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mentodessesmecanismosporpermitirauti- lizaçãoda própriaespécieestudadacomo modeloexperimental.Adicionalmente,ela temrespaldadoodesenvolvimentodebiotéc- nicascomoclonagempor transferêncianu- clear,transgênese,sexagemdeespermato- zóideseembriões,preservaçãodeoócitose embriões,alémdaMOIFOPA. Alémdaaplicabilidadenapesquisa,aPIV temsidotambémempregadaem situações especiaisde infertilidadehumanae animal com enfoquesbastant;diferenciados.Na produçãoanimal,particularmentenosbovi- nos,autilizaçãodaPIV aindaélimitadaem funçãodainconsistênciadosresultadosrefe- rentesàstaxasequalidadedemórulaseblas- tocistos,docustoinicialparaconstruçãoda jnfra-estruturaedo tempoconsumidopara executara rotinadeproduçãodeembriões quevaidesdeapunçãofolicularin vivoaté o desenvolvimentoin vitrodeembriões. Principais Etapas da Produção ;n v;fro de Embriões ColheitadeOócitos Os oócitosbovinospodemser obtidos in vitroa partirdepunçãofolicular(Figura 10.1)ou dissecçãofolicular(quandoo nú- merodeovárioséreduzido),emováriospro- venientesdeabatedourosou,invivo,porla- parotomiaoulaparoscopiaviaflancoeainda porlaparoscopiaouultra-sonografiaviatrans- vaginal(Figura10.2).A colheitain vitrode oócitosprovenientesdeabatedourosé,geral- mente,efetuadapormeiodepunçãofolicular comagulhaacopladaaumaseringaoubom- badevácuoe,invivo,atravésdeumaagulha acopladaaumabombadevácuo,guiadapor ultra-sonografiatransvaginal. Nostrabalhosemqueosováriossãopro- venientesdeabatedouros,normalmentesão transportadosemsoluçãosalinaa 0,9%de NaCI aquecidaa 30-35°C.O tempotrans- Figura10.1.Métododecolheitadeoócitosinvitro.Osfo- lículosentre2 e 8 mmestãosendopunciona- doscomo auxíliode umabombadevácuo. ri...,~ i ..~.. ,f. :11 ... Figura10.2.Métodode colheitade oócitosin vivopor ultra-sonografiaviatransvaginal.No painel A, estásendorealizadaa colheitaviatrans- vaginal,estandonodetalheo transdutore a agulhaparaaspiraçãofolicular.No painel B,estãosendodemonstradososfolículosna telado ultra-som,enquantoa bombade vácuomostrandoaproximadamente30 mm de Hg, no painelC, e os oócitosobtidos pelaaspiraçãonopainelD. corridoentreaobtençãodosovárioseo iní- ciodacolheitavariaentregruposdepesqui- sa,masnãopareceafetaraviabilidadedos oócitosquandorealizadono períododeaté 3 horas.No laboratório,osováriossãolava- dos com novasoluçãosalina,aquecidana mesmatemperaturadetransporteeconten- doantibióticos(100VI depenicilinae50/lg 197 Célulasmuraldagranulosa Antrofolicularcomlíquido deestreptomicina/ml).Emalguns laboratórios,osováriossãodesin- fetadoscomálcoola70oGL.Com agulhadecalibre18G,osfolícu- los,medindoentre2 e8 mmde diâmetro,sãoaspiradoscom bombadevácuo,ajustadapara aspirarumvolumede10mlde líquidoporminuto,pressãoque nãocomprometea quantidade, qualidadeeposteriorviabilidade dosoócitos. PrincípiosBásicosda Maturação in yitrodeOócitos O oócito,no interiordofolículo,estáen- voltopor célulasdagranulosa,formandoo complexocumulus-oócito(CCO). O con- juntodecélulaspróximasdazonapelúcida, queestãoemíntimocontatocomo oócito porjunçõesintercomunicantesédenomina- dodecoronaradiata.Essascélulasdocumu- lustêmfunçãodiferenciadadaquelaspresen- tesna muraldo folículoemconseqüência doseuíntimocontatocomo oócito(Figura 10.3).Substânciasreguladorasproduzidas pelooócitotêmfunçãoimportantenaativi- dadedascélulasdo cumuluse, da mesma maneira,componentesdessascélulassomáti- castêmparticipaçãoativanomecanismode crescimentoematuraçãodosoócitos.Apesar dascélulasdocumulusnãoseremessenciais paramaturaçãodosoócitos,melhoresresul- tadosdematuração,fecundaçãoededesen- volvimentoembrionáriosãoalcançadosna presençadessetipocelular,fatoqueeviden- ciaaimportânciadascélulasdocumulusna maturaçãodo oócitoin vitro. Característicasmacroscópicasdofolículo sãoimportantesparadeterminaropotencial de maturaçãonucleare citoplasmáticado oócito.Oócitospresentesemfolículosmeno- resque2 mmdediâmetro,geralmentenão sãocompetentesparareiniciarema meiose, 198 Teca externa Teca interna Corona radiata Oócito Zona Pelúcida . Cumulus oophorus ~C ... r. Figura 10.3. Estruturasovarianasobservadasem bovinos. No painelA, estãosendo indicados, par se- taspretas,os folículosterciáriosde diferentes tamanhose par setabranca, umcarpa lúteo emumováriobovino.No painelB, estárepre- sentadoesquematicamenteumfolículoterciá- rio. No painel C, está sendo apresentado umcomplexocumulus-oácitobovino, indican- do o cumulusoophorus(setabranca),carona radiata Isetapreta)e oócito (setaazul). enquantoqueumaelevadapercentagemde folículosmaioresdo que8 mmjá estãoem processodeatresiaouapresentamoócitosem processode maturação,ressaltando-seque emambososcasos,aviabilidadedosoócitos encontra-secomprometidaparaPIV. Contu- do, deveser consideradaa diferençaentre folículosdominantesesubordinadosquepa- receterreflexosobreacapacidadedooócito emprogrediratéa clivageme sustentaro desenvolvimentoembrionário.Oócitosaspi- radosde folículosum poucoantesdo pico ovulatóriodohormônioluteinizante(LH) têm maior capacidadede desenvolvimentoaté blastocistodoqueaquelescomdiâmetroen- tre2 e6mm.Provavelmente,apermanência dooócitono folículodesdeadivergênciafo- licularatéaovulaçãoéimportanteparacom- pletaro fenômenodenominadode capa- citaçãodooócito.Naprática,osfolículosen- tre2e8mmtêmsidoutilizadosparamatura- çãoinvitroemdecorrênciadonúmerodispo- nívelnoovárioedadificuldadededeterminar osoócitosqueestãocapacitadosantesdafe- cundação.Métodoseficazesparacapacitação deoócitosin vitrodevemserdesenvolvidos paraincrementarosíndicesdeproduçãode embriões. O oócitopodeteroseupotencialdema- turação,fecundaçãoecapacidadededesen- volvimentoembrionárioestimadopelaapa- rênciadoCCO. Morfologicamente,osoóci- toscommaiorpotencialdeviabilidadedevem apresentarooplasmahomogêneocomgra- nulaçõesfinas,decoloraçãomarromecom- pletamenteenvolvidosporváriascamadasde célulasdocumulusdispostasdeformacom- pacta(FiguralO.4A).Entretanto,hágrandes variaçõesquantoaospadrõesmorfológicos dequalidadedeoócitoentreasespécies.Por exemplo,oócitosviáveisdecamundongoapre- sentamoooplasmaclaro,quasesemgranula- ções,enquantoqueemeqüinos,suínosecães, observa-seooplasmaescuroeasgranulações podemapresentar-sedeformaheterogênea. Váriasclassificaçõesmorfológicastêmsido adotadasparaselecionaroócitosbovinosna tentativadeidentificarosdemaiorviabilida- de. Nestecapítulo,estásendoapresentada umaadaptaçãodaproposiçãode Leibfried & First (1979),classificaçãocomescalade 1a4,considerandoascaracterísticasdocu- mulus(coberturadooócito)edo citoplasma do oócito(ooplasma): .. .iif - Figura 10.4.Oócitosimaturoscomo cumuluscompacto (AI e maturoscom o cumulusexpandido (BI. Qualidade1:Cumuluscompactopresente, contendpmaisdetrêscamadasdecélu- las.Ooplasmacomgranulaçõesfinase homogêneas,preenchendoointeriorda zonapelúcidaedecoloraçãomarrom. Qualidade2: Cumuluscompactoparcial- mentepresenteemvoltado oócitoou rodeandocompletamenteooócito,com menosde3 camadascelulares.Ooplas- ma,comgranulaçõesdistribuídashete- rogeneamente,podendoestarmaiscon- centradasnocentroemaisclarasnape- riferiaou condensadasemumsó-local aparentandoumamanchaescura.O ooplasmapreencheoespaçodointerior dazonapelúcida. Qualidade3:Cumuluspresente,masexpan- dido.Ooplasmacontraído,comespaço entreamembranacelulareazonapelú- cida,preenchendoirregularmenteoes- paçoperivitelino,degenerado,vacuoli- zadoou fragmentado. Qualidade4:Oócitodesnudosemcumulus. A maturaçãodo oócito,envolvendoas transformaçõesnuclearecitoplasmática,está ligadaa umasériedemudançasestruturais ebioquímicasquetornamogametafeminino