõesquenecessitemmaiores
aumentose o microscópioequipadocom
contrastedefaseémuitoútilparaostraba-
lhoscomsêmen,oócitoseembriões,permi-
tindo estimara viabilidadeespermática,a
maturaçãonucleareafecundaçãodosoóci-
217

Outros materiais