aptoa serfecundadoeterdesenvolvimento embrionáriosubseqüente.In vivo,essepro- cessoteminício, coincidentemente,como pico pré-ovulatóriode LH duranteo estro e, in vitro,coma simplesretiradadooócito dofolículo.A maturaçãonucleardooócitobo- vinorequerde 18a 22 horasecompreende aprogressãodoestádiodediplótenodapri-meiraprófasemeióticaatéafasedemetáfa- se11.O períodonecessárioparamaturação nuclearvariaentreasespécies.A cinéticades- seprocesso,embovinosecamundongos,está apresentadanatabela10.2. Concomitantecomamaturaçãonuclear, o oócitosofremodificaçõescitoplasmáticas 199 essenciaisparafecundaçãomonospérmicae subseqüentedesenvolvimentoembrionário. Ao iniciaroprocessodematuração,atrans- criçãodegenesnecessáriosparasíntesede proteínasduranteamaturaçãoeo iníciodo desenvolvimentoembrionárioé cessada. Nesseperíodo,ocorremsignificantesmodifi- caçõesnasínteseprotéicaqueafetamocom- pletoprocessode maturaçãodo oócito.A modulaçãoda sínteseprotéicaé observada simultaneamentecomareorganizaçãodeor- ganelascitoplasmáticas.Modificaçõesem número,tamanhoelouposiçãodasorgane- Iascitoplasmáticastêmsidodescritasemoó- citosdemamíferos.Na reestruturaçãocito- plasmática,a maioriadasorganelasmigra parao centrodacélula.Por exemplo,mito- côndriassãolocalizadasperifericamenteem oócitoimaturoemaiscentralemoócitoma- turo,noentanto,osgrânuloscorticais(GCs), associadoscomumsegmentodoretículoen- doplasmáticoliso,permanecempróximosa periferiada célula.Após o início da matu- raçãodooócitodasespéciesruminanteehu- mana,ocorreum aumentodo númerode GCs. Nessasespécies,o númerodeGCs é significativamentemaioremoócitosapóso rompimentodavesículagerminativadoque naquelesemestádiodevesículagerminativa (Cran, 1989;Sathananthan& Trounson, 1982;Fairetal., 1997).Todavia,o número deGCsemcamundongoésignificativamente reduzidonosoócitosemMIl devidoa pre- maturaexocitoseduranteamaturação(Du- cibellaetal.,1990).O indicadormaisfactual dacompletamaturaçãonuclearecitoplasmá- ticaéacapacidadedo oócitoserfecundado edesenvolveratéembrião. Duranteamaturaçãonuclearecitoplas- mática,ascélulassomáticasqueenvolvemo oócitotambémsofremsignificativasmodi- ficações.As célulasda granulosa,tantoda muralquantodocumulus,parecemdesem- penharimportantesfunçõesno crescimen- 200 to,divisãomeióticae maturaçãocitoplas- máticadooócito.Ascélulasdocumulus,mas nãoasdamural,tornam-sesuspensasem umamatrizdemucoduranteamaturação, permanecendoseparadasemconseqüência doacúmulodessemucoricoemácidohialu- rônico.Hormôniosendógenosefatorespro- duzidospelooócitoestimulama síntesede ácidohialurônico,pelascélulasdocumulus, induzindoamucificaçãoouexpansãodocu- mulusduranteoperíododematuração(Fi- gura10AB).A comunicaçãoentreascélulas documuluseooócitotemsidodemonstrada emCCOsdediversasespéciesanimais.Essas junçõesintercomunicantesentreascélulas somáticaseooócitoparecemserimportan- tesparaapassagemdenutrientesecompo- nentesquímicosreguladoresdamaturação dooócito. Tabela10.2. Cinéticadamaluroçõonuclearem bovinose camundongos. Estãorelaaonodasospenadosnecessáriosporoos oócitos atingiremosestódiosderompimentodavesículogerminativa (RVG), metófaseI (MI), anófoseI (AI), telófoseI (TI) e metáfose11(MIIJ, opós reiniciarema divisãomeiótica. ~ Regulaçãoda Maturaçãode Oócitos Antesdeabordarespecificamenteospro- cessosin vitro,serãodiscutidosalgunsfato- res,mecanismose princípiosfundamentais paraamaturaçãodeoócitos.O oócitopre- sentenofolículoprimordial,umavezativado, devecresceresofrerváriasmodificaçõesde ordemultraestrutural,citoesqueléticaebio- químicacomafinalidadedesetornarcom- petenteparareiniciarecompletaramatura- ção meiótica.Oócitos incompetentessão EstádiodaDivisão Bovino Camundongo Meiótico Horas Horas RVG 8-12 2.3 MI 12-15 6-9 AI/TI 15.18 10-13 Mil 18-22 13-14 Fosfatasecdc25 ~ Tre14-P Inativa Figura10.5.AtivaçãodoMPFdurantea maturaçãodooócito. deficientesemRNAs mensageirosquecodi- ficamparao fatorintracelularpromotorda fase-M(MPF). Enzimasquinasesefosfata- sesestãoenvolvidasnoreinícioenacompleta maturaçãomeióticadooócito(Figura10.5). Oócitosemfasedecrescimentoapresentam nívelmuitobaixodep34cdc2enãosãocapazes deprogrediremdafaseG2(intervaloentrea síntesedeDNA edivisãocelular)paraa M (divisãocelular,meiose).No finaldafasede crescimento,aconcentraçãoeaatividadede p34cdc2estáaumentadaeo oócitoalcançaa competênciameiótica. O MPF écompostodeduassubunidades, sendoumacatalítica,constituídaporumapro- teínade34kD, ap34cdc2(controledadivisão celular),eumareguladora,formadaporuma proteínade45kD, aciclinaB.Emsuaforma inativa,a p34cdc2é fosforiladaemtreonina 161,treonina14etirosina15.Paraserativa- da,essasubunidadecatalíticadeveserdesfos- foriladaemtreonina14etirosina15pelafos- fatasecdc25.O MPF apresentaforteafInida- depelahistonaH 1quinasecomosubstrato, a qualtemsidoutilizadaparademonstrara atividadedoMPE Emoócitosbovinos,ahis- tonaH 1quinaseestáembaixonívelnoestádio devesículagerminativae,subseqüentemente, Tre14 Ativa ocorreaumentogradativo,atingindoomáxi- monoestádiodemetáfaseI (MI). Apósesse pico,osníveisdehistonaH 1quinase(ativida- dedeMPF) têmdiminuiçãoabrupta,coinci- dindocomosestádiosdeanáfaseI (AI) ete- . lófaseI (TI). Um outroaumentonaatividade doMPF éobservadoemMIl. Essesníveisele- vadossãomantidosváriashorasapósama- turaçãodo oócitoe, gradativamente,dimi- nuemapós30horasdamaturaçãoou,abrup- tamente,nafecundaçãoouativaçãodooócito (Figura10.6). Emmamíferos,existemevidênciasdeque várioseventosduranteamaturaçãodeoócitos ocorremtambémsoba regulaçãoda MAP quinase(MAPK -mitogen-activateproteinki- nase)tambémdenominadadeERK (extracel- lularregulatedkinase).A MAPK éativadaem conseqüênciadafosforilaçãoemresíduoses- pecíficosdetirosinaetreoninaduranteama- turaçãodeoócitos.Emmurinos,duasisofor- mesdeMAPK, p42-ERK2 (42kDa)ep44- ERKl (44kDa),foramidentificadas.Embo- vinos,a MAPK éativadano rompimentoda vesículagerminativa(VG),atingeaatividade máximaemMI e permaneceelevadaatéa formaçãodospronúcleos,nãodiminuindoem MIl. EssesachadossugeremqueaMAPK é 201 LI.. Q. :E C1) "Ceu "C "S; ;;« FecundaçãoouAtivação t o 8 12 14 16 18 19 20 24 Maturaçãodo Oócito (h) 26 30 48 Figura10.6.AtividadedoMPFmedidopelaatividadedahistonaH1quinasedurantea maturaçãodeoócitosbovinos. O MPF alcançaa maioratividadenoestádiodeMI, diminuinodeAI e TI,aumentanovamenteemMil e, finalmente,diminuiapósa fecundação,ativaçãoouapós30 horasde maturaçãoIWu etai., 1997; Liu& Yang,1999). FecundaçãoouAtivação ! ~ 11. ~ :!E Q) 'C ca 'C "S: ;: ~ o 9 12 15 20 24 26 35 36 38 44 MaturaçãodeOócito(h) Figura1OI Atividadeda MAPKdurantea maturaçãodeoócitosbovinos.A atividadedaMAPKaumentanomomento do rompimentoda VG, atingea maioratividadeemMI e permaneceelevadaatéa formaçãodospronú- cleos(Fissoreetai., 1996; Liu& Yang,1999) '}f\'} importanteparamantero oócitoemMIl e entrareminterfase(Figura10.7). aócitos competentesreiniciam,in vivo, aprimeiradivisãomeióticacoincidentemente apóso pico ovulatóriode LH, entretanto, aindanãoestácomprovadoseo LH éo res- ponsávelpeloreiníciodameioseembovinos. Váriasseqüênciasnesseprocesso,desdeo desencadeamentodoRVG atéobloqueioem MIl, nãosãocompletamenteelucidadas.Por exemplo,nãoéconhecidoosinalquedesen- .cadeiaa ativaçãodo MPF edaMAPK, rei- niciandoameioseemoócitosdemamíferos. a oócitodemuitasespéciesé mantidoem G2 peloAMPc quetemfunçãoinibitóriana maturaçãonucleardeoócitosdecamundon- go, bovinoe suíno,masnãodeovino.Em bovinos,oAMPc induzinibiçãotemporaria- mentecurtana vesículagerminativa,não impedindoa progressãoatéMI. Após maturação,os oócitossãomanti- dosemMIl atéa fecundaçãoou aativação partenogenética.Existemevidênciasqueos oócitossãomantidosemMIl por açãode fatorescitostáticos(CSF) quesãocapazes de mantera atividadeelevadado MPE O CSF écompostopor MAPK ec-mosproto- oncogene(Mosquinase).Moséumaserina/ treoninaquinaseencontradasomentenoes- tádiodeMIl emoócitosbovinoseéumati- vadordaMAPK. Em camundongo,oócitos deficientesemMos quinasenãopermanece emMIl. Assim,inúmeroshormônios,fosfa- tasesequinasesestãoenvolvidosnoprocesso deregulaçãodamaturaçãodeoócitosbovi- nos,processoquenãoestácompletamente elucidado.aconhecimentobásicodesses mecanismoséfundamentalparasealcançar a eficiênciamáximanos procedimentosde produçãodeembriõesin vitro. Maturaçãoin vitrodeOócitos Umagrandevariedadedemeiostemsido utilizadaparamaturaçãoin vitrodeoócitos, todavia,a maioriadasequipesutiliza,como meiobase,oTCM -199comsaisdeEARLE. Essemeioémodificadoconformearotinade cadalaboratório,geralmente,éadicionadoL- gh.\,tamina,bicarbonatode sódio,HEPES, piruvatodesódioe hormônios.Em relação aoshormônios,é usuala utilizaçãodoLH, oudoFSH ouaindaacombinaçãodessasgo- nadotrofinas.Há controvérsiasquantoàreal necessidadedesseshormôniose quantoàs concentraçõesa seremutilizadas,porém,a maioriadosresultadosdemonstramqueaadi- çãodegonadotrofinasaomeiodematuração deoócitosbovinosaumentaacapacidadede fecundaçãodo oócitoemelhorao posterior desenvolvimentoembrionário.Algunslabora- tóriostambémutilizamestradiol17-~,mas naatualidade,amaiorianãoadicionaessees- teróidenosmeiosdematuração,principal- mentenosprotocolosqueutilizamóleopara impediraevaporaçãodeáguadomeiodecul- tivo.Tendoemvistaqueosesteróidessãohi- drofóbicos,a tendênciadesseshormôniosé migraremparaoóleoempoucosminutosde cultivo.A adiçãodosoroaomeiodematura- çãotemsidosugeridacomoumdosrequisitos parasealcançara perfeitaexpansãodo cu- muluseamaturaçãodooócito.Melhoresín- dicesdedivagemtêmsidodescritoscomsoro devacaemestro(SVE), contudo,existem inúmeroscomponentesdosoroquepoderão afetarpositivaenegativamenteosresultados in vitro.Por isso,é necessáriotestarcada partidadesoroantesdecolocá-Ianarotina daproduçãoin vitro.Alémdo meio,outros fatoresrelacionadoscomoambientedeculti- vocelulardevemserconsideradoscomofun- damentaisparaodesenvolvimentoembrioná- rio. Paraisso,énecessáriaestufaquemante- nhaprecisamenteaatmosferagasosaetempe- raturaconstantes.Geralmente,amaturação deoócitosbovinosérealizadaa39°Cpor24 horasematmosferade5%deca2 emar e umidadesaturada. 203 PrincípiosBásicosdaCapacitaçãoEspermática, ReaçãodeAcrossomoe Fecundação. ~ CapacitaçãoEspermática O espermatozóideéfuncionalmenteima- turo,infértile imóvelenquantopermanece notestículo,somenteadquirindocapacidade defecundarnoepidídimo.A maiorpartedas mudançasqueocorremnoepidídimoestáre- lacionadacoma aquisiçãodamotilidadee, emgraumenor,comamorfologiaemetabo- lismo.A maturação€ umreflexodemuitas modificaçõesbioquímicasdoespermatozói- dee,dentreessastransformações,pode-se afirmarqueocorreestabilizaçãodacromati- naedasestruturasdacabeçaecauda,estabi- lizaçãodamembranaplasmáticapelaabsor- çãoe/ouintegraçãodeglicoproteínasepidi- dimárias,aquisiçãodomovimentoprogressi- voehabilidadeparaligar-seàzonapelúcida. Os espermatozóides,quandoem contato comoplasmaseminal(glicoproteínasoupo- lipeptídeos,incluindofatoresdecapacitan- tes),sofremincorporaçõesemodificaçõesde váriassubstânciasda suasuperfíciequeos tornamincapazesdefecundar.Essefenôme- no bioquímicoé denominadodedecapaci- taçãoespermática. A capacitaçãoespermáticaé de funda- mentalimportânciaparaqueosespermato- zóidestornem-seaptosparafecundarinvivo. Esseprocessoocorreno tratogenitalfemi- ninopelaremoçãodecomponentesdecapa- citantes,semmodificaçõesmorfológicas, masbioquímicas,queresultamemdesesta- bilização(fluidez)damembranaplasmática ehiperativaçãoespermática,essenciaispara queocorramareaçãodoacrossomoeape- netraçãodo espermatozóideno oócito. Algumasglicosaminoglicanaspresentesno tratogenitalfemininosãoresponsabilizadas por induzirema capacitaçãoespermáticain vivo.Nosprocessosinvitro,umaglicosamino- glicana,a heparina,temsidoutilizadapara capacitarespermatozóidesembovinos.Ome- 204 canismopeloqualaheparinaatuanacapacita- çãoespermáticanãoécompletamenteconhe- cido,todavia,pareceestarenvolvidono de- sencadeamentodemudançasbioquímicasna membranaplasmáticado espermatozóide. Sualigaçãocomoespermatozóideémediada, provavelmente,porproteínas,comoaproteína carreadoradeheparina(HBP), presentesno plasmaseminaldetouros. Existevariaçãoindividualentretouros quantoàconcentraçãodeheparinanecessária paraacapacitaçãoespermática.A concentra- çãoidealdeheparinavariade2 a 100~g/ml demeio,dependendodotouroedoprocesso deseparaçãoespermática.Há evidênciasde queespermatozóidesseparadospelogradien- tedepercolnecessitammenorconcentração de heparinado queaquelesseparadospor swimup.A concentraçãomaiseficiente,nos diferentesprocessoseparaosdiferentestou- ros,estáemtornode10~g/mldemeio.No entanto,é adequado,semprequepossível, determinaraconcentraçãoidealparaosêmen quevaiserutilizadonarotinadolaboratório. Emcasosdeproduçãoinvitrocomercial,esse procedimentonemsempreépossívelemcon- seqüênciado custoe/ou da disponibilidade dedosesdesêmenpararealizaroteste.Atual- mente,aheparinaéaglicosaminoglicanamais utilizadaparacapacitarespermatozóidespara fecundaçãoin vitro. ~ Reação do Acrossomo Na presençadecálcioextracelular,o es- permatozóidecapacitadotemahabilidadede seligaràzonapelúcidado oócitoesofrera reaçãoacrossomática.Paraqueo esperma- tozóidepenetrenazonapelúcidaesefusione comamembranaplasmáticadooócitoéne- cessáriocompletara reaçãoacrossomática. A reaçãodeacrossomoenvolveasegmenta- çãoprogressivadoacrossomoea fusãodas membranasplasmáticaeacrossomática,for- mandovesículasepermitindoaliberaçãode enzimaseaexposiçãodamembranainterna eperforatorium.A liberaçãodessasenzimas éimportanteparaapenetraçãodoesperma- tozóidee a fecundaçãodo oócito.A perda completadoacrossomoocorrecomapene- traçãodoespermatozóidenazonapelúcida. ~ Fecundação A ligaçãodo espermatozóideao oócitoé mediadaporreceptoresespermáticosespécie- específicospresentesna zonapelúcida.As glicoproteínasconstituintesdazonapelúcida, identificadasinicialmenteemcamundongos sãodenominadasde ZPl, ZP2 e ZP3 que apresentamimportantesfunçõesnafecunda- ção.A ZPl tem,basicamente,papelestrutu- ral,enquantotemsidoatribuídaa funçãode receptorsecundárioàZP2 ereceptorprimá- rioàZP3, sendoqueaZP3 temsidorespon- sabilizadapelareaçãodoacrossomo.O esper- matozóidepenetrana zona pelúcidapelas açõesenzimáticase mecânicas.A reação acrossomáticapermitealiberaçãodeenzimas quedigeremamatrizdazonapelúcidaeex- põeo perforatoriumparaa penetraçãodo espermatozóidena zonapelúcidaauxiliada pelasuamotilidade.A fusãodooócitocomo espermatozóideocorreapósa penetração, especificamentepelocontatoentreosegmen- toequatorialdoespermatozóideeamembra- naplasmáticadooócito.A membranavitelina (membranaplasmáticado oócito)participa ativamentenesseprocessoe,dessaforma,o espermatozóideéincorporadopeloooplasma. O oócitoativadopeloespermatozóiderespon- de inicialmentecom a despolarizaçãoda membranaplasmática,lúdrólisedofosfatidili- nositolbifosfato(PIP2),aumentodasoscila- çõesintracelularesde cálcio,exocitosedos grânuloscorticais,aumentodopH inti:'acelu- laredasínteseprotéica. Paraimpedirapenetraçãodemaisdeum espermatozóide,ocorreobloqueioprimário dapolispermiaqueédevidoàrápidadespo- larizaçãodamembranaplasmáticadooócito apósafecundação,denominadodebloqueio vitelínico.O bloqueiosecundárioresultada reaçãocorticaloutambémdenominadade reaçãodazona,apósapenetraçãoespermáti- caqueenvolveafusãodamembranaplasmá- ticadooócitocomamembranadosgrânulos corticais.Essafusãoépropagadacomouma onda,envolvendotodaasuperfíciedooócito, apartirdopontodafusãoespermatozóide- oócito.O conteúdodosgrânuloscorticais, comoenzimashidrolíticas,proteinasesepe- roxidases,édepositadonoespaçoperiviteli- no,provocandohidróliseparcialdasproteí- nasdazonapelúcida,sendotransformadas emZPIF, ZP2F eZP3F.Os sacarídeosda zonapelúcidatambémsofremalteraçõespor açãodasglicosidasesliberadasdosgrânulos corticais.Comessasmodificações,a zona pelúcidaperdereceptoresespermáticose torna-semaisresistenteàdigestãoenzimáti- ca,impedindoapenetraçãodeoutrosesper- matozóidesqueprovocariampolispermiae impediriamaclivagemeodesenvolvimento embrionário. Apósapenetraçãoespermática,ocorrea segundadivisãomeióticaeoscromossomos quepermaneceramnooócitosãoenvolvidospor umamembrananuclear,formandoo pró-núcleofeminino.Deformaconcomitan- te,amembrananucleardoespermatozóide sedesintegra,a cromatinanucleardescon- densapelaremoçãodeproteínasnucleares espermáticasespecíficaseocorrea forma- çãodenovamembrananuclearqueenvolve oscromossomospaternos,formandoopró- núcleomasculino.SínteseativadeDNA e transcriçãodeRNA,comsíntesedenovas proteínassãoobservadasdurantea forma- çãodospronúcleos.Duranteo desenvolvi- mentodospronúcleosmasculinoefemini- no,hámigraçãoparaocentrodoooplasma. Osmicroftlamentospresentesnocórtexdo oócitosãoessenciaisparaa migraçãodos 205 pronúcleosparao centrodocitoplasmado oócito.Nocentrodoooplasmaocorreasin- gamia,ospronúcleossedesintegrame os cromossomosseassociamparaa primeira divisãomitótica.Como completoprocesso dafecundação,observa-sequeoscromos- somospaternosematernostornam-seasso- ciadoseconsidera-sequeodesenvolvimen- toembrionárioteminíciocomumgenoma estabelecido. PreparaçãoEspermáticaeFecundaçãoinvitro ~ Métodosde SeparaçãoEspermática paraFecundaçãoin vitro Astécnicasmaisutilizadasparaseparação deespermatozóidesvivosdosdemaiscom- ponentesdosêmenedoscrioprotetoressão oswimup,o gradientedepercoleo lavado espermático.A técnicaidealparaseparação espermáticadeveserrápida,simples,debai- xo custo,capazderecuperara maioriados espermatozóidesmóveis,nãoresultaremal- teraçõesespermáticas,removerespermato- zóidesmortoseoutrascélulas,incluindomi- croorganismos,removersubstânciastóxicas e bioativas,permitiro processamentode grandesvolumesdesêmen,alémdepermitir ocontroledaconcentraçãoevolumefinalda suspensãoespermática. Noswimup,osespermatozóidesvivossão separadosdosmortos,do plasmaseminale doscomponentesdosdiluidorespelamotili- dadeascendente.Esseprocessoconsisteem depositarde200a500l.tIdesêmennofundo detubosdecentrífugacontendoentre1e2 ml deSP-TALP(videpreparaçãodosmeiospara PIV) paraqueo sêmenpermaneçanofundo dotubocobertopelomeioSP-TALP.Em se- guida,essestubossãocolocados,comincli- naçãoparaformaro ângulode45°,emam- bientea39°Cealgunslaboratóriosincubam o sêmenemestufacomatmosferade5%de ca2 emar e umidadesaturada,permitindo queosespermatozóidesmigremparaaposi- 206 ./ çãosuperiordomeioeosdemaisconstituin- tesdosêmenpermaneçamnofundodotubo. Numasegundaetapa,osobrenadanteéaspi- rado de formaa nãopermitirquecompo- nentesdosêmenpresentesno fundodotubo entrememcontatocomosespermatozóides e,emseguida,essaamostraétransferidapara outrotubocomafinalidadedesercentrifuga- da a rotaçãode 700a 900xg por 10a 30 minutos.Posteriormente,despreza-seo so- brenadante,adiciona-se4 ml deSP-TALP e seprocedenovacentrifugaçãoporigualperío- doerotação.Aopelletresultantedasegunda centrifugação,adiciona-seFERT-TALP (vide preparaçãodosmeiosparaPIV) paraobtera concentraçãofinalde 1 a 2 x 106esperma- tozóides/mlnecessáriaparafecundação(vide fecundaçãoin vitro). Na separaçãoespermáticacomo perco!, o sêmenécentrifugadoatravésdapassagem por diferentesgradientesparapermitira se- paraçãodosespermatozóidesvivosdosde- maisconstituintesdosêmen,baseadona di- ferençadedensidade.a percolécomposto porpartículasdesilicacoloidalcobertocom polivinilpirrolidona,preparadoemdiferentes concentraçõesparaformarumgradientene- cessáriodeseparaçãoespermática.Paradi- luiçãodoperco!,o meioSP-TALP teráseus saisconcentradosnaproporçãode10vezes. Comessemeio,prepara-seumasoluçãode percol90%.Uma outrasoluçãode percol 45%épreparadaapartirdadiluiçãodoper- co190%comSP-TALP Ix naproporçãode. 1:1.No fundodeumtubodeensaioécolo- cado2 mldasoluçãodepercol90%esobre essasolução,adiciona-se,lentamente,2 ml de percol45%,sempermitirhomogeniza- çãoentreasduassoluções.a conteúdode umapalhetadesêmendescongelado(500Jll) é depositado na superfície da solução depercol45%e,a seguir,écentrifugadoa 700xgpor30minutos(Figura10.8).Após Di!uidor Perco!a45% EspermatozóidesnãoviáveisemPerco!a45% a centrifugação,o sobrenadanteé removi- doe os espermatozóidessãosuspensosem 500l.tIdeFert-TALP. ~ Fecundaçãoin vifro Apósamaturaçãodosoócitose separa- ção dos espermatozóidesviáveis,deve-se proporcionarum ambienteadequadopara queocorraa capacitaçãoespermáticae a fecundação.Esseambientedevepermitiro metabolismodosoócitosecélulasdocumu- lusemantera funçãoespermáticaeficiente. Paraessafinalidade,o meiomaisutilizadoé o FERT-TALP contendoheparinaparaca- pacitaçãoespermática.Oco-cultivo (esper- matozoideseoócitos)érealizadoporumpe- ~ ~ ~ ~ ~ Perco!a90% ríodoentre18e22 horas,a umatempera- turade39°C,emumaatmosferade5%de CO2emareumidadesaturada.Osesperma- tozóidessãoadicionadosàsgotasdefecun- daçãocontendoosoócitosemumaconcen- traçãofinalquepodevariardelxl06a Ixl07 espermatozóides/mldemeio.A concentra- çãofinalmaisutilizadaparafecundaçãoin vitroéde2x 106espermatozóides/ml.A adi- çãodePHE (penicilamina,hipotaurina,epi- nefrina)ao meioFert-TALPtemsidoutili- zadaporalgunslaboratórioscomafinalidade deaumentaraatividadeespermáticae faci- litarasuapenetração,incrementandoosÍn- dicesdefecundação(videProtocolodePIV embovinos). EspermatozóidesvivosemPerco!a90% Figura 108 - Distribuiçãodossegmentosdo sêmennasdiferentescamadasde percolapóscentrifugação.. PrincípiosBásicosdo Desenvolvimento EmbrionárioPrecoce ~ Clivagem Ao finaldasingamia,origina-seo zigoto comnovoarranjocitoplasmáticoecomeçaa formaçãodeumorganismomulticelularcom outropotencialgenético.Nessafase,teminÍ- cioumasériededivisõesmitóticas,pormeio dasquaisozigoto,quepossuiumacélulacom grandevolume,sedivideemnumerosascé- lulasnucleadasdemenortamanhoatéafor- maçãodoblastocisto(Figura10.9).Essepro- 207 cessoéconhecidocomoclivagemeascélu- Iasresultantesdaclivagemsãodenominadas deblastômeros. r::~;;;"~,.' 11' Figura 10.9.Blastocistoproduzidoinvitroemestádiode eclosãoIA) eeclodido(Bj. Emmuitasespécies,ogenomadozigoto nãotemcontrolesobreasfasesembrionárias iniciaiseasprimeirasclivagenssãocontro- ladaspeloRNAmmatemopresentenooóci- to,entretanto,nosmamíferos,ogenomaem- brionáriocomeçaatranscriçãonasfasesini- ciaisdaclivagem.A ativaçãodogenomaem- brionárionocamundongoocorrenoestádio deduascélulas,nosuínonodequatrocélu- lasenobovinoeovinoduranteo estádiode oitocélulas.A clivagemnosmamíferosédo tipoholoblásticarotacional,todavia,porexis- tir umapeculiaridadedaclivagemnosma- míferos,aprimeiradivisãocelularocorrede formameridional,enquantona segunda, umadascélulassofredivisãomeridionalea outraequatorial.A clivagemnasespéciesma- míferasocorredeformabemmaislentado queemoutrasespéciesanimais,poiséco- mumqueoembriãodemamíferoscontenha númeroímpardecélulas,sendoessaoutra característicadaclivagemporqueasprimei- rasdivisõessãoassíncronas,ouseja,osblas- tômerosnãosedividemsimultaneamente. ~ Compactaçãoe FormaçãodaBlastocele Nosanimaisdomésticosedelaboratório ocorreofenômenodacompactaçãodosblas- tômeros,osquaisparecemperdersuasiden- tidadeseformarumaúnicamassacelular. Essefenômenodacompactaçãocriacircuns- tânciasqueinduzema primeiradiferencia- 208 çãoemmamíferosqueéa formaçãodotro- foblastoe do embrioblasto.É bemprovável quea compactaçãosejamediadapor even- tosnasuperfíciedeblastômerosadjacentes. Os blastômerosinteragemparasuportara polarizaçãodamembranaduranteacompac- tação. Em camundongo,a compactação ocorrejá no estádiode 8 célulasenquanto queembovinoeovinoem32células.Ospri- meiroseventosqueocorremcomoembrião sãomarcadospordiferenciaçãonasinterliga- çõesentreosblastômeros,comformaçãodas ligaçõesincipientesfirmeseligaçõesdotipo "gap"Gunçõesintercomunicantes),quevão, emúltimainstância,formaro trofoblasto,a blastoceleeo embrioblasto.A diferenciação dascélulasembrionáriasemcélulasdotrofo- blastoouemcélulasdoembrioblastoédeter- minadapelassuasposiçõesna fasedemó- rola,ouseja,ascélulasdointeriordamórula vãodarorigemàs célulasdo embrioblasto, enquantoqueasdaperiferiadãoorigemàs célulastrofoblásticas. Proteínasespecíficasnasuperfíciecelular,tambémdesempenhamimportantepapelna compactação,comoporexemplo,aglicopro- teínaadesivacaderina-E.A compactaçãopa- receiniciarporatividadedaproteínaquina- seC, modificandoalocalizaçãodacaderina- E.A reorganizaçãodocitoesqueletopodeser a causadamodificaçãonamembranacelu- larduranteacompactação.Asmicrovilosida- des,prolongadaspelaaçãodos microftla- mentos,aparecemsobreasuperfíciedacélu- laadjacenteeligamumacélulaaoutra.Essas microvilosidadespodemsero localdeação adesivadacaderina-E.O achatamentoentre osblastômeros,queocorreduranteacompac- ração,podeserinduzidopeloencurtamento damicrovilosidadeatravésdadespolimeriza- çãodaactina.Dessaforma,existeumacres- centeevidênciadequeacompactaçãoécau- sadapelasmudançasnaarquiteturada su- perfíciedos blastômeros.Porém,nãoestá bemclarocomooseventosestãocorrelacio- nadosou comoéo mecanismo'queintegra esseseventosquecausama compactação. A formaçãoda blastocele,cavidadedo blastocisto,éumaetapaqueaconteceapós a compactaçãodo embriãoqueé denomi- nadademórulacompacta.Paraa formação dablastoceleénecessáriohaveracúmulode fluidoquepassaatravésdascélulasdotrofo- blasto,nointeriordoembrião.O númerode célulasembrionáriasnomomentodaforma- çãodo blastocistovariaconsideravelmente entreas espécies.Geralmente,esselíquido começaa seacumularnosestádiosavança- dosdeclivagem,sendo32célulasno suíno, 64nobovinoeovinoe 128célulasnocoelho. Após a formaçãodo blastocistoocorresua expansãotantoemconseqüênciado contí- nuoacúmulodefluidoquantoemdecorrên- ciadedivisãocelular.É interessantesalien- tarqueduranteaexpansãodoblastocisto,a assincroniada divisãocelularaumentae acontecedeformamaislentaetambémque aproporçãodecélulasdoembrioblasto,em relaçãoaototaldecélulasdoblastocisto,di- minuicomaprogressãododesenvolvimento embrionário,apesardoíndicededivisãomi- tóticadoembrioblastosemantersemelhante aodotrofoblasto.Essaocorrênciaé,prova- velmente,emconseqüênciademortecelular no embrioblasto,causadapor um processo deapoptosemaisacentuadonoembrioblasto do queno trofoblasto. Desenvolvimentoe CultivoEmbrionárioin vitro Comojáfoiabordado,duranteoperíodo depré-implantaçãoembrionária,ocorremal- gunseventossignificativoscomoainiciação eacontinuaçãodaclivagem,ativaçãodoge- nomaembrionário,agregaçãoecompacta- çãodeblastômeros,diferenciaçãodotrofo- blastoeembrioblasto,formaçãoeexpansão dablastoceleerompimentodazonapelúcida. Essesfenômenosqueocorremduranteode- senvolvimentoembrionárioin vitropodem serafetadosporumavariedadedefatoresin- trínsecoseextrínsecoscomoíonsinorgâni- cos,tampões,composiçãodaatmosferaga- sosa,aminoácidos,pH, fatoresdecrescimen- to,luminosidade,vitaminasemacromolécu- Ias.Embriõesbovinosdeduascélulasprodu- zidosinvitrosãomaissensíveisàscondições decultivodoqueaquelesproduzidosinvivo. A ativaçãodogenomaembrionáriocoin- cidecomperíodocríticodecultivo,resultan- doembloqueiododesenvolvimentoemmui- tasespécies.Essebloqueioaparecenatrans- criçãodeficientedo genomaembrionárioe subseqüentesínteseprotéicarelacionadaàs condiçõesmetabólicas.Em bovinos,o blo- queioocorrenoestádiode8-16célulascau- sadopor cultivoinadequado.Issofoi o res- ponsávelpelagrandedificuldadenaobtenção in vitrodeembriõesbovinosnasdécadasde 60 e 70.Essadificuldadecontribuiuparao desenvolvimentode sistemasde cultivoin vivo,no qualos embriõesde2 ou 4 células produzidosin vitro,desenvolviam-seemovi- dutosatéo estádiodeblastocisto.AverilletaI. (1955)foramosprimeirosausaremessaal- ternativaparaultrapassarobloqueiocelular duranteo desenvolvimentoembrionárioin vitro,utilizandoembriõesovinostransferidos paraovidutodecoelha.Porém,essametodo- logiaépoucopráticaedealtocustoemcon- seqüênciadanecessidadedemanutençãode biotérioedosprocedimentoscirúrgicospara transferênciae retiradadosembriõesdare- ceptoratemporária.Porisso,métodosdecul- tivoforamaperfeiçoadosparapermitirode- senvolvimentoinvitro,utilizandooco-cultivo deembriõescomBOEC (célulasepiteliaisde ovidutosbovino),GC (célulasdagranulosa), vesículastrofoblásticas,célulasVERO (linha- genscelularesestabelecidasparacultivo), 209 célulasBRL (BuffaloRatLiverCells),células endometriaisouocultivoemmeiocondicio- nadoporváriostiposcelulares. O co-cultivocelularéefetivoetemsidoo métododeeleiçãoparaocultivodeembriões produzidosin vitroemestufascomatmosfe- rasemocontrolede°2' É importantesalien- tarquenessessistemasdeco-cultivo,osmeios utilizadosnãopodemserpobresemcompo- nentesporqueascélulassomáticas,apóso quartodiadecultivo,começama competir comosembriões.A contribuiçãodascélulas somáticasestánaproduçãodefatoresdecres- cimento(EGF,TGFaeTGF-~l) queestimu- Iamesãoimportantesparaodesenvolvimen- toembrionárioinvitroenaremoçãodoscom- ponentesinibitóriosdo ambientedecultivo, comoradicaislivres,metabólitosembrioná- riosecelulares,íonsdeamôniaeoutros.Blas- tocistosproduzidosemsistemasdeco-culti- vo podemapresentarmorfologianormale conternúmerodecélulassemelhanteao de blastocistosdesenvolvidosin vivo.As células epiteliaisdeovidutonãosãoespécie-especí- ficase nãodependemdapuberdadeparao suportedo desenvolvimentoembrionário. Existemmuitascontrovérsiasquantoaome- lhorsistemadeco-cultivoouquantoaotipo decélula.As célulasdelinhagensestabele- cidasfornecemmelhorcontrolesanitário, porém,apresentamcustomaiselevado.A opçãodo tipocelularparao co-cultivovai dependerdarotinaedadisponibilidadedo laboratório,nãoinfluenciandonodesenvol- vimentoembrionário. Atualmente,o co-cultivodos embriões com célulassomáticas,parao desenvolvi- mentoembrionárioprecoce,temsidosubs- tituídopelossistemasqueutilizam5%de°2' meiossimplescomoo CR-l, CR-2, SOF e KSOM acrescidosdeaminoácidosesemco- cultivocelular.Essessistemastêminúmeras vantagensemtermosdepraticidadeeecono- micidade,podendoserutilizadocommeios 210 quimicamentedefinidosoucomsorosangüí- neo.A tendênciaparao cultivoembrionário éautilizaçãodemeiosquimicamentedefini- dos,baseadosno conhecimentodasexigên- ciasmetabólicas,ambientaisenutricionaisdos embriões.Alémdisso,sistemasquepermitam alteraçõesdascaracterísticasfísicasequúnicas dosmeiosaolongodoprocessodecultivoten- demaresultaremíndicessuperioresevanta- gensemrelaçãoaossistemasestáticosutili- zadosatualmente. ~ Ambientepara o Cultivo Embrionário É necessário,nocultivoembrionário,o usodemeiosimplesquesuporteanutrição celulareo desenvolvimentodurantea fase depré-implantaçãoembrionária.A composi- çãodomeioébaseadanosfluidosdoútero edoovidutoduranteoiníciodagestação.O fluidodoovidutoécompostoporsecreções dascélulasepiteliais,a partirdadifusãode nutrientesdoplasma.O potássioe o cloro estãopresentesnofluidodeovidutoemcon- centraçõesmaiselevadasdoquenasdoplas- ma,enquantooníveldecálcioémaisbaixo eosdesódioemagnésiosãosimilaresaodo soro.Enzimascomoamilaseelactatodehi- drogenase,estãotambémpresentesem abundâncianofluidodooviduto,enzimases- sasquepodemconverteropiruvatoemgli- cose.Temsidodemonstradoqueopiruvato éumcomponenteessencialparaaclivagem edesenvolvimentoembrionário.Somentea partirdoestádiodemórula,embovinos,e daterceiradivisãocelular,emcamundongos, osembriõespodemutilizara glicosecomo fontedeenergiaemdecorrência,possivel- mente,dosistemaenzimático,necessáriopa- raasuautilização,nãoseencontrarcomple- tamentedesenvolvido.Durantea fasepro- gesterônicadocicloestral,teminícioo au- mentodaconcentraçãodebicarbonatoque continuaatéaovulação. Kim etaI. (1993)relataramqueoócitos bovinosmaturadosefecundadosinvjiropo- demdesenvolveratéblastocistoemmeios simples,quimicamentedefinidose livresde proteínas.Nessecaso,a adiçãodeaminoá- cidos,fosfatos,piruvatoelactatoéessencial. Coma adiçãodeaminoácidosno meiode cultivo,háincrementonaformaçãodeblas- tocistos.Os aminoácidosagemcomosubs- tratosenergéticos,reguladoresdepH, bem comoparticipamna sínteseprotéica.Em embriõesbovinosproduzidos in vitro, o metabolismoda glutaminaé relativamente altonoestádiode2-4 célulasediminuinos demórulaeblastocisto,provavelmentepeladegradaçãodeenzimasmaternas,RNAm ou ambos.A ausênciadeglutaminaeaminoá- cidosessenciaisinibeodesenvolvimentoaté blastocisto.O mecanismopeloqualagluta- minaatuano desenvolvimentodo embrião nãoestábemelucidado,porém,a glutami- napodeserdesaminadaeusadano ciclode Krebsou na formaçãode glucosamina-6- fosfato,umprecursordeglicoproteínas,gli- colipídioseoutroscomponentesnecessários paraa integridadecelular. A glicina,a alaninae a prolinaestãoem altasconcentraçõesnoovidutoemrelaçãoaos outrosaminoácidos.A glicinaealanina,quan- dousadasindependentes,atuamdiretamente noincrementododesenvolvimentoembrioná- riobovino.A utilizaçãodessesdoisaminoáci- dosdeformacombinada,napresençadecélu- Iasdooviduto,tambémfavoreceodesenvolvi- mentoembrionárioembovinos.Ascélulasdo ovidutopodemsecretarglicinaealaninaem baixasconcentraçõesno meiode cultivo,o queé benéficoparao desenvolvimentoem- brionário.A concentraçãodeglicinaaumenta entre48horase6 diasdecultivocelular,in- dicandoqueamonocamadadecélulasepite- liaisdeovidutosecretaglicinain vitro. O pH dassoluçõese do fluidocelularé críticoparaa eficiêncigdemuitoseventose reaçõesbioquímicasqueenvolvemo equilí- brioácido-base,bemcomoinfluênciasobre a produçãodeblastocistos,devendovariar ente7,3e7,5duranteamaturaçãodeoóci- tose o cultivoembrionário.O usodesiste- mastampõesemmeiosdecultivoéneces- sárioparaminimizarpossíveisflutuaçõesde pH emdecorrênciadasvariaçõesdopH do meiorefletiremnopH docitosoldooócitoe dascélulasembrionárias.Assim,havendova- riaçãodepH nomeiodecultivo,dependen- do da amplitude,a viabilidadecelularserá afetada,resultandoembaixosíndicesdefe- cundaçãoe deblastocistos. Os primeirostampõesestudadosforam misturasde saisinorgânicostamponados comgrandesquantidadesdefosfatoou bi- carbonatodesódio.Existemlimitaçõesem setrabalharcomsistematampãobicarbona- to/C02 porque,paramantero pH constan- te,hánecessidadedousodesistemafecha- do, equilibradopor níveisde CO2na fase gasosa.Casocontrário,aperdadeCO2pela soluçãopodelevaràprogressivae indesejá- velelevaçãodopH. Outroproblema,éque, geralmente,ostampõescausamefeitosbio- lógicos,comoestímulooudepressãodaati- vidadeenzimática,alémdepodereminter- ferir ou reagircom substratoscomoinibi- doresou cofatores.De formanãoespecífi- ca,ostampõespodemexercerefeitosdevido à suaforçaiônica,por isso,aconcentração do tampãodeveser a maisbaixapossível, desdequenãopercaacapacidadedemanter o pH. GoodetaI. (1966)desenvolveramoHE- PES, o qualnadamaisédoqueumtampão orgânicopara pesquisasbiológicas.Esse tampãoéutilizadoemmuitosprotocolosde PIV paramantero pH demaneiraeficiente e maisconstantedo quea utilizaçãoúnica debicarbonato.Houvetambémpreocupação paraqueo tampãotivessemáximasolubilida- deemágua,dificuldadeparapassaramem- 211 branacelular,nãoformassecomplexoscom substânciasbiológicas,fossedebaixatoxida- de,estávelenãoagissecomoinibidoremrea- çõesbioquímicas.Por essasqualidades,o HEPES temsidoo sistematampãoorgânico maisutilizadoparacultivodetecidosecélu- Iasanimais. Vitaminastêmsidoconsideradasimpor- tantesà obtençãode elevadosíndicesde desenvolvimentoembrionárioin vitro.Em meiodecultivoquimicamentedefinido,foi demonstradoqueas 11vitaminashidrosso- lúveiscontidasnomeioHam'sF1O(Biotina, Pantotenatodecálcio,Colinaclorídrica,Ino- sitol,Niacinamida,Ácidolipóico,Piridoxina, Riboflavina,Tiamina,ÁcidofólicoeVitamina B\) nãosãoessenciaisparaa formaçãode blastocistosdecoelhosinvitro,porém,incre- mentamconsideravelmenteo desenvolvi- mentoembrionárioesãofundamentaispara o crescimentoe expansãodosblastocistos. Embriõesdehamsterrequerema presença de aminoácidose vitaminaspresentesno meioHam'sF10paraprogredirematéoes- tádiodeblastocistoeclodido.Kane (1988) demonstrouemratosqueo inositol,piridoxi- na,riboflavinaeniacinamidasãoimportantes paraaproduçãodeblastocistosexpandidos, enquantoavitaminaB\2étóxicanaconcen- traçãoencontradanomeioHam'sF10.Kane & Bavister(1988)avaliarama importância decadavitaminapresentenessemeiosobre o desenvolvimentodeembriõesdehamster de8célulasatéaeclosãoedeterminaramque somenteo inositol,o pantotenatoeacolina sãoimportantesparaqueoembriãoalcance esseestádiode desenvolvimento.O ácido fólicoéessencialparao desenvolvimentode embriõesdecamundongos,todavia,suasu- plementaçãono meiodecultivoparecedis- pensávelatéo estádiode blastocisto,visto queasconcentraçõesendógenas,na forma defolatoreduzido,supremasnecessidades dasprimeirasdivisõescelulares.Takahashi& 212 First (1992),bemcomoRosenkrans& FirstI (1994)nãoencontraramnenhumefeitobe- néficodasvitaminasdomeiomínimoessen- cial Eagle's - MEM (Ácido patotênico-D, Colinaclorídrica,Inositol-mio,Niacinami- da, Piridoxal,Riboflavina,Tiamina,Ácido fólico) sobreo desenvolvimentodezigotos bovinosinvitro,portanto,contrárioaosacha- dosdos trabalhosefetuadoscom roedores. Embovinos,Montagner(1999)demonstrou queapresençadoretinolnomeiodecultivo, contendocélulasepiteliaisdeovidutobovino, incrementasignificativamenteo desenvolvi- mentodeembriõesin vitroatéo estádiode blastocisto,sendoqueamelhorconcentração foi de0,28Jlg/rnl e a de 1Jlg/rnl foi a que proporcionoumarcadoefeitotóxico. Em ovinos,poucoseconhecea respeito do papelqueasvitaminasexercemsobreo desenvolvimentoembrionário.Entretanto, foidemonstradoquevitaminasdoMEM não afetamo desenvolvimentode blastocisto (GardneretaI.,1994).A morfologiaeo nú- merodecélulasdosblastocistosnãosãoafeta- dos,noentanto,ousodessasvitaminasinduz um aumentodo metabolismoembrionário, caracterizando-sepelamaiorentradadeglico- seemaiorproduçãodelactatonascélulas. Outrocomponenteutilizadonosmeiosde desenvolvimentoembrionárioéosorosanguí- neo.Diversostiposdesorotêmsidoutilizados naproporçãode10%a20%dovolumetotal domeiodecultivoembrioNário.Em relação a espéciedo embriãopodemser'homólogo (mesmaespéciedo embrião)ou heterólogo (espéciediferentedo embrião).De acordo comaidadeouacondiçãodoanimal,doqual éobtidoosoro,temsidoutilizadosorodema- cho castradoou inteiro,sorodefêmeaem estro,sorodeanimalpré-púbereousorofetal. Em bovinos,os sorosmaisutilizadosnos meiosdecultivosãoodevacaemestro(SVE) eo fetalbovino(SFB). Os sorosheterólogos têmavantagemdediminuira possibilidade decontaminaçãopordoençasinfecto-cop.ta- giosasespecíficasdecadaespécie.O soroé altamentecomplexo,constituindo-sedacom- binaçãode componentes,incluindo,entre outros,proteínas,ácidosgraxos,glicídios,vi- taminas,hormôniosefatoresdecrescimento. É difícildeterminarquaisassubstânciaspre- sentesnosoroquesãonecessáriasparaode- senvolvimentodoembrião,asquecausamde- trimentodedesenvolvimento,asquesãodes- necessáriasporseremsecretadaspelopróprio embriãoeasnecessáriasàscélulassomáticas doco-cultivo.Os índicesdedesenvolvimento embrionáriosãoincrementadoscomaadição desorodevacaemestrodevidoaestimulação daproduçãodefatoresembriotróficospelas célulasepiteliaisdoco-cultivo(Wiemeretal., 1991).Todavia,o sorotemsidorelacionado comproblemasfuturosde desenvolvimento fetal(videEficáciadaMetodologiadePIV). Paraevitaros problemascausadospela presençadosoronosmeiosdecultivoepara estudaros requerimentosemecanismosre- guladoresdo desenvolvimentoembrionário, meiosdefinidostêmsidodesenvolvidos,uti- lizandomacromoléculascomoopolivinilpir- rolidona(PVP) eo álcoolpolivinílico(PVA). Nessescasos,oco-cultivonãoéutilizadocom célulassomáticas,sendonecessárioatmosfe- ragasosacontendoemtornode5%deO2.A misturagasosamaisutilizadaemmeiosdefi- nidossemsoroeS"emcélulassomáticasé5% deCO2,5%de O2e90%deN2. Existegrandevariedadedemeiosdecul- tivocelularquesuportamo desenvolvimen- toembrionárioinvitro,podendoserclassifi- cadosemmeiossimplesecomplexos.Entre osdiversosmeiossimples,podemserdesta- cadosoKSOM eo SOF edentreoscomple- xos, o TCM 199.OKSOM (videfórmula no tópico:preparaçãodosmeiosparaPIV) éummeioSOM (SimplexOptimizationMe- dium;ErbachetaI.,-1994)modificadocom aumentodasconcentraçõesdeNa+(25mM) eK+ (2,5mM) e suplementadocom soro. Essemeiotemfornecidoresultadossatisfató- riosemrelaçãoàqualidadedecompactação, índicededesenvolvimentoembrionário,qua- 1idadedo blastocistoe divisãodascélulas trofoblásticas. Além dessesaspectosrelacionadosao meiodecultivo,arelaçãoentreonúmerode embriõeseovolumedemeioéumfatorre- levantenaeficáciadodesenvolvimentoem- brionárioin vitro.Embriõesbovinossinteti- zamfatoresde crescimentodurantea fase depré-implantaçãoquesuportamo desen- volvimentodeoutrosembriõesco-cultivados. KeeferetaI. (1994)observaramexistirne- cessidadedainteraçãoentreosembriões,du- ranteocultivoinvitro,paraquesejamprodu- zidosfatoresdecrescimento.O fatordecres- cimentoepidermal(EGF), o fatordecresci- mentotansformador(TGF)-a e o TGF-~1 aumentamaproporçãodedesenvolvimento embrionáriodeduascélulasatéblastocisto e o EGF aumentao númerodecélulasem blastocistos.Alémdisso,o embriãocultiva- doisoladamenteemvolumesacimade50/lI desenvolve-senormalmentesomentenapre- sençadessesfatoresdecrescimento.No en- tanto,grandeaumentodo númerodeem- briõesemrelaçãoaovolumedemeiotambém não é recomendadoem conseqüênciade substânciasdometabolismocelular,dosem- briõesedascélulasdo co-cultivo,poderem inibir o desenvolvimentoembrionário.Por isso,o númerodeembriõespor unidadede volumedemeiodecultivotemsidosugerido comopontocrucialnaeficiênciadosistema dedesenvolvimentoembrionárioin vitro. ... AvaliaçãodoSistemadeDesenvolvimento Embrionárioin vitro A ativaçãopartenogenéticadevesercon- sideradana avaliaçãoda eficáciada PIY. Oócitosbovinosnãofecundadospodemser ativadoseiniciaremadivisãocelular,porém, 213 essesoócitosproduzembaixosíndicesde blastocistos.Porisso,éinteressantequecada laboratóriotenhaconhecimentodos seus índicesdepartenogênese,quedevemvariar, nomáximo,entre1%e5%.Paraesseíndice serdeterminado,énecessárioterumgrupo deoócitosquesejamaturadoe inseminado concomitantementecomodosexperimentos oudarotinado laboratório.Os espermato- zóidessãomortoscom águatridestiladae submetidosàcentrifugaçãocomvelocidade de700a 900xg durante10a 30 minutos. Posteriormente,o sobrenadanteé retiradoe, apósseradicionadomeioaopelletresultante da centrifugação,novacentrifugação,com igualperíodoevelocidade,érealizada,salien- tando-sequeesteprocedimentoérepetidopor maisduasvezes.Apósaúltimacentrifugação, os espermatozóidessãosuspensosemmeio naconcentraçãoadequadaparafecundação (videprotocoloparaPIV embovinos),sendo entãorealizadaa inseminaçãodosoócitos previamentematurados.Finalmente,o índi- cedepartenogêneseé determinadoa partir da porcentagemdeoócitosclivadosapósa inseminaçãocomespermatozóidesmortos. Paraa avaliaçãoda PIV, algunsgrupos usam,comocritério,o estádiode2-4 célu- las,todavia,amaioriadoslaboratóriosutiliza aproduçãodemórulaseblastocistos,consi- derandoosíndicesdeproduçãoequalidade embrionária,ressaltando-sequeo índicede blastocistoexpandidoéoparâmetromaisfi- dedignodaeficáciadetodooprocessodePIV. É importanteaindaressaltarqueaavaliação daqualidadeembrionáriadeembriõespro- venientesdaPIV segueos mesmosparâme- trosdaquelautilizadaparaembriõesprodu- zidosinvivo.No entanto,oembriãoproduzi- do in vitroapresentaalgumascaracterísticas morfológicaspeculiares.Porexemplo,móru- Iasproduzidasin vivoocupamemtornode 60-70%do espaçoperivitelino,enquanto aquelasproduzidasinvitroocupamatotalida- 214 dedesseespaço.Os embriõesproduzidosin vitroapresentamblastômerosmaisescurosdo queosproduzidosinvivo,demonstandouma maiorquantidadede lipídeos.Em bovinos, parafrnspráticos,aobtençãodeblastocistos após8diasdainseminaçãoindicaviabilidade embrionária.Entretanto,parasedeterminar a realeficiênciadaPIV, é necessárioqueos embriõesresultememgestaçõesenascimen- tosnormais. Produçãode Embriõesin vitro a Partir da Punção Folicularin vivo Guiada por Ultra-som(PF/PIV) Em 1988,foidescritapelaprimeiravez atécnicadepunçãofolicular(PF)paraco- lheitadeoócitosbovinos,porviatransva- ginal,guiadapelaultra-sonografia(Pieterse & Kappen,1988).Atualmente,váriosgru- posvêmutilizando,comsucesso,osprincí- piosbásicosdessametodologiaparaprodu- çãoinvitrodeembriõesempesquisasouem programascomerciais.Namultiplicaçãode fêmeasdeelevadovalorzootécnico,essatéc- nicapodeatingirproduçãomédiade25pro- dutosdeumaúnicafêmeanoperíododeum ano,fatoquesuperasignificativamenteos índicesdaTE. A PF podeserrealizadaem duasseçõessemanaisporalgunsmesessem prejudicaro futurodesempenhoreproduti- vo doanimal.Essatécnicapermitea re- cuperaçãodeoócitosde,aproximadamente, 60%dosfolículospuncionados,obtendo-se, decadavaca,amédiade14oócitos,2em- briõese 1gestaçãoporsemana. ParaserealizaraPF,utiliza-seumasonda ultra-sonográfica,viavaginal,demaneiraa obterimagemdoovárioedosfolículos.Os oócitossãoaspiradospelapunçãodosfolí- culoscomagulhadelúmensimplesconecta- daaotubooufiltrodecolheitaporumtubo deteflonousilicone.O sistemadepunção podeserusadocomagulhalongadelúmen duplo,sendoque,nessecaso,alavagemdo folículoaspiradoé realizadaempregan~oa bombadevácuo.Os oócitossãoavaliadose submetidosàmaturação,fecundaçãoecul- tivoembrionárioatéoestádiodeblastocisto (dia7-9 apósa inseminaçãoin vitro),está- diodedesenvolvimentomaisadequadopara queos embriõessejamtransferidosparaas receptorasou submetidosà congelação. A PF/PIV apresentaalgumasdesvanta- gensrelacionadascom exigênciade uma equipedetrabalhoaltamenteespecializada, equipamentosdeelevadocustoecomotem- ponecessárioparaodesenvolvimentodatéc- nica,limitandosuaampladifusãoparatraba- lhosacampo.Alémdessesaspectos,outros problemascomobaixoíndicedeprodução in vitrodeembriões,baixaqualidadeecon- gelabilidadedessasestruturasdecorrentesda PIV,anormalidadesfetaiscomconseqüentes problemasdedistociatambémtêmcorrobo- radoparalimitaçãodeumamaiorutilização dessatécnica.Emalgunspaíses,comoFran- ça,EstadosUnidoseAlemanha,existemcen- trosdePIV querecebemoócitosdepunção foliculardelocaisdistantes.Essetipodepro- cedimentoé umaótimaopçãoparadistri- buiçãodosbenefíciosdessatecnologia,en- tretanto,<?temporestritodetransporte,du- ranteo qualooócitopermaneceviáveldesde apunçãofolicularatéo localdaPIV,tem-se apresentadocomooutrofator limitantede expansãodaPE Atualmente,épossívelreali- zaro transportedosoócitosporumperíodo deaproximadamente10a 12horas,porém, o desenvolvimentode uma técnicaviável depreservaçãodeoócitosimaturos,comto- dasassuasvantagensintrínsecas,permitirá maiordifusãodessabiotecnologia. Eficáciada Metodologia de PIV NosprotocolosatuaisdePIV,osíndices dematuração,fecundaçãoe clivagemsão similaresaosdoprocessoin vivo. No entan- to,asporcentagensdeblastocistosãosigni- ficativamenteinferioresnosprocessosin vitro.Aproximadamente30%dosoócitosque sãosubmetidosaoprocessodematuração in vitroalcançamo estádiodeblastocisto, havendooscilaçõesdessesresultados,varian- doentre5e60%.Essasvariaçõestêminú- merascausasquepodemestarrelacionadas como sêmene suacapacidadederespon- dera capacitaçãocomheparina,qualidade ecapacitaçãodooócito,habilidadedotéc- nico,qualidadedosprodutosempregados nosmeiosdecultivo,precisãodosequipa- mentos,entreoutros.Comoéumprocesso extremamentecomplexo,osresultadossão geralmentecíclicose osproblemassãode difícilidentificação.Emgrandeparte,essas variaçõessãodevidasàexistênciadediferen- çanopotencialdosoócitosemproduzirblas- tocistos,apesardeapresentarem-semorfo- logicamentenormais. OsembriõesdecorrentesdePIVapresen- tammenorviabilidade,assimcomoíndices inferioresdegestaçãoapósatransferência, tantoafresco(54%)quantocomembriões congelados(30%),emcomparaçãocomos produzidosinvivo(frescos=76%oucon- gelados=67%).Alémdeapresentarem maiortaxademortalidadeembrionária,os embriõesPIV resultamemmaioresperdas perinatais(15%)doqueaTE (9%)eem1% dasgestaçõesoriundasdeembriõesPIV ocorrehidroalantóide.Essaincidênciaémui- tomaiordoquearelaçãodeumcasopara cada7.500gestaçõesnormais.OsfetosPIV apresentammaiorcrescimentoeresultamem maiorpesoaonasceremaiorincidênciadedistocia,sendoautilizaçãodesoronosmeios decultivoresponsabilizadaporessasanor- malidadesfetais. É importanteressaltarqueasmórulas PIV,emgrandeproporção,nãosecompac- tameapresentammenosestruturasdeliga- 215 çõesentreosblastômerosdoqueasmóru- Iasproduzidasinvivo.Amembranadosblas- tômerosémenoselásticaeablastocelemui- tasvezesseformaemváriospontosdoem- brião.Os embriõesPIV atingemo estádio deblastocistomaisrápidodoqueosem- briõesproduzidosinvivo.Essaslimitações, diferençaseproblemasestãoassociadosaos processosenvolvidoscoma PIV,portanto, hánecessidadedeampliaro conhecimento paraotimizarautilizaçãodaPIV. EstruturaNecessáriapara Realizaçãoda PIV A estruturaçãodo laboratóriodePIV, talvezsejaopontomaisdifícileimportante nosentidodeeficiência,economia,pratici- dade,comodidadee controledequalidade dosfuturostrabalhos.Portanto,antesde montara estruturadolaboratório,deve-se realizarumprojetocuidadosoeminucioso, observandoe avaliandotodososdetalhes envolvidosnatécnica.Paraa realizaçãoda PIV,o idealéquesedestineumlocalespe- cialsomenteparaessafinalidade.Geralmen- te,laboratóriosdedicadosaoutrostrabalhos compartilhamespaçoe equipamentosda PIV,influenciandonegativamenteosresul- tados.O laboratóriodeveterespaçoffsico suficienteparasepararapartedeprepara- çãodosmeios,dosêmen,limpezaeesterili- zaçãodomaterial,daoutradestinadaparaa manipulaçãoe cultivodosgametase em- briões.Olaboratóriodecultivodeveteruma temperaturamínimade25°C.Oacessodeve serrestritoaopessoalenvolvidocomo tra- balhodePIV e serrigorosocomhigienee assepsia,valendo-sedesistemasdepurifi- cadoresdeare luzultravioleta. É recomendávelquea colheitadeoóci- tosapartirdeováriosdematadouronãoseja realizadanolaboratóriodemanipulaçãoe cultivodosgametaseembriõesparapreve- nir contaminações.O laboratóriodePIV 216 comercialdeveserbemseparadodoscur- raisdasdoadorasedasreceptorasetambém teracessocontroladodepessoal,bemcomo dispensarcuidadoespecialcomasmedidas profUáticasparaevitarcontaminação. A estufadecultivoou incubadoradeve tercontroleautomáticodaatmosferaeca- pacidadedemantertemperaturaconstante, o quegeralmenteé obtidoemestufascom jaquetasdeágua.Asestufasutilizadaspara maturaçãodosoócitose desenvolvimento embrionárioemmonocamadadecélulas somáticasdevemterno mínimocontrole automáticodeCO2.Nos laboratóriosque utilizamsistemasdedesenvolvimentoembri- onáriosemo co-cultivodecélulassomáti- cas,é necessárioumaestufacomcontrole simultâneodeCO2,°2eN2(Figura10.10). - ~"~:~ .'.'~ - j . -- ."" . ,t~, "t~ _.~ "' Figura10.10.Estufaparamaturaçãodeoócitos,fecun- daçãoe desenvolvimentoembrionário.A estufada esquerdaé parautilizaçãoem atmosferacomCO2 emar e a da direita comCO2, °2 e N2. No entanto,o custoparagaseificaçãocom os trêsgases,CO2, °2 e N2,é elevadoem conseqüênciadoconsumoepreçodoN2.Por isso, uma alternativatem sido cultivaros embriõesno interiordedessecadoresgasei- ficadoscomostrêsgasesmisturadosprevia- menteempercentagenspredeterminadase umidadesaturada(Figura10.11).Em qual- I Figura10.11. Estufacomcontrolede CO2emar,sendo utilizadaparadesenvolvimentoembrionário em atmosferacom CO2, °2 e N2 em des- secador Note que o gás é aquecido por sua passagem por umfrasco com água. queruma'dasopçõesdetrabalho,nãoháne- cessidadedaaquisiçãodeestufasdegrande porteporqueaPIV podeserrealizadadefor- maadequadaemestufasdemédioporte.A aberturafreqüentedaportadaestufaresulta emmudançasdrásticasnatemperaturaena pressãodosgases,sendoqueasestufasde grandecapacidade,comumasóporta,pos- suemmaiordificuldadedemantera tempe- ratura,umidadee a misturadegasesade- quadano seuinterior.A aberturadaestufa deveserminimizadaparanãocomprometer osprocessosdematuraçãodosoócitosede desenvolvimentodasestruturasembrioná- rias.Algunslaboratóriosorganizamescalade rotinaparaqueasestufassejamabertasem horáriossincronizados.O cultivoemdesse- cadorestambémtemsidoumaalternativapa- racultivargametaseembriõesemlaborató- rioscomrotinaqueexigeaberturasfreqüen- tesdaportadaestufa. O sistemadepurificaçãodeáguaé um fatorfundamentalparaos índicesfinaisda PIV, tendo emvistaque a qualidadedos meiosdecultivodependedaqualidadedos saise,principalmente,daágua.O aparelho purificadordeveserde boaqualidade,ser mantidobemconservadoeterseuftltrosubs- tituídodeformarigorosamenteperiódica,sa- lientando-sequeaáguautilizadanaPIV deve estarausentedemicroorganismos,piróge- nose outrassubstânciastóxicas.Parao la- boratórioquenãopossuiinfra-estruturade purificaçãodaágua,acompradeáguapura podeserumaopção. Os estereomicroscópiosdevemserdeboa qualidadee possuirdiferentesaumentos, sendoqueoaumentomáximodeveserigual oumaiorque80vezes.Esseaumentomáxi- mo deveestarrelacionadocomacapacida- dedaobjetivaenãodo aumentodaocular, casocontrárionãosetemmaiorresolução. Por isso,o idealé utilizarocularesde 10 vezes.Deve-seusaraluzfriaetrabalharcom poucaintensidade,poisassimnãoaquecea basedalupaeminimizaos efeitosdeletérios daluzsobreosembriões.Na PIV,o estereo- microscópioé fundamentalenecessárioem todasas etapasdasmanipulaçõese avalia- çõesdosoócitosedosembriões,devendoser colocadosobresuperfíciefirmee emlocal confortávelquefacilitea manipulaçãodos gametase embriões. O microscópioinvertidoé fundamental paramanipulaçõesquenecessitemmaiores aumentose o microscópioequipadocom contrastedefaseémuitoútilparaostraba- lhoscomsêmen,oócitoseembriões,permi- tindo estimara viabilidadeespermática,a maturaçãonucleareafecundaçãodosoóci- 217
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